Разработка метода определения мРНК гена ROR1 в лейкоцитах крови

Читать метаданные

Рецепторная трансмембранная тирозинкиназа-1 (ROR1) интенсивно экспрессируется клетками в течение эмбрионального развития, но не детектируется в тканях взрослого организма. Важное диагностическое значение иммуноцитометрического определения антигена ROR1 на мембране лимфоцитов ранее было продемонстрировано у пациентов с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ). Вместе с тем молекулярно-генетические методы определения уровня мРНК гена ROR1 были использованы при ХЛЛ лишь в единичных случаях, хотя применение доступной в большинстве лабораторий методики полимеразной цепной реакции (ПЦР) могло бы значительно увеличить использованием маркера ROR1 в клинической практике.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Разработка метода определения уровня экспрессии мРНК гена ROR1 в лейкоцитах крови и оценка его диагностического значения при ХЛЛ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследовании были использованы образцы венозной крови 37 пациентов с первые выявленным B-клеточным ХЛЛ, в том числе у 11 пациентов исследовались образцы крови до начала и в динамике терапии. Для оценки специфичности метода были также использованы образцы крови 10 пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ), 6 пациентов с B-клеточной лимфомой из малых лимфоцитов и 11 пациентов с множественной миеломой. Контрольная группа включала 21 донора. Выделение РНК из лейкоцитов крови осуществляли с использованием набора реагентов РИБО-золь D, обратную транскрипцию проводили с использованием набора реагентов Реверта-L (ФБУН ЦНИИЭ, Россия). Уровень мРНК ROR1 определяли методом ПЦР-РВ с использованием оригинальных праймеров и TaqMan зонда, разработанным в нашей лаборатории. Параллельно в сыворотках крови пациентов определяли уровень β-2 микроглобулина методом ИФА с использованием набора β-2-микроглобулин ЗАО «ДРГ Техсистемс».

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия мРНК ROR1 выявлялась в пробах крови 23 из 37 пациентов с ХЛЛ независимо от стадии заболевания и уровня β-2 микроглобулина, в то время как ни в одной из проб крови пациентов всех остальных групп и здоровых доноров мРНК ROR1 не детектировалась. На фоне терапии у всех повторно обследованных пациентов с ХЛЛ с изначально высокими уровнями мРНК ROR1 наблюдалось резкое снижение данного маркера.

ВЫВОДЫ

Разработанный ПЦР-метод определения мРНК ROR1 в лейкоцитах венозной крови имеет перспективное диагностическое значение для дифференциальной диагностики лейкоцитозов и оценки эффективности терапии пациентов с ХЛЛ.

Ключевые слова:

мРНК ROR1

полимеразная цепная реакция

хронический лимфоцитарный лейкоз

Авторы:

Горбенко А.С.

Красноярский филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России;
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный центр Сибирского отделения РАН»

Столяр М.А.

Бахтина В.И.

КГБУЗ «Краевая клиническая больница»;
ФГБОУ ВО «КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России

Мартынова Е.В.

КГБУЗ «Краевая клиническая больница»

Москов В.И.

КГБУЗ «Краевая клиническая больница»

Михалев М.А.

КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница №7»

Ольховик Т.И.

КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница №7»

Хазиева А.С.

КГБУЗ «Краевая клиническая больница»

Смелянская М.Г.

КГБУЗ «Краевая клиническая больница»

Ольховский И.А.

Дата поступления:

22.05.2020

Дата принятия в печать:

19.01.2021

Список литературы:

