Russian Federation
Vladivostok, Vladivostok, Russian Federation
student
Russian Federation
UDK 639.2.03 Воспроизводство рыбных запасов
The paper presents the results of selecting methods for establishing the growth rate, generation time and doubling of the biomass of yeast cells Rhodotorula spp., which are part of probiotic feed preparations for aquaculture objects. The identified atypical period of the lag phase was observed on both studied nutrient media (Lundin, YEPD), where instead of an increase in the biomass of the culture, some of the introduced cells died. The results obtained provide the basis for further study and search for new highly productive strains of Rhodotorula spp., selection of technological regimes for obtaining feed preparations based on them, modification and optimization of the composition of the culture medium to increase the growth of yeast biomass.
microbiological feed, aquaculture, optimization, Rhodotorula spp., cultivation, probiotics, growth rate, biomass
Основной проблемой при воспроизводстве объектов аквакультуры является ослабление иммунитета гидробионтов и подверженность множеству заболеваний, вызываемых патогенами [1]. В настоящее время, для корректировки механизмов иммунной защиты и уменьшения влияния неблагоприятных факторов среды, активно используются пробиотически-активные микроорганизмы [2]. Пробиотическая активность может быть опосредована множеством факторов – дозировкой, продолжительностью и маршрутом лечения. Некоторые пробиотики оказывают положительное воздействие, вырабатывая антибактериальные молекулы, ингибирующие другие микроорганизмы или вирусы, тогда как другие ингибируют бактериальные движение через стенку кишечника (транслокация), усиливают барьерную функцию слизистой за счет увеличения продукции молекулы врожденного иммунитета или модулируют воспалительную/иммунную реакцию [2]. В литературных источниках описаны результаты научных исследований по использованию пробиотиков разной природы при искусственном воспроизводстве гидробионтов в разных странах [1]. Причем, описаны как преимущества, так и недостатки использования бактерий и дрожжей в зависимости от химического состава микробных клеток [1]. Согласно результатам исследований, Rhodotorula benthica D30 можно рассматривать, как потенциальный пробиотик, способный оказывать положительное влияние на показатели роста, активности пищеварительных ферментов и иммунитет молоди трепанга [3].
Однако использование пробиотиков в аквакультуре остается на стадии развития. В литературе все еще представлены неполные сведения о биохимическом составе, свойствах и роли симбионтной микрофлоры культивируемых гидробионтов, участвующей в борьбе с патогенными микроорганизмами [1]. Немаловажен и тот факт, что остановка импорта кормов поставила аквакультурные предприятия в сложное положение.
Авторами настоящего сообщения ранее были проведены исследования и получены положительные результаты о возможности использования красных дрожжей для кормления иглокожих на личиночных стадиях [4-7], была научно обоснована биотехнология получения кормового препарата пробиотической направленности на основе дрожжей Rhodotorula benthica, разработана лабораторная методика способа определения антагонистической активности дрожжей Rhodotorula spp. Ранее полученные результаты требуют дальнейшего изучения и поиска новых высокопродуктивных штаммов Rhodotorula spp. с последующим депонированием, подбором технологических режимов получения кормового препарата на основе, выделенных из новых источников, высокопродуктивных штаммов, модификации и оптимизации состава культуральной среды для повышения роста биомассы дрожжей.
Цель настоящей работы – подбор методов установления скорости роста, времени генерации и удвоения биомассы дрожжевых клеток Rhodotorula spp.
Изучение процессов роста дрожжевой культуры Rhodotorula spp., с целью выявления их физиологических особенностей и установления параметров роста, проводили нефелометрическим методом [8]. Величина светорассеяния (D, оптическая плотность) измерялась фотоэлектроколориметром (ФЭК) КФК-2-УХЛ4.2. Длина волны – 540 Нм, толщина кювет – 3,070 мм. Одновременно производили подсчет количества клеток в единице объема прямым подсчетом с помощью счетной камеры Горяева. Полученную зависимость выражали графически, откладывая на вертикальной оси количество клеток, содержащихся в 1 см3 культуральной среды, а на горизонтальной – показания ФЭК. Для культивирования дрожжей применяли питательные среды Лундина и YEPD [6].
При культивировании дрожжей Rhodotorula spp. периодическим методом (закрытая система) при 25ºС установлено, что популяция микроорганизмов проходит определенные циклы развития, выражающиеся в изменении фаз или периодов. Последовательность смены фаз выражена графически в виде кривых (рис. 1, 2). Полученные кривые разделили на периоды, в зависимости от того, как микроорганизмы вели себя в каждом конкретном случае.
