Введение

Сосудистая система является одним из наиважнейших органов, обеспечивающих доставку кислорода, питательных веществ, гормонов во все ткани организма. Длина сосудистой сети составляет около 100 км, причем большая часть длины приходится на капилляры. Ангиогенез — отрастание новых сосудов от уже сформированных — играет важную роль в эмбриогенезе, регенерации тканей, заживлении ран, росте и метастазировании опухолей [1]. Эндотелиальные клетки крайне чувствительны ко всем повреждениям, происходящим в организме, особенно к гипоксии и воспалению. Это свойство особенно важно в ходе регенерации повреждений, где необходимо быстрое восстановление кровоснабжения, для быстрого заживления.

Одним из сильных ангиогенных стимулов является VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Его количество в поврежденной ткани резко возрастает в ответ на гипоксию, а также механическое растяжение [2]. Связываясь со своими рецепторами VEGFR-1 и VEGFR-2, VEGF повышает проницаемость эндотелия и запускает пролиферацию, миграцию и усиливает выживаемость эндотелиальных клеток [3]. Синергия сигнальной системы VEGF и Notch обеспечивает формирование сбалансированной сосудистой сети [4].

Сигнализация Notch является одним из главных механизмов, контролирующих межклеточные взаимодействия. Она регулирует направление развития соседних клеток, а также определяет их способность к самообновлению, росту, выживанию, дифференцировке и апоптозу (рис. 1). У млекопитающих известно 4 разных типа рецепторов Notch (Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4 и 5 лигандов, делящихся на два семейства: Delta like и Jagged (Dll1, Dll3, Dll4, Jagged1 и Jagged2) [5].

При канонической сигнализации взаимодействие лиганда с рецептором Notch приводит к отщеплению внутриклеточной части рецептора — NICD с помощью протеазы γ-секретазы (рис. 1) с последующим транспортом NICD в ядро, что приводит к активации транскрипции генов, регулируемых Notch [6]. В ходе неканонического сигнального пути активация Notch запускает сигнальные пути РI3K/Akt и NF-κВ, а также подавляет активность b-катенина [7].

Сигнальный путь Notch определяет процесс ветвления/отрастания эндотелия с выбором развития эндотелиальной клетки в лидирующую tip или следующую за ней stalk, а также стабилизацию образовавшегося сосудистого отростка через взаимодействие с муральными клетками [8].

Среди муральных клеток особая роль в регуляции ангиогенеза принадлежит мезенхимальным стромальным клетками (МСК), которые участвуют не только в стабилизации образующегося сосуда, но и в стимуляции образования первичного сосудистого отростка [9, 10].

Раннее мы показали, что МСК стимулируют образование капилляро-подобной сети эндотелиальными клетками на 2D-модели сокультивирования in vitro. Это происходило, в частности, за счет того, что МСК секретируют значительное количество VEGF. Кроме того, МСК и эндотелиальные клетки контактировали через Notch-систему, что приводило к повышению более чем в 10 раз экспрессии лиганда Jagged1 на поверхности МСК [11].

Цель исследования — изучить пересечение сигнальных путей от рецепторов VEGF и неканонического Notch.

Материал и методы

Клетки

В работе использовали клетки МСК линии ASC52Telo из коллекции человеческих биоматериалов Института Регенеративной медицины (Lomonosov Moscow State University, collection ID:MSU_MSC_AD; repository catalogue at www.human.depo.msu.ru). МСК культивировали в полной среде DMEM-GlutaMAX (Life Technologies) с добавлением 10% FBS (HyClone) и пенициллина/стрептомицина (Life Technologies).

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) выделяли согласно опубликованному протоколу [12] из здоровых доноров. Пуповины были собраны в акушерском отделении больницы ФГБУ «НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России после письменного информированного согласия всех женщин. Клетки HUVEC культивировали в полной среде EGM-2 (Lonza). В работе использовали клетки от 3 доноров.

3D-модель ангиогенеза в фибриновом геле

В работе использовали метод, описанный нами ранее [13]. Кратко: покрытые клетками HUVEC «бусы» были окрашены 5 мкМ флуоресцентным красителем CellTracker Green CMFDA (Thermo Fisher Scientific Inc.). МСК смешивали с суспензией бус в растворе фибриногена/апротинина до конечной концентрации 8×10⁴ клеток/мл.