Endo M, Nishita M, Fujii M, Minami Y. Insight into the role of Wnt5a-induced signaling in normal and cancer cells. Int Rev Cell Mol Biol. 2015;314:117-148. https://doi.org/10.1016/bs.ircmb.2014.10.003
Shabani M, Asgarian Omran H, Farsangi MH, Vossough P, Sharifian RA, Toughe GR, Razavi SM, Khoshnoodi J, Jeddi-Tehrani M, Rabbani H, Shokri F. Comparative expression profile of orphan receptor tyrosine kinase ROR1 in Iranian patients with lymphoid and myeloid leukemias. Avicenna J Med Biotechnol. 2011;3(3):119-125.
Aghebati-Maleki L, Shabani M, Baradaran B, Motallebnezhad M, Majidi J, Yousefi M. Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1): An emerging target for diagnosis and therapy of chronic lymphocytic leukemia. Biomedicine & pharmacotherapy. 2017; 88:814-822. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2017.01.070
Baskar S, Kwong KY, Hofer T, Levy J, Kennedy M, Lee E, Staudt L, Wilson W, Wiestner A, Rader C. Unique cell surface expression of receptor tyrosine kinase ROR1 in human B-cell chronic lymphocytic leukemia. Clin Cancer Res. 2008;14(2):396-404.
Barna G, Mihalik R, Timár B, Tömböl J, Csende Z, Sebestyén A, Bödör C, Csernus B, Reiniger L, Peták I, Matolcsy A. ROR1 expression is not a unique marker of CLL. Hematological Oncology. 2011;29(1):17-21. https://doi.org/10.1002/hon.948
Cui B, Ghia EM, Chen L, Rassenti LZ, DeBoever C, Widhopf GF 2nd, Yu J, Neuberg DS, Wierda WG, Rai KR, Kay NE, Brown JR, Jones JA, Gribben JG, Frazer KA, Kipps TJ. High-level ROR1 associates with accelerated disease progression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2016;128(25):2931-2940. https://doi.org/10.1182/blood-2016-04-712562
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2(-delta delta c(t)) method. Methods. 2001;25(4):402-408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262
Rabbani H, Ostadkarampour M, Danesh Manesh AH, Basiri A, Jeddi-Tehrani M, Forouzesh F. Expression of ROR1 in patients with renal cancer-a potential diagnostic marker. Iran Biomed J. 2010;14:77-82.
Zhang S, Chen L, Cui B, et al. ROR1 is expressed in human breast cancer and associated with enhanced tumor-cell growth. PLoS One. 2012;7:e31127.
Daneshmanesh A, Porwit A, Hojjat-Farsangi M, Jeddi-Tehrani M, Tamm K, Grandér D, Lehmann S, Norin S, Shokri F, Rabbani H, Mellstedt H, Österborg A. Orphan receptor tyrosine kinases ROR1 and ROR2 in hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. 2012;54(4):843-850. https://doi.org/10.3109/10428194.2012.731599
Hojjat-Farsangi M, Moshfegh A, Daneshmanesh A, Khan A, Mikaelsson E, Österborg A, Mellstedt H. The receptor tyrosine kinase ROR1 — An oncofetal antigen for targeted cancer therapy. Seminars in Cancer Biology. 2014;29:21-31. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2014.07.005

Закрыть метаданные

Введение

ROR1 — эволюционно консервативная рецепторная трансмембранная тирозинкиназа, член семейства receptor tyrosine kinase-like orphan receptor (ROR) активирует один из важнейших молекулярных сигнальных путей — Wnt-путь, регулирующий эмбриональное развитие и дифференцировку, определяя клеточную полярность и направленность миграции клеток [1]. ROR1 интенсивно экспрессируется клетками в течение эмбрионального периода, но не детектируется в тканях взрослого организма за исключением короткой фазы дифференцировки B-лимфоцитов. Следует отметить, что экспрессия ROR1 не обнаружена при миелоидных злокачественных опухолях, в том числе при острых миелоидных лейкозах (ОМЛ) [2]. Вместе с тем известно, что белок ROR1 экспрессируется на поверхности опухолевых B-клеток у пациентов с ХЛЛ, но не детектируется в нормальных B-клетках, полученных от здоровых людей, или в клетках других здоровых тканей [3, 4]. Недавно было показано, что ROR1 может экспрессироваться также и в B-лимфоцитах при неходжкинских лимфомах (B-НХЛ), фолликулярных лимфомах, лимфоме зоны мантии и при B-клеточных острых лимфобластных лейкозах [5]. Функция ROR1 способствует активации и выживанию лейкозных клеток и ускоряет прогрессирование заболевания у пациентов с хроническим B-лимфоцитарным лейкозом (B-ХЛЛ) [6]. Важно отметить, что, по данным литературы, не у всех пациентов с ХЛЛ (в 85—94%) удается обнаружить детектируемые уровни антигена ROR1 иммуноцитометрическими методами, что может говорить об отдельном варианте ROR1-негативного фенотипа заболевания с вероятными особенностями протекания заболевания и (или) ответа на терапию.