Описание роста микроорганизмов в решающей степени зависит от кинетической модели, используемой для передачи информации, связанной с ростом. На основе изученной литературы установлено, что модель роста для исследуемой дрожжевой культуры Rhodotorula spp., в условиях нашего эксперимента, можно рассматривать как сложную структурированную модель, которая описывает рост клеток, как совокупный результат метаболических реакций [9].
Обозначение фаз роста: I – лаг-фаза; II – экспоненциальная; III – стационарная; IV – фаза отмирания; V – фаза выживания
Рисунок 1. Кривая роста дрожжей Rhodotorula spp. на среде Лундина
Figure 1. Growth curve of the yeast Rhodotorula spp. on Lundin
|
IV |
|
V |
|
I |
Обозначение фаз роста: I – лаг-фаза; II – замедление роста; III – экспоненциальная; IV – стационарная; V – фаза отмирания
Рисунок 2. Кривая роста дрожжей Rhodotorula spp. на среде YEPD
Figure 2. Growth curve of the yeast Rhodotorula spp. on YEPD
Временное замедление роста дрожжевых клеток (3 суток) в сложной среде YEPD, вероятно, связано с необходимостью к адаптации микроорганизмов к новой питательной среде без значительной репликации клеток и признаков их роста. При этом стоит отметить, что в исследуемый период на 3 сутки отмечено появление первых признаков каротиногенеза, определяемых визуально образованием пристеночного кольца характерного розового цвета на поверхности питательной среды YEPD.
Наблюдение за клетками, находящимися в экспоненциальной фазе (2 суток) показывает, что процесс роста в этом случае протекает сбалансированно, то есть увеличение биомассы сопровождается увеличением количества живых клеток.
Рост дрожжей прекращался на среде Лундина на 3 сутки, когда в 1 мл накопилось 5,4·107 клеток, в то время как на среде YEPD на 6 сутки в 1 мл накопилось 1,3·107 клеток. Путем анализа литературы установлено, что к этому моменту в исследуемых средах исчерпываются источники азота и углерода. Вместе с тем, можно полагать, что к этому времени в культуральной среде накопились продукты обмена, также выступающие в роли фактора, ограничивающего рост.
Как уже отмечалось, культуры, достигшие стационарной фазы роста, накапливают максимальную величину биомассы. Так, например, на среде Лундина разницу (38%) между биомассой и числом живых клеток, вероятно, можно объяснить увеличением количества мертвых клеток. В то время как на среде YEPD отмечена незначительная разница (10%) между количеством биомассы и живых клеток, однако стоит предположить, с учетом собственных наблюдений, что это связано не с увеличением количества мертвых клеток, а с накоплением продуктов каротиногенеза исследуемой культуры дрожжей.
В фазе гибели или отмирания кривая роста падает вниз, так как число живых клеток в культуре уменьшается. Известно, что при периодическом культивировании, фаза гибели наступает потому, что происходит накапливание различных продуктов обмена, при этом запас компонентов питательной среды исчерпывается.
Используя первичное переменное состояние (биомасса), которое измеряется непосредственно в культуре клеток, произвели пересчет во вторичные характеристики роста называемыми параметрами (абсолютная и удельная скорости роста). Полученные расчетные значения параметров отображены графически, в зависимости от продолжительности культивирования (рис. 3, 4).
Рисунок 3. Динамика абсолютной скорости роста дрожжей на средах Лундина и YEPD
Figure 3. Dynamics of the absolute growth rate of yeast on Lundin and YEPD
|
μmax |
|
μmax
|
Рисунок 4. Динамика удельной скорости (μ) роста дрожжей на средах Лундина и YEPD
Figure 4. Dynamics of specific rate (μ) of yeast growth on Lundin and YEPD
Параметр μmax имеет очень важное биологическое значение, это верхний предел изменения скорости в определенной питательной среде. Из данных графика видно, что μmax на среде YEPD составляет 0,76 сут-1, в то время как на среде Лундина данный параметр составляет 0,72 сут-1.
Как известно, существует зависимость между удельной скоростью роста и концентрацией субстрата, лимитирующего рост, что дает основание для продолжения работы в данном направлении. Проведенные нами исследования позволяют сделать следующее заключение. Модель роста для исследуемой дрожжевой культуры Rhodotorula spp. в условиях эксперимента можно рассматривать как сложную структурированную модель, которая описывает рост клеток как совокупный результат метаболических реакций. Нетипичный период лагфазы наблюдается на обеих исследуемых питательных средах (Лундин, YEPD), где вместо прироста биомассы культуры происходит отмирание части внесенных клеток. Скорость прироста биомассы на среде YEPD достигает максимального значения на 6 сутки, а на среде Лундина – на 1 сутки.
