Легионеллезные пневмонии, по разным данным, составляют от 0,5 до 16% всех случаев инфекций нижних дыхательных путей [1]. Представители рода Legionella устойчивы во внешней среде и способны колонизировать водные системы, в том числе искусственные. Являясь факультативными внутриклеточными паразитами, представители вида L. pneumophila несут серьезные риски развития заболевания, особенно у иммунокомпрометированных людей, людей старшей возрастной группы, людей с сопутствующими заболеваниями дыхательных путей и факторами риска [2]. Существенная доля случаев пневмонии в РФ, в том числе с летальным исходом, имеет неуточненную природу, что может быть связано с несовершенством применяемых методов диагностики [3]. Между тем определение этиологического агента при пневмониях, особенно с тяжелым течением, играет значительную роль для выбора эффективной антибиотикотерапии и тактики лечения, а препаратами выбора в этом случае становятся фторхинолоны и макролиды как единственные препараты с доказанной эффективностью в отношении рода Legionella [2, 4].
В настоящее время для всех пациентов с диагнозом «пневмония» рекомендованы микробиологические исследования отделяемого дыхательных путей, выявление ДНК-возбудителя, выявление специфических иммуноглобулинов в динамике, а также экспресс-тесты на пневмококковую и легионеллезную антигенурию. Однако выполнение бактериологического посева с выделением и определением патогенной культуры занимает в среднем 4—5 сут, а отрицательный результат определения уринарного антигена легионелл и ДНК легионелл не исключает диагноза легионеллезной инфекции, поскольку эти тесты валидированы только для легионелл 1-й серогруппы. А нарастание титров антилегионеллезных антител определяется не ранее чем через 3 нед от начала заболевания [5]. Основным этиологическим агентом легионеллезных пневмоний действительно является L. pneumophila (до 90% случаев), а внутри этой группы превалируют легионеллы серогруппы I (не менее 80% случаев [6]). Но также патогенными для человека считаются представители иных серогрупп L. pneumophila, а кроме них, заболевание вызывают также L. micdadei, L. longbeacheae, L. dumoffii, L. bozemanii и некоторые другие [7].
Пептидогликан-ассоциированный липопротеин (peptidoglycan-associated lipoprotein, PAL) представляет собой белок внешней мембраны грамотрицательных бактерий, обеспечивающий в том числе патогенез бактерий. Белок PAL родоспецифичен для Legionella spp., может быть применен как для детекции легионелл, так и для иммунопрофилактики [8]. PAL можно определить в моче пациентов с легионеллезной пневмонией иммунохимическими методами, начиная со 2—3-го дня от манифестации заболевания, такие тесты не требуют накопления бактериологического материала и могут быть выполнены достаточно быстро — за несколько часов [9, 10].
Цель данной работы — получение крысиных моноклональных антител (МКА) против рекомбинантного белка PAL L. pneumophila, характеризующихся родоспецифичностью, что впоследствии позволит использовать их в качестве основы для разработки новых экспресс-тестов для выявления патогенных легионелл в образцах мочи пациентов с подозрением на легионеллез.
Материал и методы
Получение рекомбинантного белка PAL L. pneumophila. Получение экспрессионной конструкции, экспрессия рекомбинантного белка PAL (rPAL) в клетках Escherichia coli, его выделение и очистка описаны в более ранних работах [11, 12].