Экспрессия протеина ROR1 на клетках ХЛЛ считается одним из возможных маркеров оценки прогноза и эффективности терапии и рассматривается как потенциальная мишень для иммунотерапии. Появление новых лекарственных препаратов с направленным действием на ROR1 определяет актуальность разработки доступных методов выявления экспрессии ROR1 у пациентов. Учитывая, что технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) становится все более доступной в клинико-диагностических лабораториях, разработка и клиническая апробация метода количественного определения уровня мРНК ROR1 представляется перспективной для включения его в перечень диагностических тестов при ХЛЛ.

Цель исследования — разработка метода определения уровня экспрессии мРНК гена ROR1 в лейкоцитах крови и оценка его диагностического значения при ХЛЛ.

Материал и методы

В работе были использованы образцы венозной крови, отобранной в раствор стабилизатора РНК (ООО «Формула гена») 37 пациентов (медиана возраста 62 года, 5 женщин и 32 мужчины) с подтвержденным диагнозом B-ХЛЛ до начала и в динамике терапии, 10 пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ) (медиана возраста 64 года, 1 женщина, 9 мужчин), 6 пациентов с B-клеточной лимфомой из малых лимфоцитов (медиана возраста 62 года, 4 женщины, 2 мужчин), 11 пациентов с множественной миеломой (медиана возраста 64 года, 5 женщин, 6 мужчин). Группа контроля включала 21 здорового донора (медиана возраста 21 год, 9 женщин, 12 мужчин). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом Красноярской краевой клинической больницы.

Выделение РНК осуществляли с использованием набора реагентов «РИБО-золь D» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия), обратную транскрипцию проводили с использованием набора реагентов РЕВЕРТА-L (ФБУН ЦНИИЭ, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Уровень мРНК ROR1 определяли методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), разработанным в лаборатории Красноярского филиала ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России. Для дизайна праймеров и зонда использовали программу Primer3 (https://primer3.ut.ee/).

Амплификацию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 100 мМ Трис-HCl, pH 8,8; 0,5 М KCl; 0,8% Nonidet P-40; 2 мМ MgCl₂; 0,2 мМ каждого из дНТФ; 10 мкл кДНК; по 0,3 мкМ праймеров и TaqMan зонда; 1 единицу активности SynTaq ДНК-полимеразы (ООО «НПО Синтол», Россия). ПЦР-РВ проводили на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad», США). Использовали следующую программу амплификации: предварительный прогрев при 95 °C — 5 мин, далее 50 циклов: 95 °C — 15 с, 60 °C — 60 с, детекция флюоресцентного сигнала проводилась по каналу FAM, осуществлялась непосредственно в ходе ПЦР-РВ. Для нормализации получаемых данных в качестве гена «домашнего хозяйства» использовали ген ABL1. Расчет уровня относительной экспрессии мРНК гена ROR1 производили по методу ∆∆Ct [7]. Аналитическая вариация метода рассчитывалась по результатам тестирования одного образца не менее чем в 10 повторах в разных аналитических сериях, начиная со стадии выделения РНК. В каждом случае считали относительную экспрессию мРНК ROR1, для полученных значений определяли коэффициент вариации, который в наших постановках не превышал 9%. Параллельно в сыворотках крови пациентов с ХЛЛ определяли уровень β-2 микроглобулина методом ИФА с использованием набора β-2-микроглобулин ЗАО «ДРГ Техсистемс». Статистический анализ проводили с использованием программного пакета R, корреляцию (по Спирмену) считали статистически значимой при p-уровне <0,05.

Результаты

На рис. 1 представлены графики накопления флюоресцентного сигнала, полученные с использованием разработанного метода при исследовании проб крови пациентов с разным уровнем мРНК ROR1.

Рис. 1. Примеры графиков накопления флюоресцентного сигнала, полученных при исследовании проб пациентов с ХЛЛ с помощью разработанного метода.

