정향과 마가목 복합물의 in vitro와 in vivo 항비만 효과 연구

- 대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실.
- Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, Daegu 42158, Republic of Korea.
Correspondence to Mi-Rae Shin. Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, 136 Sincheondong-ro, Daegu 42158, Republic of Korea. Tel: +82-53-770-2258, Email: with750@naver.com

Received March 05, 2024; Revised April 18, 2024; Accepted April 22, 2024.

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Purpose

This study investigated the anti-obesity effects of a combination of Syzygium aromaticum L. and Sorbus commixta Hedl. (SS) in vitro and in vivo.

Methods

The extracts of Syzygium aromaticum extract (SA) and Sorbus commixta extract (SC) were prepared individually using distilled water. They were mixed in a 1:2 ratio for use in the experiment. To assess the anti-obesity potential of SS in vitro, we examined cell proliferation, cellular triglyceride (TG), and total cholesterol (TC) levels, as well as lipogenesis and β-oxidation in 3T3-L1 cells. To confirm its anti-obesity potential in vivo, C57BL/6J mice were fed a 60% high-fat diet (HFD) to induce obesity. SA alone, SC alone, and their combination compound, SS (at a dosage of 200 mg/kg) were orally administered for 6 weeks. Thereafter, to conduct a comparative evaluation, serum analysis, western blotting of liver tissues, and histopathological analysis were performed.

Results

Both SS200 and SS400 significantly inhibited the cellular TG and TC contents in the 3T3-L1 cells. Furthermore, treatment of the cells with SS (at a dose 200 and 400 μg/mL) also led to a noticeable regulation of key lipogenic and β-oxidation factors. Treatment of obese mice with SS resulted in a greater reduction in serum leptin and TG levels compared to treatment with the individual compounds (SA and SC). Furthermore, activation of AMP-activated protein kinase α by SS treatment resulted in the suppression of sterol regulatory element-binding proteins (SREBP)-1, leading to the inhibition of acetyl-CoA carboxylase (ACC) expression.

Conclusion

Our results suggest that SS may have the potential to prevent obesity through a reduction in the TG and TC levels and regulation of lipogenesis and β-oxidation.

Keywords

obesity; body weight; lipids; leptin; lipogenesis

서론

비만 (obesity)은 만성질환의 주요 원인 중 하나로 비만 유병률이 매년마다 지속적으로 증가하고 있어 심각한 사회 문제로 대두되고 있다. 비만은 과다한 에너지 섭취와 소비 간의 불균형으로 인해 지방 조직에서 발생하며, 대사 질환인 고혈압, 제2형 당뇨병, 고지혈증 및 동맥 경화를 유발할 수 있다 [1, 2]. 과도한 지방 축적은 지질 대사 (lipid metabolism) 과정 중 지질 합성과 분해 과정의 불균형으로 발생한다고 할 수 있다 [3]. 지질 합성은 지질 합성을 조절하는 대표적인 유전자인 sterol regulatory element-binding protein 1a (SREBP1a)와 SREBP1c가 세포내에서 활성형으로 변환이 되면 지질 합성 유전자의 발현을 촉진하게 된다. 지방산 합성 효소 (fatty acid synthase, FAS)는 지방산을 생성에 관여하고, diacylglycerol O-acyltransferase (DGAT) 1과 2는 triglyceride (TG) 형성의 마지막 단계에 직접적으로 작용하는 효소이다 [4, 5]. 또한, peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ)는 세포내에서 지방산과 관련된 유전자의 발현을 조절하고, 지방 대사 및 에너지 균형을 조절하는 역할을 수행하기에 대사질환 관련 예방과 치료에 있어서 중요한 수용체이다 [6, 7]. 한편, AMP-activated protein kinase (AMPK)는 세포의 에너지 균형 및 지방 대사의 조절자로 작용하여 지방 조직에서 AMPK가 활성화되면 지질 분해와 증가한 지방산 산화가 동시에 일어난다. 이전 연구에서는 AMPK가 acetyl-CoA carboxylase (ACC)를 비활성화하고, 지방 합성을 감소시킨다고 보고하였다. 이는, malonyl-CoA의 농도 감소로 이어지고, carnitine palmitoyl-transferase I (CPT1)의 억제를 약화시켜 미토콘드리아로 지방산의 흡입이 촉진되어 지방산 산화 (β-oxidation)가 일어나게 된다 [8, 9].

한의학적으로 비만은 주로 비 (脾), 폐 (肺), 신 (腎)의 장부와 밀접한 관계가 있으며, 가장 대표적인 원인은 비감후미 (肥甘厚味), 즉 고칼로리나 고지방식을 과다하게 섭취한 것으로, 이러한 음식들은 소화기관의 소화 기능에 영향을 미쳐 담 (痰), 습 (濕), 열 (熱) 등을 쉽게 유발하고, 이러한 습담 (濕痰)이 체내에 축적되면 생체에너지 대사의 저하를 가져와 비만을 야기한다 [10, 11]. 주요 항비만 기전에는 식욕 억제, 지방 생성 억제, 영양소 흡수 감소, 지질 대사 조절, 에너지 소비 증가, 장내 미생물 조절, 비만 관련 염증 개선이 포함된다. 전통적인 한의학에서는 한약재와 처방이 사용되지만, 그 효과에 대한 기전 연구는 부족한 실정이다.