После затвердевания геля в каждую лунку осторожно добавляли по 1 мл среды EGM2, содержащем следующие ингибиторы: ингибитор γ-секретазы 10 мкМ Compound E (Merck Biosciences), ингибитор внутриклеточной сигнализации Notch, блокирующий сборку транскрипционного комплекса Notch SAHM1 (Tocris Bioscience) 20 мкМ (рис. 1), антагонист VEGFR DMH4 3 мкМ (Tocris Bioscience). В качестве контроля использовали DMSO. Среду меняли на свежую каждый день. Через 3 дня гели фиксировали 10% раствором формалина в течение 30 мин. Репрезентативные изображения получали с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M (Carl Zeiss). Длину и степень ветвления отростков на полученных снимках измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ (National Institutes of Health, США). Эксперимент выполнялся в трех независимых повторах.

Рис. 1. Notch-сигнализация между двумя контактирующими клетками. На схеме отмечены ингибиторы сигнального пути Notch.

Анализ протеомного профиля фосфоформ киназ

Влияние VEGF на неканонический сигнальный путь Notch оценивали с помощью набора Human Phospho-Kinase Array Kit (№ARY003B). Для этого клетки HUVEC переводили в EBM, содержащий 0,1% человеческого сывороточного альбумина (ЧСА). Затем в соответствующие чашки добавляли 25 мкг рекомбинантного Jagged1 (11648-Р02Р, Sinobiology) и инкубировали 4,5 ч. Затем к клеткам добавляли рекомбинантный VEGF-А 165 (SciStore) до концентрации 26 нг/мл на 15 мин. Затем все процедуры выполняли на льду. Клетки промывали фосфатно-солевым буфером и лизировали в соответствии с рекомендациями производителя. На мембрану вносили лизат, содержащий 300 мкг суммарного белка. Далее действовали в соответствии с рекомендациями производителя. Детекцию хемилюминисцентного сигнала производили с помощью гель-документирующей системы Fusion-SL 3500.WL (Франция). Данные обрабатывали в программе ImageJ (NIH) с использованием плагина Protein Array Analyzer.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее +/– стандартная ошибка среднего. Достоверность оценивали с помощью парного t-теста Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Для оценки степени влияния VEGF и Notch на способность клеток HUVEC формировать сосудистые отростки мы использовали 3D-модель ангиогенеза в фибриновом геле как наиболее приближенную к ситуации in vivo. В качестве ингибиторов сигнализации Notch использовали ингибитор γ-секретазы (Compound E) и SAHM1 — ингибитор, блокирующий сборку транскрипционного комплекса Notch (см. рис. 1).

Помимо бус, покрытых эндотелиальными клетками, фибриновый гель содержал МСК, тем самым имитируя процессы ангиогенеза, происходящие in vivo. Мы обнаружили, что ингибитор γ-секретазы (см. рис. 1) достоверно снижал количество отростков в 2,30±0,21 (p<0,05) раз, а их длину в 1,74±0,18 (p<0,05) раз (рис. 2). SAHM1 достоверно снижал количество отростков в 2,54±0,23 (p<0,05) раз, а их длину — в 2,12±0,15 (p<0,05) раз (см. рис. 2).

Рис. 2. Ингибиторный анализ на 3D-модели ангиогенеза.

Декстрановые «бусы», покрытые HUVEC (зеленые), суспендировали в фибриновом геле вместе с МСК (немеченые) в присутствии ингибиторов: сигнализации Notch (SAHM1), γ-секретазы (Compound E) и сигнализации VEGFR (DMH4). а — репрезентативные изображения получали на 3-й день культивирования. Подсчет количества (б) и средней длины (в) сосудистых отростков проводили с помощью программы ImageJ (NIH). * — p<0,05 в сравнении с соответствующими контролями.

МСК, содержащиеся в фибриновом геле, служат источником VEGF, как было показано нами ранее [11]. В качестве ингибитора внутриклеточной сигнализации от VEGF мы использовали DMH4 — антагонист рецепторов VEGFR1 и VEGFR2. Мы обнаружили, что DMH4 достоверно снижал количество отростков в 12,40±0,08 (p<0,05) раз, а их длину — в 4,36±0,20 (p<0,05) раз (см. рис. 2).

В наших предыдущих исследованиях на 2D-модели контактного сокультивирования HUVEC и МСК мы выявили увеличение экспрессии Notch-лиганда Jagged1 на поверхности МСК. Поэтому в настоящем исследовании мы использовали рекомбинантный Jagged1 для активации сигнального пути Notch в монокультуре HUVEC (без МСК). Изменения активности сигнальных путей, запускаемых VEGF и Jagged1, оценивали по изменению протеомного профиля фосфоформ киназ.

Мы обнаружили, что добавление Jagged1 приводит к увеличению количества Hsp60, HCK (фосфорилированной по сайту Y411), b-катенина и снижает количество киназы p70S6 (фосфорилированной по сайтам T421/S424). Одновременное добавление VEGF165 и Jagged1 приводит к увеличению содержания фосфоформы HCK и уменьшению фосфоформы киназы p70S6 (рис. 3).

