产卵用果蝇准备
Preparation of the Flies   

材料与试剂

1. 标签纸3M（3M中国有限公司，3M，货号:244）
2. 废果蝇收集瓶（自制，见图1）
3. 分蝇笔（自制，见图2）
4. 无尘纸（金佰利（中国）有限公司，Kimtech，货号:34155）
5. 果蝇培养管（海门市爱科特实验器材经营部）
6. 果蝇培养管塞（海门市爱科特实验器材经营部）
7. 果蝇培养管置放盘（海门市爱科特实验器材经营部）
8. 果蝇培养瓶（海门市爱科特实验器材经营部）
9. 果蝇培养瓶塞（海门市爱科特实验器材经营部）
10. 果蝇培养瓶置放盘（海门市爱科特实验器材经营部）
11. 玉米粉（黑龙江北纯农产品开发有限公司，北纯）
12. 大豆粉（黑龙江北纯农产品开发有限公司，北纯）
13. 蔗糖（白砂糖）（国药集团化学试剂有限公司，沪试，货号:10021463）
14. 麦芽糖（上海畅硕生物科技有限公司，畅硕）
15. 高活性干酵母（高糖型）（英联马利（北京）食品销售有限公司，梅山）
16. 琼脂粉（上海益启生物科技有限公司，Sigma，货号:A1296-1KG）
17. 对羟基苯甲酸甲酯（也称尼泊金甲酯）（国药集团化学试剂有限公司，沪试，货号：30119416）
18. 苯甲酸钠（国药集团化学试剂有限公司，沪试，货号：30164817）
19. 丙酸（国药集团化学试剂有限公司，沪试，货号：81011918）
20. 无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，沪试，货号：10009218）
    

仪器设备

1. CO₂钢瓶（上海纵远化工有限公司）
2. CO₂麻醉台（海门市优嘉实验器材经营部）
3. 可倾式夹层电加热油锅（温州正发减速机械厂，100L）
4. 培养基分装器（海门市优嘉实验器材经营部）
   
5. 恒温恒湿培养箱（宁波江南仪器厂，型号：HWS-500）
6. 电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司，型号：DGG-9240A）
7. 体视显微镜（Olympus生物显微镜公司，型号：Olympus SZ61） 
8. 海尔电冰柜（海尔集团，海尔，型号：BC/BD-220SE）
   

实验步骤

一、果蝇培养基配制

1. 果蝇培养基原料种类：玉米粉，大豆粉，蔗糖（白砂糖），麦芽糖，高活性干酵母（高糖型），琼脂粉，防腐剂（对羟基苯甲酸甲酯也称尼泊金甲酯、苯甲酸钠、丙酸等），所有原料均需妥善保管，有条件都4 °C冷藏。
2. 果蝇培养基配方：名称：玉米粉果蝇培养基，成分如下表，防腐剂特殊实验可不加。
   

   玉米粉果蝇培养基（总体积1L）
   成分名称	质量（克/g）
   玉米粉	66.825
   大豆粉	9.18
   蔗糖（白砂糖）	40
   麦芽糖	42.4（用125 mL水化开后加入）
   酵母	25
   琼脂粉	6
   防腐剂(对羟基苯甲酸甲酯也称尼泊金甲酯）	0.25（用2.5 mL 95%乙醇溶解后加入）
   防腐剂（苯甲酸钠）	1
   防腐剂（丙酸）	6.875 mL（温度降至60℃-70℃加入）

   
   
3. 大量培养基配制方法：煮沸法（60 L）
   1. 先在可倾式夹层电加热油锅中加15 L（总量的1/4）的水，边搅拌边加热。
   2. 按配方称取玉米粉、大豆粉、蔗糖、麦芽糖、琼脂粉等原材料用冷水搅拌均匀加入锅中。
   3. 按配方称取干酵母粉用25 °C到30 °C温水混匀活化15 min后加入锅中。
   4. 加水到总体积为60 L，边搅拌边加热，煮沸后保持沸腾状态20分钟，关火降温。
   5. 培养基温度降到60 ℃-70 ℃时添加防腐剂，搅拌均匀。
   6. 用培养基分装器分装。常规杂交实验培养基量为培养容器体积的1/5，保种实验培养基量为培养容器体积的3/10。
   7. 分装好后用透气袋包装放在阴凉通风处降温冷凝，散发水汽12-16 h。
   8. 晾好后换成不透气保鲜袋包装保鲜，4 ℃冷藏。
   9. 在2-3周内用完。
      
      
      

1. 明确基因型
2. 根据基因型在体视显微镜下观察其本身特征和平衡子（balancers）
3. PCR检测突变基因
   
   
   

