Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
Due to the active development of marine transportation infrastructure and possible occurrence of accompanying hydrocarbon pollution, there is a need to develop new safe methods of both direct elimination of pollution and its consequences. One of the promising and safe ways is the use of products based on oil-degrading microorganisms. In this work the influence of Arthrobacter psychrochitiphilus ARC 42 strain on the main links of marine ecosystems is considered. It was found that the studied strain did not inhibit the development of saprophytic microbiota, in high concentrations influenced the development of phytoplankton culture, practically had no effect on benthic organisms. Strain ARC 42 in the recommended concentrations is safe for fish and does not affect their physiological parameters. Experiments with the addition of oil revealed the absence of toxicity of its decomposition products, which confirms the safety of using the preparation based on this strain.
oil-degrading bacteria, threshold limit value (TLV), Phaeodactylum tricornutum, Oryzias latipes
Введение
Арктический регион РФ является одной из наиболее интенсивно развивающихся экономических зон [1], в котором происходит как освоение новых месторождений полезных ископаемых, так и развитие прибрежной транспортной инфраструктуры, в том числе – для переработки и транспортировки нефти и газа [2]. В настоящее время ведутся работы по более интенсивному использованию Северного морского пути для транспортировки углеводородов и других полезных ископаемых, поэтому очевидно, что количество нефтепродуктов, непреднамеренно попадающих в морские акватории при эксплуатации морского транспорта, может расти [3]. Для ликвидации последствий потенциальных углеводородных загрязнений и минимизации ущерба окружающей среде необходимо использовать наиболее эффективные и экологически безопасные подходы [4; 5]. Одним из способов очистки прибрежных участков акваторий от углеводородов нефти может являться использование микробиологических препаратов [6]. Специально отобранные аборигенные штаммы микроорганизмов способны проявлять высокую активность в разложении компонентов нефти даже при низких температурах северных широт. Это свойство делает их особенно ценными для потенциального использования в биоремедиации морских нефтяных загрязнений в холодных климатических условиях [7; 8]. Ареалом их обитания и местом выделения могут быть акватории морей арктического региона, где они – естественные компоненты морских экосистем [9].
Микробные препараты можно использовать как отдельно, так и совместно с диспергентами и другими решениями для утилизации углеводородных загрязнений [10]. В качестве носителя для нефтеокисляющих микроорганизмов, как правило, используются относительно инертные компоненты, которые могут служить субстратом для развития и источником дополнительного углеродного питания, что увеличивает скорость роста микроорганизмов [11]. Для успешного использования данного подхода при очистке морских акваторий необходимо оценить потенциальные экологические риски его применения. В частности, требуется: (1) оценка взаимодействия препаратов с модельными морскими видами организмов; (2) изучение токсичности микроорганизмов и их метаболитов, в т.ч. продуктов разложения нефти; (3) разработка методов контроля микроорганизмов в водной среде для оценки их распространения после внесения. Подобные исследования могут быть проведены на модельных морских гидробиоценозах с использованием стандартизированных тест-организмов.
Многие штаммы микроорганизмов-деструкторов уже были протестированы на биобезопасность и показали низкую токсичность, а также – отсутствие негативного воздействия на все звенья морских биоценозов. Помимо этого, биологические препараты, в состав которых входят аборигенные штаммы микроорганизмов, являются более безопасными, ввиду того, что не будут оказывать негативного влияния на местное биоразнообразие [12]. Таким образом, для эффективного применения вновь разработанных биологических препаратов необходимо проведение комплексных исследований для подтверждения возможности их безопасного использования в морских экосистемах. Тестирование безопасности микробного
Целью исследования являлась оценка влияния
Материалы и методы исследования
Штамм микроорганизма в составе биопрепарата
Исследуемы
Определение токсических свойств
Работа по определению безопасных концентраций биопрепарата выполнена в соответствии с методическими указаниями (согласно «Методическим указаниям», приказ Росрыболовства № 695 от 04.08.09 г., с учетом пункта 5 Требования к разработке ПДК биологических препаратов [13]). В качестве основных тест-объектов в исследовании были использованы водоросли Phaeodactylum tricornutum, макрофиты – хетоморфа (Chaetomorpha linum), ракообразные Artemia salina, представители бентоса – амфиподы (Gammarus duebeni), представители ихтиофауны – рыбы медака (Oryzias latipes) и гуппи (Poecilia reticulata). Работы проводились на базе центра «Аквакультура» Факультета биологии и рыбного хозяйства МГУТУ им. К.Г. Разумовского (ПКУ). Для содержания тест-объектов и проведения исследования использовалась искусственная морская вода на основе соли «Red Sea Salt» (Red Sea International) соленостью 20‰. Для исследования влияния на сапрофитную микрофлору использовалась вода из действующей морской аквариальной системы.