정향 (Syzygium aromaticum L.)은 향기로운 약용 식물로, 말린 꽃 봉오리는 열대 및 아열대 국가에서는 방향족 식물로 널리 재배되어 에션설 오일로 제품화되어 널리 이용되고 있으며 [12, 13], 동아시아에서는 음식의 향신료뿐만 아니라 전통적으로 치과 치료와 같은 의약품으로도 응용되었다. 또한, 정향은 항균, 항바이러스 및 항진균 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 항산화제, 항염증제와 같은 다양한 기타 약리학적 특성 및 항종양 효과도 보고되어 있다 [14, 15]. 마가목 (Sorbus commixta Hedl.)은 장미과에 속하는 일본, 러시아 극동 및 한국이 원산지인 낙엽교목이다. 마가목의 피질과 껍질은 한의학에서 천식, 기관지염, 위염, 부종 등 다양한 질병의 치료에 사용되어 왔다 [16, 17]. 이전의 연구에서는 마가목 메탄올추출물이 항동맥경화 효과와 간 보호 활성을 가지고 있음을 입증하였다 [18, 19].

하지만 아직 정향과 마가목 복합물의 지질 합성 억제 및 지방산 산화와 같은 비만에 미치는 영향에 대한 연구가 미흡하다. 따라서, 정향과 마가목 복합물의 in vitro와 in vivo 실험을 통해 항비만 효과를 확인하였기에 보고하는 바이다.

연구방법

시료

본 실험에서 사용한 건조된 정향과 마가목 열매는 옹기한약국 (Daegu, Korea)에서 구입하였으며, 생약규격집에 적합한 것을 사용하였다. 정향과 마가목 각각 200 g에 증류수 2,000 mL을 첨가한 후 열탕 추출기를 사용하여 2시간 동안 각각 추출하였다. 얻어진 추출물은 감압 농축장치로 농축 후, 동결 건조기를 이용해 최종적으로 분말 (정향, 수율 6.8%; 마가목, 수율 19.9%)을 얻었으며, 정향과 마가목 복합물 (Syzygium aromaticum L. and Sorbus commixta Hedl., SS)의 비율은 1:2로 하여 실험 직전에 혼합하여 사용하였다.

시약

세포분화를 위한 3-isobutyl-1-mrthylxanthine (IBMX, Ct. No. 2845; TOCRIS, Minneapolis, MN, USA), dimethyl sulfoxide와 dexamethasone (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), insulin (I4500-025; GenDEPOT, Katy, TX, USA)을 구입하였다. SREBP-1 (SC-13551)와 β-ACTIN (SC-47778)은 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였고, TATA box-binding protein (#44059), AMPKα (#2532), phospho-AMP-activated protein kinase α (p-AMPKα, #2531) 및 ACC (#3662)는 Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. 2차 항체는 GeneTex, Inc. (Irvine, CA, USA)에서 구입하였다 (horseradish peroxidase [HRP]-conjugated anti-mouse IgG, GTX213111-01; HRP-conjugated anti-rabbit IgG, GTX213110-01). 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. Nitrocellulose membranes와 enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting detection reagents는 Amersham GE Healthcare (Buckinghamshire, UK)에서 구입하였다.

In vitro 항산화 활성 측정

SS의 total polyphenol 함량, total flavonoid 함량, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical 소거능 및 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical 소거능은 기존에 측정한 프로토콜에 따라 수행하였다 [20].

세포배양 및 세포증식 측정

3T3-L1 세포는 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea)에서 구입되었고, 10% (v/v) fetal calf serum (FCS) 및 100 U/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin이 추가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Hyclone, Waltham, MA, USA)에서 유지되었다. 6-well plate에 세포를 5 × 10⁵ cells/well로 분주하고, 2–3일 간격으로 배지를 교체하였다. 세포는 배지 교환 시점에 insulin (10 μg/mL), 1 μM dexamethasone 및 0.5 mM IBMX가 포함된 DMEM에서 배양되었다. 3일째에 배지는 10% (v/v) FCS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 그리고 단독으로 insulin (10 μg/mL)을 포함하는 DMEM으로 교체되고, 추가 3일 동안 배양되었다. 3T3-L1 세포를 완전히 활성화시킨 후에 3 × 10³개의 세포를 96-well microplate 분주하고, 37°C 및 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그런 다음, 다양한 농도의 SS로 처리한 후, 세포에 bovine serum albumin 또는 free fatty acid (FFA, oleic acid 및 palmitic acid을 3:1의 비율로 혼합한 자유 지방산)를 250 μM 농도로 추가하고, 이를 48시간 동안 유지 후 세포증식을 측정하였다. 세포증식 실험에서는 WST-1 Kit (No. 10008883; Cayman CHEMIC, Ann Abor, MI, USA)를 사용하였고, 최종 optical density값은 Normal군으로 정규화하여 표시되었다.