Схема иммунизации крыс и выбор животных для получения спленоцитов. В качестве антигенной эмульсии для иммунизации лабораторных животных использовали полный адъювант Фрейнда («Sigma-Aldrich», США), смешанный в объемном соотношении 1:1 с белком PAL (исходная концентрация 1 мг/мл). Для иммунизации одного животного использовали 150 мкг белка. Антиген вводили внутримышечно в основание хвоста молодым самкам крыс линии Wistar (Филиал «Андреевка» ФГБУН «НЦБМТ» ФМБА, Андреевка, Россия). Бустерную дозу антигена животным вводили через 3 нед в том же количестве, но без добавления адъюванта. Специфическую активность иммуноглобулинов класса G сыворотки крови иммунизированных животных в отношении rPAL определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого кровь на анализ отбирали из ретроорбитального синуса крыс не ранее, чем через 2 нед после первой иммунизации и через 2 дня после второй. Сыворотку крови крыс титровали против иммобилизованного в лунках планшета rPAL (1 мкг/лунка). Связывание иммуноглобулинов с антигеном детектировали при помощи козьих антител против целой молекулы крысиного IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена. Реакцию визуализировали при помощи хромогенного реактива тетраметилбензидина (TMB; «Thermo», США), учитывали оптическую плотность в лунках планшета при помощи планшетного спектрофотометра при длине волны детектора 450 нм. Предельным титром считали такое разведение сыворотки, значения оптической плотности которого вдвое превышало значения в лунке отрицательного контроля. Значения оптической плотности в отрицательном контроле не превышали 0,15. Животных с наибольшим значением титров специфических антител подвергали эвтаназии на 3-й день от последней иммунизации, после чего изымали селезенку.
Получение гибридом-продуцентов МКА. Спленоциты крыс получали перетиранием селезенки через нейлоновое сито с диаметром пор 100 мкм («Fisherbrand», США) с последующим отделением лимфоцитарной фракции на градиенте плотности при помощи раствора Ficoll-Paque PLUS («GE Healthcare», Великобритания). В качестве партнера для слияния использовали мышиную миеломную линию клеток Sp2/0-Ag14 («ATCC», США). Гибридизацию производили двумя методами: классическим методом Келера и Мильштейна с использованием в качестве агента для слияния раствора PEG-DMSO [13], а также методом электрослияния на приборе BTX ECM2001 («Harvard Apparatus», США) с использованием микрослайда Model 453 («BTX», США) в среде BTXpress Cytofusion Medium C («BTX», США). В обоих случаях для слияния использовали спленоциты и клетки миеломной линии Sp2/0-Ag14 в соотношении 3:1. Брали равное количество клеток для осуществления гибридизации каждым из методов.
Процедуру электрослияния осуществляли следующим образом: преэлектропорационный диэлектрофорез клеток проводили при значении напряжения 50 В в течение 30 с, затем подавали 2 прямоугольных импульса напряжением 500 В продолжительностью 30 мкс каждый (электропорация), после чего проводили постэлектропорационный диэлектрофорез при значении напряжения 50 В в течение 30 с с последующим затуханием до нуля за 9 с. После электрослияния содержимое микрослайда оставляли на 30 мин при комнатной температуре.
После слияния клетки культивировали в 96-луночных планшетах без фидерного слоя в среде DMEM («Sigma», США) с добавлением 20% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone, «GE Healthcare», США), 2 мМ L-глутамина («ПанЭко», Россия), 100 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия), с однократным раствором гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT) (Gibco, «Thermo Fisher», США). Селекцию на среде с HAT проводили в течение 3 нед с заменой среды по мере закисления.
Скрининг гибридом-продуцентов МКА. Скрининг культуральной жидкости из лунок планшетов, содержащих гибридные клетки, осуществляли методом непрямого твердофазного ИФА в отношении rPAL, начиная с 10-го дня после гибридизации. Для скрининга из каждой исследуемой лунки, содержащей гибридомы, отбирали 100 мкл культуральной жидкости, которую помещали в лунку планшета с иммобилизованным на его поверхности белком rPAL. Последующие условия исполнения ИФА аналогичны описанным выше. Скрининг каждой перспективной лунки с гибридными клетками проводился трижды. Гибридомы из лунок, показавших стабильные или прогрессирующие результаты в ИФА, подвергали клонированию методом предельных разведений. Моноклональность гибридом в лунках культурального планшета контролировали визуально при помощи микроскопа. Продукцию специфических к rPAL антител класса G контролировали при помощи ИФА, как описано выше. Процедуру клонирования проводили не менее 2 раз для каждого продуцента. Каждый раз отбирали клоны-продуценты со стабильно высокими значениями оптической плотности в ИФА, а также морфологически однородные. Все полученные клоны культивировали с масштабированием, штаммы полученных гибридом подвергали криоконсервации.