Исследования проводились в двух вариантах: с добавлением (0,05 мл/л) и без добавления нефти. Установление чувствительности применяемых тест-организмов проводилось с помощью бихромата калия.
Для сапрофитной микрофлоры, фитопланктона и простейших оценивалось влияние на динамику роста культуры. Для зоопланктона и бентосных организмов основным критерием оценки токсичности выступала выживаемость тест-объектов. Спектр исследований на рыбах включал как краткосрочные, так и долгосрочные эксперименты. Помимо выживаемости оценивалось воздействие на эмбриональные стадии развития, гематологические и гистологические показатели. Оценка возможной генотоксичности проводилась с использованием микроядерного теста на эритроцитах рыб [14].
Статистическая обработка
Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 9.0 (GraphPad, San Diego, CA, USA), среды R (v3.5.2; R Core Team [15]) и программы RStudio [16]. Данные анализируемых показателей представлены как среднее ± стандартное отклонение (M±m). Для оценки статистических различий между тест-показателями биологических объектов в разных концентрациях использовали тест Стьюдента в модификации Уэлча (в случае неравных дисперсий) с использованием поправки Бонферрони-Холма (для учета множественных сравнений). Статистически значимым считалось значение P <0,05.
Результаты и обсуждение
Влияние исследуемого штамма на сапрофитную микрофлору
Концентрация биопрепарата для исследования была определена при оценке органолептических показателей, а также в острых опытах на тест-объектах. При исследовании воздействия культуры Arthrobacter psychrochitiphilus ARC 42 удалось выявить закономерности взаимодействия исследуемого микроорганизма и естественной сапрофитной микрофлоры.
Штамм ARC 42 приводил к достоверной стимуляции численности сапрофитной микрофлоры на 3 и 5 сутки в концентрациях 7,5 и 10 мл/л c добавлением нефти (рис. 1, а). Внесение нефти в опытные растворы приводило к достоверной стимуляции роста сапрофитных микроорганизмов также в концентрации 5 мл/л. На 7 сутки численность микроорганизмов в концентрациях более 2,5 мл/л достоверно превышала контрольные значения, как с добавлением, так и без добавления нефти (рис. 1, б).
|
|
|
Рисунок 1. Влияние культуры Arthrobacter psychrochitiphilus ARC 42 на численность сапрофитной микрофлоры (104 |
Figure 1. The effect of the culture of Figure 1
Figure1. Arthrobacter psychrochitiphilus ARC 42 on the number of saprophytic microflora (104 CFU/ml) with the addition of oil. (a) – dynamics of the number of saprophytic microorganisms on 1-7 days; (b) – the number of microorganisms on the 7th day of the experiment. Note:* - values statistically significantly different from the control at td = 2.77, p≤0.05
Исходя из полученных результатов можно видеть, что добавление культуры в концентрациях более 0,5 мл/л приводит к существенному ускорению роста бактериальных сообществ. Эффект стимуляции может быть вызван внесением более высокого титра микроорганизмов, по сравнению с присутствующей в водной среде сапрофитной микрофлорой. Также ускорение роста может быть вызвано метаболитами исследуемого штамма и присутствием культуральной среды. При добавлении нефти, за счет метаболизма нефтеокисляющих штаммов микроорганизмов, могут появляться дополнительные источники питания для естественной микрофлоры.