세포 내 TG와 total cholesterol (TC) 함량 측정

세포 내 TG와 TC를 측정하기 위해 6-well plate에 2 × 10⁵ cells/well으로 분주하고, 하룻밤 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 그런 다음, SS로 6시간 전처리 한 후 FFA를 250 μM 농도로 처리하였다. FFA 처리한 세포는 PBS (pH 7.3, 10 mM)로 두 번 세척되었고, 1.5 mL 튜브에 수거 후 5,000 × g에서 15분 동안 상온에서 원심 분리하였다. 상등액을 제거한 다음 남은 세포를 수집하였으며, 지질은 지질 추출 용액 (클로로포름 3:메탄올 1)을 사용하여 추출하였다. 세포 내 TG와 TC 수준은 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입한 EEA028 (TG Kit)와 EEA026 (TC Kit)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 맞게 측정하였다.

Real-time polymerase chain reaction (PCR)을 통한 유전자 분석

mRNA는 TRIZOL (T9424; Sigma-Aldrich)을 사용하여 분리되었다. mRNA 분리 후에 SuperScript™ One-Cycle cDNA Kit (CAT. A10752030; Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 cDNA를 합성했으며, 이어서 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR)이 진행되었다. Real-time PCR에서 원하는 유전자의 전사 수준은 Power SYBR Green Master Mix (#4368814; Applied Biosystems™, Waltham, MA, USA)를 사용하여 Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)로 정량되었다. PCR 반응은 uracil-DNA glycosylase 활성화를 위해 50°C에서 2분, DNA polymerase를 위해 95°C에서 2분, 그리고 증폭 단계에서 40회 주기 (95°C에서 15초, 60°C에서 15초, 72°C에서 15초)로 수행하였다. 상대적 mRNA 수준을 계산하기 위해 내부 기준으로 Ppia의 수준에 정규화되었다. 사용된 primer 서열은 Table 1에 나열하였다.

Table 1
Primer list for real-time polymerase chain reaction

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실험 동물

본 실험에서는 생후 4주령 웅성 C57BL/6J mice를 DBL (Eumseong, Korea)에서 구매하였다. 물과 고형사료 (Zeigler Bros, Inc., Gardners, PA, USA)를 충분히 공급하며 동물 사육실의 conventional system (온도 22 ± 2°C, 습도 50 ± 5%, 명암주기 12시간)에 1주일 동안 적응시켰다. 정상군 (Normal)은 일반 고형사료를 공급하였고, 대조군과 약물 투여군은 매일 60% high-fat diet (HFD, D12492; Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, USA)를 새로 공급하였다. 약물 투여군은 정향 열수추출물 투여군 (Syzygium aromaticum extract, SA; SA200), 마가목 열수추출물 투여군 (Sorbus commixta extract, SC; SC200), 및 정향과 마가목 복합물 투여군 (SS200)으로 나누었으며, 각 약물은 200 mg/kg의 농도로 존대를 이용하여 6주 동안 경구투여 하였다. 실험동물의 체중은 전자체중계를 이용하여 2일에 한 번 동일 조건에서 측정하였고, 약물투여는 매일 일정한 시간에 시행하였다. 실험은 대구한의대학교 동물실험 윤리위원회 승인 (승인번호 DHU 2023-27)을 받아 동물관리 규정을 준수하여 실험을 진행하였다.

혈액 분석

실험종료 당일 isoflurane (Isotroy)을 사용하여 흡입마취 후 심장 천자로 혈액을 채취하여 4°C에서 1,508 × g으로 10분간 원심분리 후 혈청을 얻었다. 혈청 내 간 기능관련 바이오마커인 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT)와 glutamic pyruvic transaminase (GPT) 그리고 비만 관련 바이오마커인 TG와 TC는 assay kit (Asan pharmaceutical Co., Ltd, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. 또한, leptin 호르몬 함량을 측정하기 위해서 Merck (Rahway, NJ, USA)의 Leptin ELISA Kit를 구입하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.

Western blotting

단백질 분리는 이전의 연구에서 사용한 방법대로 수행하였다 [21]. 10–12 μg의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel에 전기영동시켰으며, 이를 nitrocellulose membrane으로 단백질을 이동시켰다. 그 다음, 4°C의 조건에서 membrane에 각각의 1차 항체 (phosphate-buffered saline with Tween 20 [PBS-T]로 1:1,000 희석)를 overnight한 다음 PBS-T로 세척하고, 1차 항체에 맞는 각각의 2차 항체 (PBS-T로 1:3,000 희석)를 사용하여 실온에서 2시간 반응시킨 후, PBS-T로 세척하였다. 마지막으로 ECL 용액을 묻혀 Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd., Bucheon, Korea)로 웨스턴블랏의 밴드를 촬영한 후, ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 사용하여 분석되었다.

조직병리학적 분석

적출한 간과 부고환주위지방 조직은 10% 포르말린 용액으로 고정시킨 후 70% 알코올, 95% 알코올, 100% 알코올을 순서대로 사용해 탈수시키고, 파라핀으로 고정시켰다. 고정된 조직을 microtome를 사용해 2 μm 두께로 절단한 후 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 시행하였다. 또한, 간 조직은 Oil Red O (ORO) 염색을 시행하였으며, ORO 염색은 60°C에서 7분 동안 ORO 완충액, 3분 동안 85% propylene glycol에서 순차적으로 반응시킨 후 Harris hematoxylin에서 염색함으로써 진행하였다. 각각 염색된 슬라이드는 PANNORAMIC 250 Flash III digital slide scanner (3DHISTECH Ltd., Budapest, Hungary)를 사용하여 이미지 촬영 후 Caseviewer program (3DHISTECH Ltd.)을 사용하여 관찰하였다.