Оценивали количество стабильных клонов-продуцентов МКА, полученное в результате слияния крысиных спленоцитов с мышиной миеломной линией каждым из двух методов.
Определение специфической активности антител. Активность полученных МКА определяли методом дот-блот-иммуноанализа. В анализируемую панель вошли исходный белок-мишень, штаммы L. pneumophila разных серогрупп и иные представители рода Legionella, а также штаммы грамотрицательных бактерий, белок PAL которых был максимально идентичен легионеллезному (согласно базе данных UniProt), возбудители пневмоний и инфекций мочевыводящих путей (см. таблицу). Все штаммы были получены из ГКПМ ФБУН «ГНЦ ПМБ». Взвеси микроорганизмов, изначально приготовленные в концентрации 109 м.к./мл, перед проведением анализа были инактивированы кипячением. Антигены наносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL («GE Healthcare», Великобритания) с помощью системы микрофильтрации Bio-Dot («Bio-Rad», США) в количестве 1 мкг/пятно (для белкового антигена) или 106 м.к./пятно (для инактивированных бактериальных взвесей). Свободные валентности мембраны блокировали обезжиренным безлактозным молоком. Затем мембраны инкубировали в культуральной жидкости, полученной вследствие культивирования монослоя клонированных гибридом-продуцентов МКА. Детектировали связывание МКА из культуральной жидкости с мишенями на мембране при помощи козьих антител против целой молекулы крысиного IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена. Визуализировали связывание раствором диаминобензидина с добавлением хлоридов никеля и кобальта (все — «Sigma», США).
Результаты и обсуждение
Выбор крысиной модели для получения антител к rPAL обусловлен рядом преимуществ: иммунная система крыс более выраженно реагирует на простые белковые антигены, нежели мышиная; а также, несмотря на более низкую эффективность клеточного слияния, полученные гибридомы остаются стабильными годами и довольно редко нуждаются в повторном клонировании [14].
Крысы были иммунизированы по короткому протоколу, исходя из предположения о том, что между 2-й и 3-й неделями после первой инъекции идет наибольшая выработка специфичных антител класса G [15]. Титры антител к rPAL через 2 нед после иммунизации у разных животных варьировали от 1:4000 до 1:32 000, через 3 нед — от 1:8000 до 1:256 000. В итоге из 6 животных были отобраны 3 гипериммунных крысы с титрами не менее 1:128 000.
Эффективность гибридизации при использовании разных методов слияния на начальном этапе оценивали по количеству позитивных по результатам ИФА лунок с гибридомами через 10 дней после процедуры слияния. Общая эффективность при электрослиянии составила 9,17%, а при слиянии с использованием PEG-DMSO — 16,46% [15]. После проведения клонирования оценивали количество полученных стабильных клонов-продуцентов. В результате было получено 12 стабильных индивидуальных клонов гибридом: 5 — методом электрослияния и 7 — методом Келера и Мильштейна. Эти результаты не могут быть обработаны с применением методов статистики ввиду того, что в эксперименте участвовало недостаточное количество животных.
Все полученные крысиные МКА высокоспецифичны к целевому белку rPAL, с разной степенью интенсивности взаимодействуют со всеми используемыми в панели штаммами вида L. pneumophila как референсными, так и клиническими изолятами, а также с представителями других видов Legionella spp. (см. таблицу). Это можно объяснить различной экспрессией белка-мишени PAL у разных штаммов. МКА склонны, но по-разному, взаимодействовать с остальными представителями Legionella spp., что говорит о структурных различиях белка PAL внутри рода Legionella. При сравнительном анализе наиболее схожих с исходным антигеном PAL (P26493 (PAL_LEGPN)) последовательностей, найденных в системе UniProt, внутривидовая идентичность PAL составляет 100%, а внутри рода — до 71,2%. Все полученные МКА не проявляют специфичности ни к каким иным бактериальным штаммам, кроме представителей вида Staphylococcus aureus, что является предсказуемым результатом, так как данный вид синтезирует мембранный белок A, с которым взаимодействуют любые иммуноглобулины класса G [16]. Таким образом, ложноположительные результаты при взаимодействии антител со S. aureus в любом исследовании методами иммуноанализа не могут быть полностью исключены.
