Developing inhibitors of the enzyme ‘TRMT2a’ for the treatment of PolyQ diseases

Margreiter, Michael Alois; Rossetti, Giulia; Bolm, Carsten; Weinhold, Elmar; Niggemann, Meike

doi:10.18154/RWTH-2020-06466

Developing inhibitors of the enzyme ‘TRMT2a’ for the treatment of PolyQ diseases

Margreiter, Michael Alois^RWTH*

2020

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Mag. Michael Alois Margreiter

ImpressumAachen 2020

Umfang1 Online-Ressource (xix, 134 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Bolm, Carsten (Thesis advisor)^RWTH* ; Weinhold, Elmar (Thesis advisor)^RWTH* ; Rossetti, Giulia (Thesis advisor)^RWTH* ; Niggemann, Meike (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2020-05-26

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-06466
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/792891/files/792891.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
drug discovery (frei) ; in silico (frei) ; molecular dynamics (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Obwohl die jeweiligen Ursachen aller neun Polyglutaminerkrankungen schon seit Jahrzehnten bekannt sind, gibt es bisher keine zugelassenen kurativen Therapien. Gängige Ansätze stellen die Symptomlinderung in den Mittelpunkt. Das ist insofern bemerkenswert, als dass diese Erkrankungen auf einzelne Mutationen in den krankheitsrelevanten Genen zurückzuführen sind. Eine weitere herausragende Gemeinsamkeit dieser Erkrankungen ist die Bildung von unlöslichen Aggregaten der mutierten Proteine in bestimmten Zellpopulationen des Gehirns, oft bereits ab der Lebensmitte. Deshalb besteht ein offensichtlicher Bedarf an effektiven und neuroprotektiven Strategien, welche imstande sind, den Zeitpunkt des Einsetzens sowie das Fortschreiten dieser letztendlich tödlichen Erkrankungen hinauszuzögern. In diesem Sinne konnten frühere Untersuchungen an der Uniklinik Aachen (Dr. Voigt, Neurologie) zeigen, dass tRNA Methyltransferase 2 Homolog A (TRMT2a) ein effektiver Modulator, der durch die Polyglutaminerkrankungen induzierten Neurotoxizität ist. Rechnergestützte Biologie umfasst eine Vielzahl von Methoden, mit dem Ziel die oftmals heterogenen biologischen Datensätze einzuordnen. Dieses aufstrebende Forschungsfeld konnte bereits substanzielle Beiträge zu unserem Verständnis der molekularen Grundlagen von Gesundheit und Pathogenese leisten- wie auch im Falle der Polyglutaminerkrankungen. Zudem kann ein detailliertes Verständnis dieser Prozesse zur Entdeckung und Entwicklung von neuartigen Wirkstoffen verwendet werden, auch bekannt als computergestütztes Wirkstoffdesign (CADD). In dieser Dissertation kommen derartige state-of-the-art Ansätze zur Anwendung, um Einblicke in das Protein TRMT2a auf Sequenz- und Strukturniveau zu erhalten. Dazu verglich ich die Sequenz von TRMT2a mit eng verwandten Sequenzen und identifizierte zunächst evolutionär konservierte Residuen. Da zu Beginn dieser Arbeit keine strukturellen Informationen zum Protein vorlagen, erstellte ich Homologiemodelle. Diese Untersuchungen erlaubten schlussendlich die Auswahl eines geeigneten Proteinfragmentes. Dieses Fragment konnte exprimiert/aufgereinigt werden und führte darüber hinaus zur ersten Kristallstruktur einer Domäne von TRMT2a (Prof. Niessing, Universität Ulm). Des Weiteren wollte ich herausfinden, ob eine pharmakologische Inhibition von TRMT2a ähnlich neuroprotektive Effekte wie der entsprechende knock-down zeigen würde. Daher untersuchte ich die Apostruktur der besagten Domäne nach Bindetaschen, welche die Bindung etwaiger niedermolekularer Stoffe ermöglichen würden. Leider konnte ich keine geeignete Tasche in der Kristallstruktur detektieren. Letztendlich repräsentiert eine Kristallstruktur jedoch nur einen sehr begrenzten Konformationsraum, wohingegen Proteine in Lösung oftmals viele verschiedene Konformationen einzunehmen imstande sind. Nachdem ich zunächst das kristallographische Wassernetzwerk analysiert hatte, erweiterte ich deshalb meine Suche nach einer geeigneten Bindetasche indem ich auch dynamische Aspekte der Domäne in meine Modelle miteinbezog. (i) Anfänglich verwendete ich Methoden, die auf