В настоящее время, развитие аквакультуры, традиционной и органической, лимитируется отсутствием кормов [10; 11], разработка и производство которых сдерживается ограниченностью, высокой стоимостью и низкой экологичностью используемого сырья. Интеграция инновационных подходов к производству кормов, основанных на технологиях устойчивого ресурсоэффективного производства – возможные пути решения, способствующие развитию аквакультуры.
Работа выполнена при финансовой поддержке НИР № 822/2023 «Научное обоснование получения кормовых препаратов пробиотической направленности на основе биомассы дрожжей Rhodotorula spp., предназначенных для выращивания объектов аквакультуры».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад в работу авторов: Матросова И.В. – идея, подготовка и окончательная проверка статьи; Панчишина Е.М. – сбор и обработка первичных материалов, анализ данных, подготовка статьи; Политаева А.А. – подготовка обзора литературы, подготовка статьи; Корниенко Н.Л. – сбор и обработка первичных материалов, анализ данных, подготовка статьи. Все авторы участвовали в обсуждении результатов.
The authors declare that there is no conflict of interest.
Contribution to the work of the authors: Matrosova I.V. – idea, preparation and final verification of the article; Panchishina E.M. – collection and processing of primary materials, data analysis, preparation of the article; Politaeva A.A. – preparation of literature review, preparation of the article; Kornienko N.L. – collection and processing of primary materials, data analysis, preparation articles. All the authors participated in the discussion of the results.
1. Bogatyrenko E.A. (2007). Probiotics and their use in mariculture // Izvestiya TINRO. Vol. 157. Pp. 189-196. (In Russ.).
2. Lone Graham, J. Melchiorsen, Bettina Spanggaard, I. Huber, T.F. Nielsen. (1999). Inhibition of Vibrio anguillarum Pseudomonas flourescens AH2 - a possible way to treat fish with probiotics // Applied Microbiology and ecological Microbiology. Volume 65. Pp. 969-973. (In Russ.).
3. Ji-hui Wang, Liu-qun Zhao, Jin-feng Liu, Han Wang, Shan Xiao. 2015. The effect of the potential probiotic Rhodotorula benthica D30 on growth indicators, activity of digestive enzymes and immunity of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus // Immunol of fish and shellfish. Volume 43, No. 2. Pp. 330-336. doi:https://doi.org/10.1016/j.fsi.2014.12.028.
4. Politaeva A.A. (2020). The use of red yeast R. benthica in the cultivation of larvae of the Far Eastern sea cucumber // Complex research in the fisheries industry: materials in the scientific and technical International Conference of students, postgraduates and young scientists. Vladivostok. Pp. 33-35. (In Russ.).
5. Matrosova I.V., Panchishina E.M., Politaeva A.A., Kornienko N.L. (2021). Use Rhodotorula benthica yest for feeding echinoderms // IOP Conference Series: Earth and Environment Science, Krasnoyarsk, November 18-20, 2020 / Krasnoyarsk Scientific and Technical City Hall. Krasnoyarsk: VGD Publishing House LLC. No. 677. p. 42029. DOIhttps://doi.org/10.1088/1755-1315/677/4/042029.
6. Panchishina E.M., Kornienko N.L., Matrosova I.V. (2022). Development of the optimal composition of the nutrient medium for cultivating yeast in the cultivation of invertebrates // Fisheries. No. 2. Pp. 76-80. DOIhttps://doi.org/10.37663/0131-6184-2022-2-76-80. (In Rus., abstract in Eng.).
7. Matrosova I.V., Panchishina E.M., Politaeva A.A., Kornienko N.L. (2022). Probiotic feed preparations for aquaculture facilities to ensure sustainable development and conservation of biological diversity of species // IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science. № 981. P. 022003. DOIhttps://doi.org/10.1088/1755-1315/981/2/022003.
8. Zhdan-Pushkina S. M., Sarya Mahmud-kyzy. (1983). Fundamentals of microbial culture growth: Leningrad: LSU Publishing House. 187 p. (In Russ.).
9. Mu-Yang M., Butler M., Webb S., Moreira A., Grodzinski B., Tsui Z., Agatos S. (2011). Complex biotechnology // Elsevier. 5320 p.
10. Lagutkina L.Yu. Ponomarev S.V. (2018). Organic aquaculture as a promising direction for the development of the fisheries industry (review) // Agricultural biology. vol. 53, No. 2. Pp. 326-336. DOIhttps://doi.org/10.15389/agrobiology.2018.2.326rus. (In Russ.).
11. Edwards P. (2015). Interaction of aquaculture with the environment: past, present and probable future trends // Aquaculture. Volume 447. Pp. 2-14.