Таким образом, безопасной, не оказывающей влияния на рост сапрофитных микроорганизмов концентрацией бактериальной культуры может быть признана 0,5 мл/л (500 мг/л; 0,5*105 КОЕ/л). Внесение штамма в данной концентрации в морскую среду не окажет негативного воздействия на существующий микробиоценоз, но может существенно снизить остаточное нефтяное загрязнение.
Влияние исследуемого штамма на фитопланктон (Phaeodactylum tricornutum)
С целью оценки влияния исследуемого штамма на организмы фитопланктона использовалась диатомовая водоросль Phaeodactylum tricornutum, которая является чувствительным тест-объектом к загрязнениям водной среды. Исследования проводились в остром (72 часа) и хроническом опытах (14 сток). В условиях краткосрочного эксперимента был установлен токсикометрический параметр ЭК50 72, который составил для штамма ARC42 0,96 мл/л (рис. 2, а). В концентрациях 1 и 2,5 мл/л происходило значительное ускорение роста культуры водоросли, при этом в максимальных концентрациях наблюдалось незначительное падение численности клеток. Таким образом, можно утверждать, что исследуемый микроорганизм оказывает схожий стимулирующий эффект на рост культуры водорослей в низких концентрациях.
В хроническом опыте без добавления нефти достоверная стимуляция роста культуры феодактилума наблюдалась в концентрациях 1 и 2 мл/л начиная с 5 суток опыта (рис. 2, б). Большая, в сравнении с контролем, численность клеток в данных концентрациях сохранялась на 7 и 14 сутки. При внесении нефти в исследуемый раствор была установлена разнонаправленная динамика роста культуры P. tricornutum. Так, на 3 сутки эксперимента, при внесении нефти концентрации
Как правило, бактериальные культуры, при совместном культивировании с фитопланктоном, влияют на процессы роста, так как микробные клетки, прикрепляясь к поверхности клеток водорослей, снижают интенсивность фотосинтеза и газообмена. Стимуляция роста водоросли, скорее всего, обусловлена обогащением водной среды метаболитами бактериальных клеток, которые могут стимулировать рост водорослей за счет присутствия азотистых соединений, выделения CO2 и биологически активных веществ [17]. Выявленная разнонаправленная динамика роста культуры при добавлении нефти может быть связана с негативным воздействием нефти непосредственно на организмы фитопланктона, численность которых снижалась по мере разложения нефти микроорганизмами.
|
|
|
Рисунок 2. Влияние культуры Arthrobacter psychrochitiphilus ARC 42 на рост культуры Phaeodactylum tricornutum в остром и хроническом опыте с добавлением и без добавления нефти |
Figure 2. Influence of the culture of Arthrobacter psychrochitiphilus ARC 42 on the growth of Phaeodactylum tricornutum culture in acute and chronic experience with and without the addition of oil
Таким образом, безопасной концентрацией для исследуемого штамма, не оказывающей влияния на рост водорослевой культуры Phaeodactylum tricornutum, следует признать 0,5 мл/л (500 мг/л; 0,5*105 КОЕ/л).
Сводные данные о влиянии исследуемого штамма на представительных гидробионтов
Данные по влиянию исследуемой бактериальной культуры на представительных гидробионтов, а также гидрохимический режим приведены в таблице 1.