Для нормализации результатов использовался ген «домашнего хозяйства» ABL1. 1 — пациент с ХЛЛ, экспрессия ROR1=0,21 отн. ед.; 2 — пациент с ХЛЛ, экспрессия ROR1=0,03 отн. ед.; 3 — пациент с ХЛЛ, экспрессия ROR1 отсутствует.

Ни в одной из исследованных проб крови здоровых доноров или у пациентов с множественной миеломой, с лимфомой из малых лимфоцитов или с ХМЛ мРНК ROR1 не выявлялась, но при этом детектировалась у 23 (62%) из всех 37 обследованных пациентов с ХЛЛ, в том числе у 16 (70%) из 23 пациентов с первично установленным на момент тестирования диагнозом (см. таблицу). Детектируемый уровень мРНК в клетках венозной крови пациентов с ХЛЛ находился в диапазоне от 0,03 до 3,0 относительных единиц (Me=0,17). За время наблюдения в течение 32 нед за включенными в исследование 23 первичными пациентами у 6 ROR(+) из них в дальнейшем была отмечена прогрессия заболевания, однако прогрессирования не наблюдалось ни у кого из 7 ROR(–).

Характеристика групп пациентов по определению уровня экспрессии ROR1 (ROR1 (–) экспрессия не выявлена и ROR1 (+) — выявлена)

Группы исследования	ROR1 (–)	ROR1 (+)
ХЛЛ	14	23
в том числе первично выявленный	7	16
лимфома из малых лимфоцитов	6	0
множественная миелома	11	0
ХМЛ	10	0
доноры	21	0

Нами не было обнаружено значимой корреляционной связи между уровнем мРНК ROR1 с количеством циркулирующих лейкоцитов и лимфоцитов, а также с уровнем β-2 микроглобулина в сыворотке крови пациентов (p>0,05).

Для 11 пациентов с первично выявленным ХЛЛ проводили повторные исследования уровня мРНК ROR1 в динамике терапии. У 9 из них с изначально высоким уровнем мРНК ROR1 наблюдалось резкое снижение уровня этого маркера в течение уже первых недель после начала терапии (рис. 2). Падение уровня мРНК ROR1 прямо не коррелировало (p<0,05) с динамикой количества клеток крови в периферической крови и концентрацией сывороточного β-2 микроглобулина (p<0,05), что говорит о независимом характере такого снижения от других маркеров. Ни в одном из повторных образцов, взятых после начала терапии у пациентов с ХЛЛ мы ни разу не наблюдали увеличения уровня мРНК ROR1.

Рис. 2. Уровень экспрессии мРНК ROR1 у 11 пациентов с ХЛЛ в динамике терапии.

Цифры указывают на рег. № пациента.

Обсуждение

Повышенная экспрессия антигена ROR1 была обнаружена в клетках ряда злокачественных опухолей человека [8, 9], в том числе при онкогематологических заболеваниях: множественной миеломе, остром лимфобластном лейкозе, некоторых лимфомах и ХЛЛ.

В подавляющем большинстве исследований активности гена ROR1 авторы оценивали экспрессию непосредственного белкового продукта гена и только в единичных случаях одновременно определяли и уровень мРНК гена ROR1. При этом в работе [2] было показано, что выявление антигена ROR1, как правило, совпадало с детекцией экспрессии мРНК этого гена. Эти данные позволяют предложить использование теста ПЦР-РВ наряду с иммуноцитометрическим определением данного маркера.

В нашей работе мы наблюдали экспрессию мРНК ROR1 у 70% пациентов с впервые выявленным диагнозом B-ХЛЛ, что ниже, чем данные литературы о частоте встречаемости антигена ROR1 на мембранах трансформированных клеток у больных ХЛЛ, полученных при иммуноцитометрическом исследовании. Различия могут быть обусловлены как относительно меньшей и более гетерогенной группой пациентов в нашей выборке, так и разницей в регуляции интенсивности синтеза и распада мРНК данного гена и его белкового продукта. Вероятно, терапевтические воздействия быстрее отражаются на синтезе мРНК ROR1, чем на жизненном цикле трансформированных клеток ХЛЛ и их мембранных протеинах. Отсутствие корреляционной связи уровня мРНК ROR1 с количеством лейкоцитов подтверждает это предположение.