Обсуждение

Мы обнаружили, что VEGF и Jagged1 запускают активацию разных сигнальных путей в клетках эндотелия.

Добавление VEGF приводит к фосфорилированию транскрипционного фактора CREB (S133) в HUVEC, что согласуется с данными, полученными другими исследователями [14]. CREB представляет собой цАМФ-зависимый, индуцируемый транскрипционный фактор. Широкий геномный скрининг мест связывания для CREB показал, что он может контролировать экспрессию более 4 тыс. генов [15]. Фосфорилирование CREB по Ser133 в ответ на увеличение концентрации цАМФ, приводит к его активации, димеризации и связыванию с консервативной последовательностью ДНК в промоторах таргетных генов в составе транскрипционного комплекса из CREB-связывающего белка (CBP), РНК-полимеразы II и РНК-геликазы А. [16]. Этот комплекс запускает экспрессию генов, контролирующих пролиферацию, апоптоз, ангиогенез, метастазирование и метаболизм. Один из известных путей активации CREB осуществляется через PI3K/AKT [17].

В свою очередь Jagged1 активирует HCK, Hsp60, β-катенин и ингибирует фосфорилирование p70S6 киназы (рис. 3), что может указывать на активацию неканонического сигнального пути Notch.

Киназа гемопоэтических клеток (HCK) является членом семейства SRC цитоплазматических тирозиновых киназ. Для киназ семейства SRC было показано, что они могут выступать как в роли субстрата, так и активаторов ряда ростовых факторов [18]. Механизм действия HCK хорошо изучен только в регуляции иммунных ответов. Помимо этого существуют данные, свидетельствующие об участии HCK в активации сигнального пути TGF-β/Smad3 на фибробластах и эмбриональных клетках почки линии HEK293 [19, 20].

Наши результаты подтверждают возможность участия HCK в неканонической сигнализации Notch в эндотелиальных клетках. Мы предполагаем, что взаимодействие Jagged1 с рецептором на поверхности HUVEC способствует фосфорилированию HCK посредством мембран-ассоциированных активаторов [19].

При стимуляции клеток эндотелия одновременно и Jagged1 и VEGF наблюдается аддитивный эффект на активацию HCK и рибосомальной S6-киназы (p70S6) (см. рис. 3).

Рис. 3. Анализ протеомного профиля фосфоформ киназ в HUVEC, стимулированных VEGF, рекомбинантным белком hJagged1 или их комбинацией, в сравнении с нестимулированным контролем.

а — репрезентативные данные эксперимента; б — результаты анализа данных в виде тепловой карты изменения протеомного профиля фосфоформ киназ. Данные представлены в виде отношения к контролю ± стандартное отклонение.

Рибосомальная S6-киназа (p70S6) 70 кДа, нижестоящая мишень PI3K и ERK (MAPK) является важным регулятором клеточного цикла и пролиферации клеток. Показано, что VEGF-A запускает фосфорилирование p70S6 киназы [21]. В то же время p70S6 подавляет экспрессию VEGF и HIF-1a — важных индукторов ангиогенеза [22]. Мы обнаружили, что Jagged1 способен подавлять ее активацию и совместное добавление с VEGF усиливает ингибирующий эффект Jagged1.

Кроме влияния на фосфорилирование киназ, выявлена тенденция к увеличению экспрессии β-катенина и белка теплового шока 60 (Hsp60), который представляет собой молекулярный шаперон, участвующий в сворачивании преимущественно митохондриальных белков и активируется в условиях митохондриального стресса [23]. Вместе с тем роль Hsp60 в эндотелиальных клетках исследована мало. Мы показали, что Hsp60 возможно участвует в передаче неканонической сигнализации Notch и его экспрессия возрастает и при добавлении одного Jagged1 и при совместном добавлении с VEGF.

На основе полученных данных нами предложена схема неканонической сигнализации Notch и ее пересечение с внутриклеточной сигнализацией, вызванной VEGF (рис. 4).

Рис. 4. Предполагаемая схема пересечения внутриклеточной сигнализации VEGF и неканонического Notch.

Заключение

Нами обнаружен неканонический путь сигнализации Notch, который включает в себя HCK, Hsp60, b-катенин и p70S6. Кроме того, участие VEGF в регуляции неканонического сигнального пути Notch происходит путем пересечения в активации HCK и подавлении p70S6.

Полученные данные могут иметь важное значение при создании васкуляризированных ткане-инженерных конструктов.

Финансовая поддержка

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №19-015-00511 и ГЗ НИР №НИОКТР 121031300093-3 «Оценка роли межклеточных взаимодействий и энергетического метаболизма в регуляции функции эпикарда для разработки новых технологий стимуляции регенеративных процессов в сердце».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.