통계분석

데이터는 SPSS 27.0 for window (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을 사용하여 평균 (mean) ± 표준오차의 평균 (standard error of the mean)으로 표시하였다. 또한, one-way analysis of variance를 사용하여 다중 비교를 수행한 후 least significant difference로 사후 테스트를 수행하였다. p-value < 0.05일 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

결과

Total polyphenol과 total flavonoid 함량 측정

SS의 total polyphenol과 total flavonoid 함량을 측정한 결과, total polyphenol의 경우 84.69 ± 0.46 mg (GAE)/g으로 나타났으며, total flavonoid 함량은 16.25 ± 0.06 mg (QE)/g 함량을 나타냈다 (Table 2).

Table 2
Total polyphenol and total flavonoid levels of SS

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DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능 측정

SS의 항산화 능력을 확인하기 위해 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 측정하여 half maximal inhibitory concentration (IC₅₀) 값을 계산하였다. DPPH의 IC₅₀ 값은 7.31 ± 0.42 μg/mL로 나타났으며, ABTS의 IC₅₀ 값은 20.73 ± 0.07 μg/mL로 우수한 항산화 활성을 나타냈다 (Fig. 1).

Fig. 1
DPPH and ABTS radical scavenging activities.
The antiradical activities of SS were measured through DPPH and ABTS radical scavenging assays, and the results were expressed as half maximal inhibitory concentration values (μg/mL).

DPPH, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; ABTS, 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid); SS, Syzygium aromaticum L. and Sorbus commixta Hedl.

세포 증식에서의 SS의 효과

SS의 세포 증식을 확인하기 위해 3T3-L1 cells에 WST-1 분석을 사용했다. SS의 다양한 농도 (12.5–800 μg/mL)를 처리한 후 48시간 이후에 세포 증식을 측정했다. 48시간 군과 비교하였을 시, 그룹 간에 유의미한 차이가 없었다 (Fig. 2).

Fig. 2
Intracellular TG and TC contents by SS treatment. After 48 hours of cell culture, cell proliferation significantly increased compared to the baseline (0 hour).
However, there was no significant difference observed in the comparison between groups treated with FFA or SS (12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800 μg/mL). To evaluate intracellular TG and TC contents, 3T3-L1 cells were pretreated with SS (100, 200, and 400 μg/mL) for 6 hours before FFA (250 μM) treatment. SS treatment inhibited intracellular TG and TC levels in FFA-treated 3T3-L1 cells. (A) Cell proliferation, (B) intracellular TG and TC contents. All data are expressed mean ± standard error of the mean (n = 4).

TG, triglyceride; TC, total cholesterol; FFA, free fatty acid; SS, Syzygium aromaticum L. and Sorbus commixta Hedl.

^###p < 0.001 vs. Normal group and ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***p < 0.001 vs. Control group.

지질 합성 관련 유전자 발현에 미치는 SS의 효과

지질 합성에 관여하는 유전자들인 Srebp1a, Srebp1c, Fasn, Dgat1, Dgat2 및 Pparγ의 mRNA 발현을 측정했다. FFA 처리는 모든 유전자 발현이 유의적으로 증가하였다. Pparγ와 Dgat1를 제외한 모든 유전자는 SS200과 SS400의 처치 모두에서 유의하게 감소하였으나 Pparγ와 Dgat1 두 유전자 발현은 오로지 SS400에 의해서만 유의하게 감소하였다. SS400의 처치는 Control 대비 각각 (Srebp1a, 21.15%; Srebp1c, 12.01%; Fasn, 16.25%; Dgat1, 5.41%; Dgat2, 10.92%; Pparγ, 21.28%) 유의하게 감소되었다 (Fig. 3).

Fig. 3
The effects of SS on the expression of genes related to lipogenesis. 3T3-L1 cells were pretreated with SS (100, 200, and 400 μg/mL) for 6 hours before FFA (250 μM) treatment.
SS treatment regulates gene expressions involved in lipogenesis in FFA-treated 3T3-L1 cells. (A) Srebp1a, (B) Srebp1c, (C) Fasn, (D) Pparγ, (E) Dgat1, and (F) Dgat2. Data are expressed mean ± standard error of the mean (n = 4).

SS, Syzygium aromaticum L. and Sorbus commixta Hedl.; FFA, free fatty acid.

^###p < 0.001 vs. Normal group and ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***p < 0.001 vs. Control group.

지방산 산화 관련 유전자 발현에 미치는 SS의 효과

지방산 산화에 관여하는 유전자들인 Pparα, Ampkα 및 Cpt1의 mRNA 발현을 측정했다. FFA 처리는 모든 유전자 발현이 유의적으로 감소하였다. Pparα를 제외한 Ampkα와 Cpt1 두 유전자는 SS200과 SS400의 처치 모두에서 유의하게 증가하였으나 Pparα는 오로지 S400에 의해서만 유의하게 증가하였다. SS400의 처치는 Control 대비 각각 (Pparα, 1.06배; Ampkα, 1.06배; Cpt1, 1.15배) 유의하게 증가하였다 (Fig. 4).