三、果蝇培养
对于胚胎收集用果蝇，我们需要在尽可能短的时间内收集到足够数量的果蝇用于实验，且必须保证质量。果蝇的成熟度对产卵来说非常重要，要严格控制温湿度，并用标签纸标记好基因型和日期。产卵率低的果蝇品系需要准备更大的量。胚胎期、幼虫期及成虫期有致死的果蝇一般难以获得大量果蝇，导致不能在短期内（30 min）收集到足够的卵，不适合用于显微注射用胚胎收集。
正常用于胚胎收集的果蝇品系仅一种，采用以下培养方法（3.1-3.5）。

1. 将果蝇转入果蝇管，在25 °C和60%相对湿度下培养。若果蝇较多可以直接放在果蝇瓶培养。每个果蝇管15-20只，果蝇瓶50-80只。
2. 培养2 d后将果蝇转到新管（瓶），纯种（单基因型）果蝇正常不经麻醉直接更换培养基。轻扣亲代老管将果蝇收集到底部，迅速拔掉瓶塞，将装培养基新管（瓶）口对口倒置于老瓶上，翻转，轻扣老管（瓶）将果蝇转到新管（瓶）中，快速塞好塞子。
3. 转管（瓶）2-3次后将管（瓶）中亲代老果蝇清空。
4. 出F1代成虫后重复步骤1-3，继续扩繁一代，就能得到足够用于产卵的果蝇。
5. 收集羽化48h的果蝇约1500-2000只，分装于6个果蝇瓶内备用。
   有些显微注射实验中，需要使用两个果蝇品系杂交后产的卵。例如attp果蝇品系和phic31果蝇品系，attp有很多个不同位点的果蝇品系，而与之配对的phic31果蝇品系仅一个。就扩繁attp果蝇选取雄蝇，扩繁双倍的phic31果蝇选取处女蝇，使用前两天按1：2比例混合，接近1：1更好。
6. 按步骤3.1-3.4分别将用于选取雄蝇品系和用于选取处女蝇品系扩繁到合适数量, 选取雄蝇品系3-4个大瓶，选取处女蝇品系6-8个大瓶。
7. 选取羽化48 h内雄蝇750-1000只。理论上杂交所需的雄蝇可以随时收集，但它们在3天或老一点时与处女蝇交配最有效，大于10-15 d的雄蝇没有交配能力了。
8. 选取处女蝇750-1000只。理论上25 °C条件下，新羽化8小时内雌蝇不会与雄蝇交配，都可以视为处女蝇。但由于人工控温的多变性和不均衡性，采用这个方法会误判。最精确的方法是查看胎粪，在处女蝇透明腹部能看到黑点，这就是明显胎粪。用CO₂麻醉果蝇，然后置于CO₂麻醉台上认真挑选。挑选后置放48 h，看有无幼虫发育，若没有幼虫在培养基中蠕动，才能保证你的果蝇是处女蝇。处女蝇挑选在早晨和之后的8小时内比较容易得到。早晨是大多数蛹羽化成成虫的时候（培养箱按昼夜规律照明），这是昼夜规律决定。低温条件使果蝇发育显著减慢，为了能在早晨收集更多处女蝇，在头一天收集完后，将果蝇置于18 °C过夜。对于很多杂交，为了控制非处女蝇的出现，可以使用“处女标记”——雌蝇带有的纯合隐性突变标记，在杂交后变为杂合体。如果子代带有这一标记，它们就不是处女蝇的后代。尽管果蝇羽化成成虫性别比例为1：1，但每天收集的果蝇并不一定如此。雌蝇比雄蝇发育快，故在最初出生的新蝇中雌蝇比例高，所以在羽化早期能得到更多处女蝇。根据果蝇生活史，一般周五开始做杂交，子代将在10天后也就是下下周一羽化。这样可以比较轻松在3-4 d收集足够的处女蝇和雄蝇。
9. 将选取的雄蝇和处女蝇在注射前两天混合交配。
   

1. 废果蝇收集瓶制备：漏斗，500 mL塑料瓶，75%酒精
2. 在500 mL塑料瓶中加入75%酒精100 mL，将漏斗架于瓶口，成品见图1。
   
   
   
   图1. 废果蝇收集瓶.
   
   
3. 分蝇笔制备：一次性移液管，3M标签纸，鸭右翅硬杆毛
   将鸭右翅硬杆毛插入一次性移液管，用3M标签纸缠绕封住，成品见图2。
   
   
   图2. 分蝇笔 .

致谢

感谢中华人民共和国科学技术部2021YFA0805800和中国科学院的支持。
感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心公共技术中心果蝇资源与技术平台的工作和经费支持。

参考文献

1. 吴薇. (2018). 果蝇实验室筹建和规范化管理研究. 安徽农学通报, 27（18）: 147-148.
2. Ralph J. (1997). Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press.