Результаты скрининга специфической активности анти-rPAL моноклональных антител
| № | Серогруппы | Клоны крысиных моноклональных антител (mabPAL) | ||||||||||||
| 2.4 | 2.16 | 2.33 | 5.2 | 5.10 | 5.14 | 6.2 | 6.3 | 6.23 | 6.48 | 6.58 | 6.75 | |||
| 1 | rPAL | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | |
| Микроорганизмы рода Legionella: | ||||||||||||||
| 2 | Legionella pneumophila ssp pneumophila АТСС 33152 | Серогруппа 1 | ++ | + | ++ | + | ++ | + | ++ | ++ | ++ | + | + | ++ |
| 3 | Legionella pneumophila ssp. pneumophila АТСС 33215 | Серогруппа 6 | ++ | + | ++ | + | ++ | + | ++ | + | ++ | ++ | + | ++ |
| 4 | Legionella pneumophila ssp. pneumophila Strain Bloomington АТСС 33155 | Серогруппа 3 | ++ | + | ++ | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 5 | Legionella pneumophila ssp. fraseri АТСС 33156 | Серогруппа 4 | +++ | ++ | +++ | + | +++ | + | +++ | ++ | +++ | + | ++ | +++ |
| 6 | Legionella pneumophila ssp. pneumophila (Калининград) | Серогруппа 1* | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | ++ | +++ |
| 7 | Legionella pneumophila ssp. pneumophila Белоус (Пыжма) | Серогруппа 1* | +++ | ++ | +++ | + | +++ | + | +++ | + | +++ | + | + | +++ |
| 8 | Legionella pneumophila 0146 (Сочи) | Серогруппа 2-14* | ++ | + | +++ | + | ++ | + | + | + | ++ | + | + | + |
| 9 | Legionella pneumophila 0225 (Сочи) | Серогруппа 1* | +++ | ++ | +++ | + | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | ++ | +++ |
| 10 | Legionella pneumophila 439-406 (Санкт-Петербург) | Серогруппа 1* | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | ++ | +++ |
| 11 | Legionella pneumophila №13 (Ростов) | Серогруппа 1* | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | ++ | +++ |
| 12 | Legionella pneumophila №1742 (Хабаровск) | Серогруппа 1* | ++ | ++ | +++ | + | +++ | + | +++ | + | +++ | + | + | +++ |
| 13 | Legionella longbeacheae ATCC 33462 | +++ | + | ++ | + | +++ | +++ | +++ | — | — | +++ | + | + | |
| 14 | Legionella micdadei NCTC 11371 | +++ | — | +++ | — | — | — | — | + | — | — | — | +++ | |
| Гетерологичные микроорганизмы: | ||||||||||||||
| 15 | Acinetobacter baumannii 1401 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 16 | Acinetobacter baumannii1388 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 17 | Burkholderia cenocepacia 1615 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 18 | Burkholderia cepacia 1939 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 19 | Citrobacter freundii 1297 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 20 | Enterobacter aerogenes ATCC 13048 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 21 | Escherichia coli 675 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 22 | Escherichia coli O104:H7 (Германия) | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 23 | Haemophilus influenzae ATCC 9006 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 24 | Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 25 | Moraxella catarrhalis ATCC 27853 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 26 | Morganella morganii 39(51) | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 27 | Proteus mirabilis 46 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 28 | Proteus vulgaris HX 19222 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 29 | Pseudomonas aeruginosa 3016 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 30 | Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 31 | Pseudomonas stutzeri 903 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 32 | Salmonella enteritidis ВОЗ | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 33 | Serratia marcescens МГУ-5 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 34 | Shigella dysenteria 4387 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| 