maschinellem Lernen beruhen, um Residuen vorherzusagen, welche zu lokaler Flexibilität im Protein führen (ii) allosterische Kommunikationsnetzwerke der Residuen untereinander beschreiben um darauf aufbauend (iii) molekulardynamische Simulationen in implizitem Solvent mit störungstheoretischen Ansätzen durchzuführen. In diesen Analysen zeichnete sich eine transiente Bindetasche ab, welche zudem adäquat schien, auch niedermolekulare Stoffe zu binden. Um ein detaillierteres Verständnis der Bildung und des Kollapses dieser Tasche zu erhalten führte ich extensive (iv) molekulardynamische Simulation in explizitem Solvent, d.h. mit einem atomistischen Wassermodell, durch. Darauf basierend selektierte ich eine geeignete Konformation der Domäne und führte ein virtuelles Screening mit kommerziell verfügbaren Chemikalien durch. Ich wählte mehrere (zur Bindetasche komplementäre) Chemikalien aus und Dr. Voigt's Labor testete diese \textit{in vitro} zuerst in HEK Zelllinien. Es zeigte sich, dass zahlreiche dieser Chemikalien ähnlich effizient wie der knock-down von TRMT2a im Stande waren, polyglutamin-induzierte Toxizität zu reduzieren, während keine weitere Besserung bei Zellen festgestellt werden konnte, bei denen TRMT2a praktisch nicht vorhanden war. Es könnte deshalb sein, dass mehrere dieser Chemikalien tatsächlich TRMT2a inhibieren. Darüber hinaus konnte Prof. Niessing's Labor für ein wirksames Molekül eine dosisabhängige Bindung an die Domäne in Surface Plasmon Resonance (SPR) Versuchen nachweisen. Interessanterweise konnten einige dieser Chemikalien die Anzahl toxischer Aggregate auch in Fibroblasten, welche von polyglutamin-erkrankten Patienten gespendet wurden, drastisch reduzieren. Dieser Effekt konnte zudem bei Fibroblasten mit anderen PolyQ-Erkrankungen nachgewiesen werden. Für diese chemischen Strukturen läuft derzeit in Kooperation mit den Forschergruppen von Prof. Shah und Prof. Schulz (beide Forschungszentrum Jülich), Dr. Voigt und Prof. Niessing, eine weltweite Patentanmeldung. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich die möglichen Konsequenzen einer gestörten TRMT2a Funktion. Meiner Arbeitshypothese nach, sollte eine verringerte TRMT2a Konzentration/Aktivität zu einer fehleranfälligeren Translation von Polyglutamin-Abschnitten führen. Unterbrochene Polyglutamin-Abschnitte erwiesen sich in früheren Studien als weniger toxisch, zudem werden in diesen Fällen weniger Aggregate beobachtet. Deshalb simulierte ich Konstrukte mit kontinuierlichen und unterbrochenen Polyglutamin-Abschnitten mithilfe von Replica Exchange Protein Monte Carlo Methoden und verglich die jeweiligen physikochemischen Eigenschaften, welche zu den experimentell beobachteten unterschiedlichen Aggregationsverhalten führen. Im dritten Teil meiner Dissertation, verwendete ich CADD um einen Einblick in Proteine zu gewinnen, die bei der Schmerzentstehung eine Rolle spielen. Dazu untersuchte ich in Kollaboration mit Prof. Gründers Team (Universitätsklinikum Aachen), wie das Peptid RPRFa (ein RFamid aus dem Gift der Kegelschnecke) den säureempfindlichen Ionenkanal 3 (ASIC3) bindet. Dieser protonengesteuerte Na Kanal ist bei Neuralgien von Bedeutung. Hier erstellte ich ein Homologiemodell und untersuchte in welcher Konformation diese Peptidgruppe den Kanal an welcher Stelle binden könnte. Auf Basis dieser Bindehypothesen, wählten ich mehrere Punktmutationen aus. Prof. Gründers Labor beurteilte ihre Auswirkungen mit elektrophysiologischen und UV-vernetzenden Methoden. In einem Folgeprojekt mit derselben Gruppe erstellte ich ein Modell eines Komplexes bestehend aus Dynorphin A (1-14) und ASIC1 basierend auf einem ähnlichen Ansatz. Zudem erweiterte ich diese Untersuchung mit molekulardynamischen Simulationen in explizitem Solvent. Zusammenfassend sind die Ergebnisse meiner Arbeit ein Hinweis darauf, dass rechnergestütze Ansätze in den Lebenswissenschaften nicht nur eine Interpretation der experimentellen Ergebnisse ermöglichen, sondern derartige Untersuchungen zudem leiten und komplementieren können, wenn solche Ansätze bereits im kritischen Anfangsstadium eines Projektes miteinbezogen werden.