Fig. 4
The effects of SS on the expression of genes related to β-oxidation. 3T3-L1 cells were pretreated with SS (100, 200, and 400 μg/mL) for 6 hours before FFA (250 μM) treatment.
SS treatment regulates gene expressions involved in β-oxidation in FFA-treated 3T3-L1 cells. (A) Pparα, (B) Ampkα, (C) Cpt1. Data are expressed mean ± standard error of the mean (n = 4).

SS, Syzygium aromaticum L. and Sorbus commixta Hedl.; FFA, free fatty acid.

^##p < 0.01, ^###p < 0.001 vs. Normal group and ^*p < 0.05, ^**p < 0.01 vs. Control group.

체중 변화 및 혈청 내 생화학 분석

군 분리 후 약물 투여 6주 동안의 체중의 변화량 (g)은 Normal군 7.46 ± 0.44, Control군 13.80 ± 0.94, SA200군 10.28 ± 0.40, SC200군 9.93 ± 0.69 및 SS200군 9.61 ± 0.60으로 모든 약물처치군이 Control군 대비 유의한 감소를 보였다. 특히, SS200군은 다른 실험군 대비 가장 낮은 체중 증가를 보였으나 군 간 유의성은 나타나지 않았다 (Fig. 5A). 간 기능 평가를 위해 혈청에서 GOT와 GPT를 측정하였다. GOT의 경우, Control군은 Normal군 대비 유의하게 증가하였으며, 이는 약물처리에 의해 감소하였다. 특히, GPT의 경우 세 약물처치군에서 모두 유의하게 감소함을 보여주었다 (p < 0.05) (Fig. 5B and C). 그 다음으로, 혈청 내 지질관련 마커인 leptin 호르몬, TG 및 TC를 측정하였다. 혈청 내 leptin 호르몬 (ng/mL)을 측정한 결과, Normal군 0.6 ± 0.1 대비 Control군은 3.2 ± 0.2 (p < 0.001)로 5.4배 유의하게 증가하였으며, SA200군, SC200군 및 SS200군은 각각 2.0 ± 0.2, 1.9 ± 0.2, 1.7 ± 0.3으로 모든 약물처치군에서 각각 36.73%, 41.87%, 48.64%로 유의하게 감소하였다 (p < 0.01) (Fig. 5D). 특히, SS200군에서 비만으로 인한 leptin 저항성을 가장 우수하게 억제함을 보여주었다. TG의 경우, Control군에서 Normal 대비 1.41배 유의하게 증가를 하였고, 이는 SA200군에서 9.56%, SC200군에서 22.35%, SS200군에서 24.50%로 유의하게 감소하였다. TC 경우, Control군에서 Normal군 대비 1.42배 유의하게 증가를 하였고, 이는 SA200군에서 11.74%, SC200군에서 10.83%, SS200군에서 8.16%로 유의하게 감소하였다. TG의 억제는 SS200군에서 TC의 억제는 SA200군에서 가장 효과적인 것으로 나타났다 (Fig. 5E and F).

Fig. 5
Body weight gain and serum biochemical analysis.
Six weeks of SS treatment resulted in reduced body weight gain and elevated serum levels of lipids and hepatic enzymes in mice a 60% HFD. C57BL/6J mice were either fed a normal diet or an HFD. The drugs were administered at a dose of 200 mg/kg, including SA, SC, SS for the 6-week duration. (A) Body weight gain, (B) GOT, (C) GPT, (D) leptin, (E) TG, (F) TC. Data are presented as the mean ± standard error of the mean (n = 9/each group).

SS, Syzygium aromaticum L. and Sorbus commixta Hedl.; HFD, high-fat diet; SA, Syzygium aromaticum extract; SC, Sorbus commixta extract; GOT, glutamic oxaloacetic transaminase; GPT, glutamic pyruvic transaminase; TG, triglyceride; TC, total cholesterol.

^#p < 0.05, ^###p < 0.001 vs. Normal group, ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***p < 0.001 vs. Control group, and ^$p < 0.05 between SA200 group and SS200 group.

TG 합성 관련 단백질 발현량 분석

간 조직 내에서 TG 합성과 관련된 인자인 p-AMPK, SREBP-1과 ACC의 발현량을 측정하였다 (Fig. 6). p-AMPK 측정 결과, Control군은 Normal 대비 37.83% 유의하게 감소하였으며 (p < 0.01), SC200군과 SS200군에서 각각 1.38배, 1.45배로 유의하게 증가하였다. 전사인자인 SREBP-1의 발현량 분석 결과, Control군은 Normal군 대비 1.82배 유의하게 증가하였으며 (p < 0.001), 모든 약물처치군에서 유의하게 감소하였다 (SA200군, 25.34%, SC200군, 26.61%, SS200군, 32.92%). 특히, SS200처치군이 SREBP-1의 발현을 가장 우수하게 억제시켰다. 하위인자인 ACC 측정 결과, Control군은 Normal 대비 1.43배 유의하게 증가하였으며 (p < 0.05), SC200군과 SS200군에서 각각 19.95%, 34.52%로 유의하게 감소하였다. 특히, SS200 처치군이 ACC의 발현을 가장 우수하게 억제시켰다.