35 | Staphylococcus aureus MRSA 78/44 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | В настоящий момент в России производятся только 2 тест-системы для идентификации легионелл с использованием моноклональных или поликлональных антител — иммунохроматографический тест на основе меченных золотом антител против ЛПС L. pneumophila 1 (набор реагентов для быстрой идентификации возбудителя легионеллеза «Тест-полоска L. pneumophila 1», РЗН 2013/742) и латексная тест-система на основе антител против мембранного белка p29 L. pneumophila 1 (набор реагентов для быстрой идентификации LEGIONELLA PNEUMOPHILA в реакции латекс-агглютинации, жидкий, «латексная тест-система LEGIONELLA PNEUMOPHILA серотип 1», РЗН 2013/1278 производства ФБУН «ГНЦ ПМБ», Оболенск). Также доступны, зарегистрированы и применяются в РФ тест-системы на основе иммуноанализа для выявления легионеллезного антигена в моче производства «Alere Inc.», США: ИХ-тест BinaxNOW Legionella Urinary Antigen Card и ИФА-тест Binax Legionella Urinary Antigen EIA (ФСЗ 2008/02110). Обе тест-системы валидированы только для определения в моче антигена L. pheumophila серогруппы 1. С использованием полученных нами крысиных МКА (например, mabPAL 2.4 или 2.33) возможно создать диагностическую тест-систему, способную эффективно выявлять не только серогруппу 1 L. pneumophila, но и легионелл прочих серогрупп и видов. Несмотря на то что подавляющее количество случаев легионеллезной инфекции вызвано L. pneumophila 1, другие серогруппы и виды вызывают не менее тяжелые пневмонии. Важно на ранних сроках заболевания идентифицировать легионеллезную инфекцию независимо от того, каким видом легионелл она была вызвана, поскольку длительная неэффективная антибиотикотерапия усугубляет течение болезни и увеличивает шанс неблагоприятного исхода. Сконструированная на основе полученных антител тест-система будет определять не только наиболее значимую L. pneumophila серогруппы 1, но и остальных легионелл в пределах рода. Данные литературы подтверждают эту возможность [8], но для более точного определения специфичности полученных МКА ко всем легионеллам необходимо расширить коллекцию штаммов для дальнейшего исследования специфической активности полученных МКА. ЗаключениеОба использованных в работе метода получения гибридных клеток-продуцентов крысиных МКА, по нашему мнению, показали хороший результат. Несмотря на сравнительно бóльшую эффективность слияния классическим методом с применением PEG-DMSO на начальном этапе (16,46% положительных по продукции лунок против 9,17% после электрослияния), конечный результат, выражающийся в получении стабильных клонов, продуцирующих специфические МКА, для обоих методов слияния не имеет значительных отличий. Полученные в результате работы МКА обладают, вероятно, различной эпитопной специфичностью в отношении rPAL, потому имеют отличающийся профиль детекции в отношении использованной панели микроорганизмов. Применение комбинации МКА mabPAL_2.4 и mabPAL_2.23 позволяет получить смесь, успешно детектирующую все представленные в работе штаммы рода Legionella, mabPAL_6.23 можно использовать в качестве дополнения, выявляющего лишь представителей вида Legionella pneumophila. Финансирование. Работа выполнена в рамках НИР 054 «Разработка нового поколения высокоэффективных тест-систем для детекции возбудителей нозокомиальных инфекций на основе метода иммуно-аптамерной ПЦР». Соблюдение этических стандартов. Все протоколы экспериментов с животными одобрены Комитетом по биоэтике ГНЦ ПМБ, все работы проводили в соответствии с ГОСТ 33216—2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Подтверждение e-mail На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте. Подтверждение e-mail Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь. | ||||||