В литературе описаны различия между мРНК и антигеном ROR1 в отношении к их ассоциации с другими маркерами ХЛЛ. Так, в исследовании S. Baskar и соавт. [4] на выборке из 107 пациентов с B-ХЛЛ было выявлено, что увеличенная экспрессия мРНК ROR1 наблюдалась во всех пробах РНК, выделенной из мононуклеаров, независимо от экспрессии хорошо известных прогностических маркеров — ZAP-70 и мутационного статуса IgV_H_, а также от экспрессии маркеров активации лимфоцитов.

Отсутствие корреляции между экспрессией мРНК ROR1 и β-2 микроглобулином в нашем исследовании соответствует описанному ранее аналогичному результату и для антигена ROR1 и может объясняться тем, что количество β-2 микроглобулина при ХЛЛ отражает не столько количество опухолевых клеток, сколько общий уровень активации циркулирующих лимфоцитов.

В нашем исследовании мы не выявили мРНК ROR1 в пробах крови пациентов ни при одном из других онкогематологичексих заболеваний (см. таблицу), что, очевидно, можно связать с отсутствием достаточного количества свободно циркулирующих опухолевых клеток у пациентов при более локализованных формах опухолей либо с вовлечением в онкологический процесс в данных случаях сигнальных путей в обход регуляции ROR1. Это также свидетельствует в пользу достаточно высокой специфичности теста на экспрессию ROR1 в клетках венозной крови именно для ХЛЛ.

В нашей работе впервые продемонстрировано резкое снижение до минимального определяемого уровня мРНК ROR1 у всех пациентов после назначения терапии, что может служить дополнительным параметром эффективности терапии.

В исследовании авторов [6] было показано, что высокий уровень антигена ROR1 на CD19+ клетках ассоциирован с высоким уровнем ZAP-70, отрицательным мутационным статусом IgV_H и более короткой выживаемостью пациентов с ХЛЛ. Одновременно описано, что уровень антигена ROR1 на мембранах лимфоцитов повышался при прогрессировании ХЛЛ [9]. Однако в статье авторов [4] показано, что уровень антигена ROR1 на CD19+ клетках не изменяется на фоне применяемой терапии. Для понимания причин различий необходимы измерения уровня мРНК и антигена ROR1 в параллельных исследованиях образцов крови пациентов с использованием стандартизованных методик иммунофенотипирования и ПЦР-РВ.

При разных злокачественных новообразованиях ROR1 может быть вовлечен в различные сигнальные каскады и задействовать разные факторы транскрипции, но при этом конечным результатом активности ROR1 всегда является увеличение устойчивости опухолевых клеток, их способности к пролиферации и метастазированию [8]. В большинстве исследований отмечают преимущественное вовлечение ROR1 в реализацию сигнального пути PI3K/AKT/mTOR [10]. Это позволяет надеяться, что направленные на данный путь ингибиторы могут быть потенциально эффективными у пациентов с позитивными ROR1 опухолевыми клетками [11]. Рассматривается также и сам ROR1 как мишень для химиотерапии пациентов с ХЛЛ [3]. Это обусловливает перспективность внедрения технологий оценки экспрессии ROR1 в рутинную практику клинических лабораторий.

Заключение

Нами разработан метод определения уровня мРНК ROR1 в клетках крови. Данный маркер выявлялся у 70% пациентов с впервые выявленным диагнозом ХЛЛ, но не при других онкогематологических заболеваниях среди включенных в исследование пациентов. Нами впервые было продемонстрировано значительное падение уровня мРНК ROR1 в лейкоцитах пациентов с ХЛЛ в динамике терапии. Полученные результаты позволяют предложить использование технологии ПЦР-РВ в качестве дополнительного или альтернативного иммуноцитометрическому методу определения экспрессии гена ROR1.

Метод может иметь перспективное диагностическое и прогностическое значение как дополнительный тест при выборе терапии и оценки ее эффективности у пациентов с ХЛЛ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.