Fig. 6
Analysis of protein expression related to triglyceride synthesis.
C57BL/6J mice were either fed a normal diet or a 60% high-fat diet. The drugs were administered at a dose of 200 mg/kg, including SA, SC, SS for the 6-week duration. (A) p-AMPK expression, (B) SREBP-1 expression, (C) ACC expression. Data are presented as the mean ± standard error of the mean (n = 9/each group).

SS, Syzygium aromaticum L. and Sorbus commixta Hedl.; SA, Syzygium aromaticum extract; SC, Sorbus commixta extract; p-AMPK, phospho-AMP-activated protein kinase; AMPK, AMP-activated protein kinase; SREBP-1, sterol regulatory element-binding proteins 1; TBP, TATA box-binding protein; ACC, acetyl-CoA carboxylase.

^#p < 0.05, ^##p < 0.01, ^###p < 0.001 vs. Normal group and ^*p < 0.05, ^**p < 0.01 vs. Control group.

조직병리학적 변화 및 부고환주위지방 조직 무게에 미치는 효과 분석

간과 부고환주위지방 조직의 염색을 통하여 조직병리학적 변화를 관찰하였다. 간 조직에서 H&E와 ORO 염색법을 통해 지질 축적 상태를 확인하였고, 부고환주위지방 조직에서 H&E 염색법을 통해 지방세포의 크기 변화를 확인하였다 (Fig. 7A-C). 간 조직의 분석 결과, Normal군에 비해 Control군의 간 조직에서 lipid droplets이 증가하였으나 약물처치군에서 뚜렷하게 줄어드는 것이 관찰되었다. 부고환주위지방 조직의 분석 결과, Normal군에 비해 Control군의 지방세포 크기가 커지는 것을 확인하였고, 이는 약물처치군에 의해 지방 세포의 크기가 줄어들었다. 또한, 부고환주위지방 조직 무게를 몸무게로 나누었을 때, Normal군 대비 Control군은 3.17배 유의하게 증가한 반면에 (p < 0.001), Control군의 이러한 증가는 SS200군에서 36.05%로 가장 우수하게 억제되었음을 나타내었다 (Fig. 7D).

Fig. 7
Analysis of the effects on histopathological and epididymal fat weight changes.
C57BL/6J mice were either fed a normal diet or a 60% high-fat diet. The drugs were administered at a dose of 200 mg/kg, including SA, SC, SS for the 6-week duration. (A) Liver H&E staining, (B) liver Oil Red O staining, (C) epididymal fat H&E staining (magnification, 200×), (D) epididymal fat weight change.

SA, Syzygium aromaticum extract; SC, Sorbus commixta extract; SS, Syzygium aromaticum L. and Sorbus commixta Hedl.; H&E, hematoxylin & eosin.

^###p < 0.001 vs. Normal group and ^*p < 0.05, ^**p < 0.01 vs. Control group.

고찰

비만의 발병 기전은 다양한 요인에 의해 결정되지만, 고지방이며 에너지 밀도가 높은 식품의 섭취 증가와 과다한 칼로리 섭취가 현재의 비만 유행에 중요한 영향을 미친다 [22]. 비만인의 경우, 에너지 및 음식 섭취량이 많고, 에너지 밀도가 높은 고지방 음식을 더 많이 섭취하는 것으로 나타나며, 이는 비만인이 더 많은 양의 음식을 섭취할 수 있는 능력이 더 클 수 있음을 시사한다. 이는 아마도 상부 위장관의 감각 능력이 감소로 인한 것으로 여겨지며, 이로 인해 비만인의 경우 소화불량이 잘 발생하는 것과도 밀접한 관련성이 있다 [23, 24]. 다양한 생리학적 기능을 매개하는 5-hydroxytryptamine receptor 3 (5-HT₃)는 위장 운동 장애나 메스꺼움 발생과 같은 많은 병태생리학적 과정에도 관여하는데, 정향은 이러한 5-HT₃ 길항제로 보고된 바 있다 [25].

본 연구에 사용된 정향과 마가목은 기 보고된 대로 항염증 및 항비만 효과를 지니고 있다 [26, 27]. 또한, 정향은 위장 기능을 돕고 위장 장애를 치료하는 효과를 발휘한다 [28]. 하지만 정향의 유기 용매 추출물 또는 에센셜 오일의 응용 분야는 여전히 제한적이다. 정향이 쉽게 공기중에 떠다니는 휘발성 분자인 많은 양의 페놀과 향미 화합물을 포함하고 있어 강력한 항균효과를 발휘하나 이는 자극적인 냄새를 유발을 이끌며, 잔류하는 유기 용매가 음식에 첨가되었을 시, 강한 거부감을 일으킬 수 있기 때문이다 [29]. 이러한 단점의 대안은 사용이 용이하며, 독성이 낮고, 자극성 화합물에 대한 추출 용량이 희박한 물을 추출 용매로 사용하는 것이다 [30]. 따라서 정향의 열수추출물을 가지고 적은 함량으로 항비만 효과를 발휘하는지 평가하고자 부종을 효과적으로 제어하는 마가목을 복합하여 본 실험에 사용하였다.