Таблица 1. Сводная таблица по влиянию бактериальной культуры на солоноватоводную и морскую водную среду и представительных гидробионтов
Table 1. Summary table on the effect of bacterial culture on the brackish and marine aquatic environment and representative hydrobionts
|
Тест-организм |
Определяемый показатель |
МДК, мл/л (КОЕ/л) |
|
ARC 42 |
||
|
Бактериальная микробиота |
Численность сапрофитов |
1 (1*106) |
|
Phaeodactylum tricornutum |
ЭК5072 |
0.96 |
|
Динамика численности |
0.5 (0,5*105) |
|
|
Zostera marina |
Прирост листьев |
5 (5*106) |
|
Прирост таллома |
10(1*107) |
|
|
Chaetomorpha linum |
Прирост таллома |
1 (1*106) |
|
Stylonichia mytilus |
Изменение численности |
1 (1*106) |
|
Artemia salina |
ЛК5096 |
11.57 |
|
Выживаемость |
1 (1*106) |
|
|
Gammarus duebeni |
Выживаемость |
2.5 (2,5*106) |
|
Poecilia reticulata |
ЛК5096 |
14.02 |
|
Выживаемость мальков |
5 (5*106) |
|
|
Выживаемость молоди |
10 (1*107) |
|
|
Oryzias latipes |
Воздействия на эмбриональное развитие |
10 (1*107) |
|
Выклев предличинок |
10 (1*107) |
|
|
Poecilia reticulata |
Гистологическое |
5 (5*106) |
|
Гематологическое |
5 (5*106) |
|
|
Генотоксичность (МЯТ) |
10 (1*107) |
Было установлено, что бактериальная культура, в исследуемых концентрациях, оказалась малотоксичной для большинства экспериментальных тест-организмов. Эффекта при воздействии на организмы зоопланктона (Stylonichia mytilus, Artemia salina) не наблюдалось, как в остром, так и в хроническом опыте, даже при внесении 1 мл/л биопрепарата. Показатель – полулетальная концентрация за 96 часов для Artemia salina для штамма ARC 42 составил 11,57 мл/л.
|
|
|
Рисунок 3. Результаты исследования по влиянию бактериальных культур на рыб (Poecilia reticulata, Oryzias latipes |
Figure 3. Results of a study on the effect of bacterial cultures on fish (Poecilia reticulata, Oryzias latipes): (a) – embryonic development of honeydew in the control (left) and in the concentration of strain ARC 42 10 ml/l (right); (b) – the survival rate of honey caviar without the addition of oil (c) and with the addition of oil; (d) the predlichinka of honey in the control (top) and in the concentration of shmma ARC 42 20 ml/l (bottom); (e) histological sections of guppy gills in the concentration of the ARC 42 strain 7.5 ml/l and (e) 10 ml/l; (g) shaped blood elements from the experimental groups; (h) the relative occurrence of immature erythrocytes in the peripheral blood of guppies under the action of the ARC 42 strain without the addition of oil and/or with the addition of oil. Abbreviations: RE – respiratory epithelium; MK – mucoid cells; NE – immature erythrocyte; Li- lymphocyte; Mo – monocyte. Note:* - values statistically significantly different from the control at td = 2.77, p≤0.05
Исследуемый штамм не оказывал негативного воздействия на организмы фитобентоса до концентрации 1 мл/л (на примере Zostera marina, Chaetomorpha linum). При этом, хетоморфа оказалась более чувствительной к воздействию штамма. Так, для ARC 42 в концентрации 2,5 мл/л наблюдалась стимуляция роста таллома, а при концентрациях 7,5 и 10 мл/л было выявлено ингибирование роста. Организмы зообентоса (Gammarus duebeni) не реагировали на присутствие в водной среде исследуемого штамма в концентрации менее 2,5 мл/л как при добавлении, так и без добавления нефти.
Исследуемые виды рыб (Poecilia reticulata, Oryzias latipes) продемонстрировали низкую чувствительность к воздействию данного препарата (рис. 3). Показатель ЛК50 за 96 часов для мальков гуппи составил: для штамма ARC 42 – 14,02 мл/л. Безопасная концентрация, не оказывающая воздействия на мальков гуппи в хроническом опыте, составила 5 мл/л. Влияние на эмбриональное развитие Oryzias latipes было установлено только при концентрации более 15 мл/л для штамма ARC42 с добавлением нефти (рис. 3, б, в). Высокие концентрации исследуемого штамма также влияли на физиологические функции рыб. Так, концентрации выше 7,5 мл/л приводили к нарушениям жаберного аппарата, выражающегося в отслоении респираторного эпителия и гипертрофии мукоидных клеток (рис. 3, д, е). Изменения также наблюдались в лейкоцитарной формуле гуппи. Штамм ARC 42 приводил к достоверному уменьшению числа лимфоцитов в периферической крови рыб в концентрациях 7,5 и 10 мл/л.