Although the specific causes for all nine polyglutamine diseases were elucidated decades ago, treatment options remain scarce and predominantly focus on symptomatic relief. This is particularly striking as these neurodegenerative diseases are monogenetic. A common hallmark is the formation of mutant protein insoluble aggregates in vulnerable cell populations in the brain, often starting already at mid-life. Thus, there is a clear need for viable neuroprotective strategies that delay disease onset and progression of these fatal disorders. To this end, the protein tRNA methyltransferase 2 homolog A (TRMT2a) was discovered in earlier studies as a strong modulator of polyglutamine mediated toxicity (Dr. Voigt’s Lab, Institute of Neurology, RWTH University Hospital). Computational biology encompasses a wide range of computer-assisted biomodeling approaches. The resulting models aim to integrate often heterogeneous biological data and aid wet-lab experiments. This emerging field of research has contributed substantially to our understanding of the molecular foundations of health and pathogenesis, also in the context of polyglutamine diseases. Moreover, a detailed understanding of these processes can be leveraged to discover and design new drugs in silico- also known as computer-aided drug design (CADD). This thesis uses state-of-the-art CADD approaches to gain insights into TRMT2a at the sequence and structural level. First, I compared the sequence of TRMT2a with closely related ones to identify conserved residues. As I initially lacked structural information on TRMT2a, I generated comparative structural models that eventually enabled the selection of a suitable protein fragment corresponding to a protein domain of TRMT2a. This fragment was then successfully expressed/purified in Prof. Niessing‘s lab (University of Ulm), resulting in the first X-ray crystallographic structure of this domain. Subsequently, I investigated if a pharmaceutical inhibition of TRMT2a (function) might prove equally neuroprotective as silencing TRMT2a. Hence, I assessed whether TRMT2a is susceptible to small molecule modulators, e.g., if our recently crystallized TRMT2a domain would feature a binding site able to accommodate a small molecule ligand, ideally capable to cross the brain-blood-barrier. Unfortunately, I could not find such a site on the crystal structure of the domain. Nevertheless, proteins in solution typically explore vast conformational landscapes. Thus, after characterizing the crystallographic water network, I augmented my search for binding sites by also incorporating dynamical aspects of this domain into my models. (i) I employed machine-learning-based methods to predict residues giving rise to local flexibility in proteins (ii) allosteric communication networks within this domain, followed by (iii) molecular mechanics simulations in an implicit solvent with perturbation approaches. These analyses indicated a putative transient binding site capable of binding small molecules. (iv) To further understand the formation and collapse of such a transient pocket, I conducted molecular dynamics simulations in explicit solvent. Next, I selected a representative snapshot that featured the domain with a pocket conformation suitable to host a small molecule ligand and performed a virtual screening of commercially available compounds complementing this pocket. I prioritized multiple compounds, and these were tested by Dr. Voigt’s team in vitro on HEK cell lines. We found their efficacy in mitigating polyglutamine toxicity comparable to TRMT2a silenced cell lines, while not providing further benefits for already TRMT2a depleted cells lines. This indicates that these compounds might indeed interfere with TRMT2a. Moreover, for one compound, it was possible to show dose-dependent binding to the domain in surface plasmon resonance experiments (SPR). The latter analyses were performed in Prof. Niessing’s lab. Encouragingly, a few of these compounds also showed a rescuing effect on fibroblasts derived from patients, independent from their respective polyglutamine disorders. A worldwide patent application for these compounds involving the labs of Prof. Shah, Prof. Schulz (both Research Center Jülich), Dr. Voigt, and Prof. Niessing is currently underway. In the second part of my thesis, I explore the consequences of hampered TRMT2a activity and how this might give rise to reduced aggregate formation. I hypothesized that in the absence of TRMT2a, the translation of the polyglutamine tract becomes more error-prone and results in non-glutamine interruptions. Interrupted polyglutamine tracts are less toxic and result in fewer aggregates. To this end, I simulated uninterrupted and interrupted polyglutamine tract constructs with Replica Exchange Protein Monte Carlo methods and compared their respective physicochemical properties that give rise to their different aggregation propensities. In the third part of my thesis, I applied CADD techniques to two targets of interest for pain. Here, I investigated in collaboration with Prof. Gründer (University Clinic Aachen), how RPRFa, an RFamide peptide from the venom of a cone snail, binds to Acid-sensing ion channel 3 (ASIC3). This proton-gated Na channel plays a key role in neuropathic pain. Here, I build a comparative model and investigated in which conformation the peptide ligand could bind. Based on these models, I proposed several single-point mutants and Prof. Gründer's team assessed their effect with electrophysiology and UV-linking experiments. In a follow-up project with the same group, I mapped the binding site of Dynorphin A(1-14) to ASIC1 using a related approach augmented with explicit solvent simulations. Conclusively, the results presented in this thesis indicate that a computational approach to problems in the life sciences can not only facilitate the interpretation of experimental observations but also guide and augment them when they are introduced at the critical early stages of a project.

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