지질 (lipids)은 에너지원, 구조적 구성 요소 및 신호 전달 매개체로 기능하는 필수 대사 산물이다 [31]. 대부분의 세포는 탄수화물을 지방산으로 전환할 수 있으며, 지방산은 혈장으로부터 간세포로의 흡수와 새로운 생합성에 의해 간에 축적되며 정상적인 상황에서는 소량의 지방산만 TG로 저장된다. TG는 지방산의 저장이나 운반을 위해서는 효율적이나 세포막을 통과할 수가 없기에 TG의 가수분해가 이루어진다. 하지만 영양과다 및 비만의 환경에서 간의 지방산 대사가 변경이 되면 일반적으로 간세포 내에 TG가 과도하게 축적이 된다 [32]. 따라서, 지질의 합성과 분해가 불균형하게 되면 지질 항상성의 이상과 밀접하게 연관되어 이상지질혈증, 당뇨병, 지방간, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환 및 암과 같은 병리학적 질환을 초래하게 된다.

본 연구에서는 3T3-L1 세포와 60% 고지방식이를 급여한 C57BL/6J 마우스에 대한 정향과 마가목 복합물 (SS)의 항비만 효과의 기본 메커니즘을 평가하였다. 실험결과, 3T3-L1 세포에 SS200과 SS400의 처치는 지질 합성을 억제시키고, 지방산 산화를 증가시킴을 보여주었다. 또한, C57BL/6 마우스에 SS200의 처치는 정향과 마가목 단독처치보다 체중변화, leptin 호르몬, 혈청 TG를 더 많이 감소시켰다. 또한, SS200의 처치는 AMPK 활성화를 유도하였고, 이는 중성지방 전사인자인 SREBP-1의 발현을 감소시켰으며, 하위인자인 ACC의 유의한 감소를 이끌었다. 이를 통해 SS는 지질 대사 관련 유전자 및 단백질 발현을 조절하여 항비만 효과를 나타내는 것으로 나타났다.

지질합성은 지방전구세포 (preadipocytes)의 분화 동안 지방세포의 과도한 지방 축적에 기여한다. 마우스 3T3-L1 세포는 지방 생성의 분자 및 세포 메커니즘 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 지방전구세포주이다 [33]. 우리는 첫 번째로, 3T3-L1 세포에서 지질 대사 중 지질 합성에 관여하는 유전자 발현에 대한 SS의 억제 효과를 조사하였다. 지질 합성은 Srebp1a, Srebp1c, Fasn, Dgat1, Dgat2 및 Pparγ를 포함한 지질 합성 유도 유전자의 mRNA 발현을 통해 평가하였다. Srebp1a은 지방세포에서 속도제한효소 유전자인 Fasn, Dgat1 및 Dgat2와 같은 유전자들의 발현을 조절하고, Pparγ 활성을 증가시켜 세포 내에 지방 축적을 촉진하게 된다 [34]. TG의 합성에 관여하는 대표적인 경로는 glycerol-3-phosphate (G3P) 경로이며, 여러 가지 효소에 의해 G3P의 아실화 (acylation)가 된 후 phosphatidate가 되고, 이는 phosphatase에 의해 diacylglycerol (Dag)이 된다. 이때 Dgat가 TG 합성의 최종 단계를 촉매하는 유일한 효소로서 작용을 하게 된다 [35]. 본 실험결과, Srebp1a, Srebp1c, Fasn, Dgat1, Dgat2 및 Pparγ의 mRNA 발현 수준은 지방세포 분화 후 FFA 처리에 의해 유의하게 증가하였다. Pparγ와 Dgat1를 제외한 모든 유전자는 SS200과 SS400의 처치 둘 다에서 유의하게 감소하였으나 Pparγ와 Dgat1 두 유전자 발현은 오로지 SS400에 의해서만 유의하게 억제하였다. 이러한 결과는 SS 처리가 3T3-L1 세포에서 지질합성 유도 유전자의 발현을 하향 조절함으로써 지질합성 및 저장에 네거티브한 효과를 발휘함을 시사한다. 두 번째로, 3T3-L1 세포에서 지방산 산화 (β-oxidation)에 관여하는 유전자 발현에 대한 SS의 억제 효과를 조사하였다. AMPK의 활성화는 지방산 산화를 유도하며 PPARα에 의해 조절되는 지방산 산화 유전자, 특히 Cpt1을 증가시킨다고 보고되어 있다 [36].

지방산 산화는 지질 균형을 유지하는 또 다른 대사 경로이며, 손상된 지방산 산화는 비정상적인 TG 축적을 유발한다. PPARα는 지방산 산화에 관여하는 유전자들의 주요 조절자로 작용하며, 지방산 분해를 촉진하여 지질 축적을 억제한다. 하위 유전자인 Cpt1은 지방산 산화의 속도를 제어하는 속도제한효소로서 미토콘드리아 산화 활동의 지표로 사용된다 [37]. 우리 연구의 결과는 SS 처리가 AMPK를 활성화시키고 이는 PPARα 매개의 유전자 Cpt1을 증가시켜 지방산 산화를 강화시킴을 보여주었다.