Исследование возможной генотоксичности изучаемого штамма и метаболитов в присутствии углеводородов нефти, с помощью микроядерного теста на эритроцитах Poecilia reticulata, показало отсутствие увеличения встречаемости цитогенетических нарушений во всех исследуемых концентрациях.
Все вышеперечисленные звенья модельного гидробиоценоза не лимитировали по токсическому воздействию на изучаемый штамм микроорганизма. При этом, проведение экспериментов показало безопасность
Выводы
1. Штамм-деструктор нефти Arthrobacter psychrochitiphilus ARC 42, взаимодействуя с естественной микрофлорой воды, может вызвать стимуляцию ее развития при внесении в концентрации более 0,5 мл/л (500 мг/л; 0,5*105 КОЕ/л). Во всех исследуемых концентрациях с добавлением и без добавления нефти угнетения развития сапрофитов установлено не было.
2. Диатомовая водоросль Phaeodactylum tricornutum являлась лимитирующим звеном, так как уже при воздействии исследуемого штамма в концентрации 1 мл/л (1000 мг/л; 1*105 КОЕ/л) без добавления нефти отмечалась стимуляция роста культуры. При добавлении нефти на 3 и 5 сутки хронического опыта отмечалось ингибирование ее роста.
3. Зоопланктон, фитобентос и зообентос оказались не чувствительными к воздействию исследуемого штамма микроорганизма и токсический эффект проявлялся только в самых больших концентрациях
4. Исследуемый штамм не оказывал влияния на выживаемость рыб на всех стадиях развития. Эффект был выявлен по ряду гистологических и гематологических показателей в концентрациях более 0,5*105 КОЕ/л.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов в работу: Никифоров-Никишин Д.Л. – экспериментальная часть, анализ данных, подготовка основного текста. Гавирова Л.А. – анализ данных, корректировка текста; Щербакова П.А. – подготовка культуры на исследование; Шестаков А.И. – идея статьи, проверка текста статьи; Давыдова О.А. – подготовка к печати, окончательная проверка текста; Сережкин И.Н. – идея статьи, корректировка текста
The authors advertise the rejection of the conflict of intersections.
The authors' contribution to the work: Nikiforov-Nikishin D.L. – experimental frequency, data analysis, preparation of the main text. Gavirova L.A. – data analysis, texture correction; Shcherbakova P.A. – preparation of cultures for research; Shestakov A.I. – idea Status, text verification status; Davydova O.A. – preparation for the oven, window texture check; Seryozhkin I.N. – idea Status, texture correction.
1. Ivanova A.V. (2023). Development of the Arctic region: problems and priorities // Collection of materials of the IV All-Russian Scientific and practical Conference. Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, Federal State Educational Institution of Higher Education "Northern (Arctic) Federal University named after M.V. Lomonosov". Pp. 787-790. (In Russ.).
2. Masloboev V.A. (2020). Nature-like technologies in the mining complex of the Arctic. Collection of scientific materials of the All-Russian conference with international participation dedicated to the 90th anniversary of the birth of akad. Nikolai Pavlovich Laverov. / ed. by A.O. Gliko, A.A. Baryakh, K.V. Lobanov, I.N. Bolotov. Arkhangelsk: Federal Research Center for the Integrated Study of the Arctic named after Academician N.P. Laverov of the Russian Academy of Sciences. Pp. 43-48. (In Russ.).
3. Patin S.A. (2017). Oil and ecology of the continental shelf: in 2 vols. 2nd ed. revised and supplemented //Moscow: VNIRO. P. 326. (In Russ.).
4. Pogrebov V.B. (2010). Integral assessment of the ecological sensitivity of bioresources of the coastal zone to anthropogenic impacts // Basic concepts of modern coastal management. Vol. 2. St. Petersburg: Publishing House of RGGMU. Pp. 43-85. (In Russ.).
5. Shaikhiev I.G., Yarochkina A.N., Gafarov R.R., Miroshnichenko N.A., Seitova S.A. (2021). Chemical, physico-chemical and biological methods of neutralization of oily waste // Collection of reports of the All-Russian scientific conference Safety, protection and protection of the environment: fundamental and applied research. Belgorod: Belgorod State Technological University named after V.G. Shukhov. Pp. 187-196. (In Russ.).
6. Rosenberg E. (2013). Hydrocarbon-oxidizing bacteria //The Prokaryotes: Prokaryotic Physiology and Biochemistry. Pp. 201-214.
7. Semenova E.M., Babich, T.L., Sokolova D.S., Ershov A.P., Raievska Y.I., Bidzhieva S.K., Stepanov A.L., Korneykova M.V., Myazin V.A., Nazina T.N. (2022). Microbial communities of seawater and coastal soil of Russian Arctic Region and their potential for bioremediation from Hydrocarbon Pollutants //Microorganisms. Vol. 10. No. 8. p. 1490.
8. Gogoleva O.A., Nemtseva N.V. (2012). Hydrocarbon-oxidizing microorganisms of natural ecosystems //Bulletin of the Orenburg Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences. No. 2. (In Russ.).
9. Fedorenko V.N., Serezhkin I.N., Lamova Ya.A., Knyazyuk M.K., Netrusov A.I., Shestakov A.I. (2015). Properties of natural hydrocarbon-oxidizing microbial communities for utilization of oil pollution in the Northern regions // Biotechnology. No.6. Pp. 72-78. (In Russ.).
10. Malavenda R., Rizzo C., Michaud L., Gerçe B., Bruni V., Syldatk C., Hausmann R., Giudice L. (2015). Biosurfactant production by Arctic and Antarctic bacteria growing on hydrocarbons //Polar Biology. Vol. 38. no. 10. Pp. 1565-1574.
11. Shestakov A.I., Fedorenko V.N., Vinogradova E.N., Sadraddinova E.R., Abramov S.M., Shestakova O.O., Netrusov A.I. (2013). Microbial preparation for utilization of hydrocarbon pollution of the coastal zone of the Arctic seas // Oil. Gas. Innovations. vol. 177. no. 10. Pp. 47-50. (In Russ.).
12. Sidorenko M.L., Rusakova D.A. (2022). Diversity of psychrophilic bacteria and their biotechnological potential (review) // Bulletin of Tomsk State University. Biology. No. 58. Pp. 28-54. (In Russ.).
13. Methodological guidelines for the development of water quality standards for water bodies of fishery significance, including standards for maximum permissible concentrations of harmful substances in the waters of water bodies of fishery significance (as amended on December 22, 2016), Order of Rosrybolovstvo No. 695 of 04.08.09. (In Russ.).
14. Kochetkov N.I., Smorodinskaya S.V., Nikiforov-Nikishin D.L., Klimov V.A., Golovacheva N.A., Nikiforov-Nikishin A.L., Grozescu Y.N. (2022). Evaluating possible genotoxicity of three feed additives recommended for aquaculture by using micronucleus test on Danio rerio erythrocytes // Vestnik of Astrakhan State Technical University. Series: Fishing Industry. No. 3. Pp. 48-59.
15. R Core Team (2021). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org. (Date of request )
16. RStudio Team (2020). RStudio: Integrated Development for R.RStudio, PBC, Boston, MA URL http://www.rstudio.com . (Date of request )
17. Klishevich N.G., Ananyeva I.N., Aleshenkova Z.M. (2020). Phytostimulating activity of microorganisms-oil destructors //Microbial biotechnologies: fundamental and applied aspects. Pp. 440-446. (In Russ.).