정향과 마가목 단독 처치 및 복합물 (200 mg/kg) 처치를 6주 동안 경구투여 후 마우스의 간 지방증에 미치는 영향을 조사하였다. 마우스들의 초기 체중은 그룹 간에 유의한 차이가 없었으나 6주 후에 HFD로 급여된 마우스의 체중 변화는 정상군보다 1.9배 유의하게 증가하였다. 그러나 약물 처치군은 HFD 급여로 인한 체중 증가를 유의하게 감소시켰으며 (SA200, 25.5%; SC200, 28.1%; SS200, 30.4%), 이중 복합물 처치가 단독 처치보다 (6.6% vs. SA200; 3.2% vs. SC200) 더 감소하였다. 이어서 혈청 내 생화학 지표를 조사하였다. 정상군과 비교하여 Control군의 혈청 중 TG 및 TC 수준이 현저히 증가함을 보여주었다 (TG, 1.41배 vs. Normal; TC, 1.42배 vs. Normal). SS200 투여는 단독 처치군과 비교하였을 시, TC에서 24.50%로 효과적으로 감소시켰다. 추가로 HFD 급여는 정상군과 비교하여 Control군의 혈청 GOT와 GPT를 증가시켰고, 특히, GPT의 경우 모든 약물 처치에 의해 유의한 감소로 이어졌다. 혈청 내 leptin 호르몬을 측정한 결과는 정상군과 비교하여 Control군에서 5.4배로 유의하게 증가하였고, 약물 처리군 모두에서 유의하게 감소하였으나 그 중 SS200의 처치가 가장 우수하게 나타났다. 이를 통해 HFD의 급여로 유도된 leptin 저항성을 SS200 투여로 효과적으로 개선시킴을 확인하였다 [38].

또한, 단백질 발현을 조사하였을 시, SS200은 AMPK/ACC/SREBP1c 경로에 영향을 미친 것으로 나타났다. AMPK는 세포 에너지 조절 센서로서 AMPK/ACC 경로는 지방산 대사 조절에 중요한 역할을 한다. ATP의 고갈에 의해 AMPK가 활성화되면 ATP 소비 과정을 차단하는 동시에 ATP를 생성하는 경로를 촉진한다. AMPK는 ACC의 인산화를 통해 TG 합성 및 축적에 관여하는 지방 생성 유전자 발현의 억제를 매개한다. 또한, HFD의 급여로 유도된 비만에서 SREBP-1은 발현이 증가하게 되고, 이는 지방 생성과 지질 축적을 야기한다 [39]. 우리는 고지방식으로 유발된 비만 마우스에서 SS200의 투여가 AMPK를 활성화시키고, SREBP-1의 억제를 지방 생성이 감소됨을 확인하였다.

마지막으로, 간과 부고환주위지방 조직에서 H&E와 ORO 염색을 진행하였고, 현미경을 통해 조직병리학적 변화를 관찰하였다 [40]. 간 조직의 H&E 분석 결과, Normal군에 비해 Control군의 간 조직에서 lipid droplets이 증가하였으나 SS200 처치군에서 현저히 감소하는 것이 관찰되었다. 또한, 간 조직 내 과도한 지질 축적이 SS200 투여로 인해 현저히 개선되어졌다. 부고환주위지방 조직의 분석 결과, Normal군에 비해 Control군의 지방세포 크기가 커지는 것을 확인하였고, 이는 SS200 투여에 의해 지방 세포의 크기가 감소하였다.

결론적으로, 정향과 마가목 단독 처치군과 복합물군의 항비만 효과를 비교 분석하였을 시, 실험기간 동안의 체중 변화가 복합물군에서 유의성은 없으나 가장 낮았다. 혈청 내 leptin 함량은 복합물군에서 가장 낮은 수치를 보여 아마도 복합물 처치가 leptin 저항성을 효과적으로 개선시키는 것으로 사료된다. 또한, 혈청 내 TG의 정향 단독군보다 복합물군이 유의적으로 감소된 것과 간 조직에서 평가한 중성지방 합성 전사인자인 SREBP-1과 하위인자인 ACC의 단백질 발현 및 부고환주위지방 조직 무게의 탁월한 감소는 본 연구에서는 단독군과의 유의적인 차이는 없었지만 장기전이 되었을 때, 그 차이는 커질 것으로 판단되며 이는 정향과 마가목 단독보다는 복합물 처치가 항비만 개선 효과에 더 효과적일 것으로 생각되어진다.

요약

본 연구에서는 정향과 마가목 복합물 (SS)의 항비만 효과를 알아보기 위해 실험을 진행하였다. SS 투여는 3T3-L1 세포 내 TG와 TC가 유의적으로 감소하는 효과를 나타냈으며, 지질 합성 관련 유전자와 지방산 산화 관련 유전자 발현을 조절하는 효과를 보여주었다. 비만이 유도된 C57BL/6 mice에서 SS 투여는 혈청 내 leptin 호르몬 수치를 감소시켰으며, AMPK/ACC/SREBP-1 경로를 경유하여 TG 합성을 억제하였다. 또한, 조직병리학적 분석을 통해 지질 축적과 지방세포의 크기가 감소된 것을 확인하였다. 따라서 SS는 비만의 예방과 치료를 위한 잠재력을 갖춘 소재로 사료된다.

Notes

Funding:This research was supported by the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Korea Government (MSIP) (No. 2018R1A5A2025272) and the Ministry of Education (2021R1I1A1A01059605).

Conflict of Interest:There are no financial or other issues that might lead to conflict of interest.

Author Contributions:

Data curation: An HY.
Investigation: An HY.
Project administration: Shin MR.
Writing - original draft: Yu JH, Shin MR.
Writing - review & editing: Roh SS.

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