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Proteínas do feijão preto sem casca: digestibilidade em animais convencionais e isentos de germes (germ-free)

Proteins of dehulled black beans: digestibility in conventional and germ-free animals

RESUMO

INTRODUÇÃO

O feijão comum (Phaseolus vulgaris, L.) é uma das leguminosas mais consumidas tanto no Brasil como em outros países da América do Sul (Antunes & Sgarbieri, 1980). Como alimento, representa importante fonte de nutrientes, como proteínas, carboidratos complexos, vitaminas, minerais e fibras (Coelho, 1991; Barampama & Simard, 1994; Geil & Anderson, 1994). No entanto, apresenta limitações que impossibilitam a utilização de todo o seu potencial nutritivo pelo organismo (Rodriguez, 1995).

Um dos maiores problemas do feijão é representado pelo baixo valor nutricional de suas proteínas, decorrente, por um lado, da sua baixa digestibilidade e, de outro, do teor e biodisponibilidade reduzidos de aminoácidos sulfurados (Evans & Bauer, 1978; Antunes & Sgarbieri, 1980; Fukuda et al., 1982).

Um dos fatores a interferirem na baixa digestibilidade das proteínas do feijão cru é a presença dos inibidores de proteases. Embora estes pareçam ser geralmente inativados durante o cozimento, há relatos na literatura de atividade residual após o processamento desta leguminosa (Eicher & Satterlee, 1988).

Bressani (1993) apontou ser multicausal a reduzida digestibilidade das proteínas do feijão e de outras leguminosas, havendo, além dos inibidores de proteases, outros fatores ligados à casca (taninos), aos cotilédones (proteínas, taninos e fitatos), ao processamento e ao armazenamento. O tanino faz parte de um grupo heterogêneo de compostos fenólicos presentes nos vegetais e pode interagir com as proteínas, formando complexos. Esta interação poderá ocorrer tanto com as proteínas dos alimentos, como com as enzimas do trato gastrintestinal (Coelho & Lajolo, 1993). Os taninos, em quase sua totalidade, encontram-se na casca dos grãos, principalmente no feijão de cor (Coelho, 1991). O ácido fítico também pode formar complexos com proteínas e diminuir, assim, a digestibilidade deste nutriente (Torre et al., 1991).

Feijão armazenado em ambiente de alta umidade, passando por longo tempo de cocção por causa do endurecimento pós-colheita, apresenta redução do valor nutricional (Antunes & Sgarbieri, 1979). Além disso, as suas proteínas apresentam estrutura compacta, quando no estado nativo, o que as tornam resistentes à digestão (Nielsen, 1991).

Acrescenta-se às limitações mencionadas que a adição de feijão a outros alimentos é capaz de reduzir a digestibilidade total desta dieta mista em humanos (Calloway & Kretsch, 1978).

Um melhor conhecimento das causas da baixa digestibilidade das proteínas das leguminosas pode contribuir significativamente para sua melhor utilização (Fukuda et al., 1982). Acredita-se poder haver, com a retirada da casca, um aumento da propriedade de digestão das proteínas do feijão pela eliminação de alguns fatores antinutricionais, como os taninos. O isolamento das frações protéicas poderia permitir a verificação do grau de influência de complexantes de proteínas na sua digestibilidade.

Este trabalho teve como objetivo determinar a digestibilidade das frações protéicas do feijão preto sem casca e avaliar a interferência da flora intestinal na mesma.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizou-se feijão preto (Phaseolus vulgaris, L.), adquirido no comércio de Belo Horizonte, MG.

O feijão foi passado em máquina de descascar arroz, para quebrar os grãos, e, em seguida, foi imerso em álcool etílico hidratado (92,8º) por uma hora, sendo descascado manualmente. Procedeu-se à moagem em moinho de facas, utilizando peneiras de 20 mesh e, posteriormente, procedeu-se à extração das frações protéicas. Este procedimento foi feito agitando-se, durante 24h, sob refrigeração (10ºC), 100 g de farinha de feijão sem casca, em 1000 mL de água destilada contendo 16,9 g de NaCl e 0,02% de azida sódica. A suspensão foi, então, centrifugada (750 g/15min). O precipitado foi descartado e o sobrenadante, utilizado para obtenção das frações protéicas, foi dialisado por 24h, por duas vezes consecutivas, contra água destilada, e, a seguir, por mais 24h, contra água deionizada, em câmara fria (10ºC), de forma a precipitar as globulinas (Rodriguez, 1995), que foram separadas por centrifugação e congeladas para posterior liofilização. As albuminas foram submetidas à pervaporação (evaporação da água utilizando ar quente) e posteriormente à liofilização. O sobrenadante obtido após a primeira centrifugação foi aquecido a 80^oC em banho-maria, por 30 minutos, para inativação dos fatores antinutricionais, segundo metodologia proposta por Rodriguez (1995). Foi determinado o teor de nitrogênio da albumina e globulina pelo método semimicro Kjeldahl, usando-se o fator de conversão de 6,25 para a obtenção do teor protéico (Association of Official..., 1975).

Foram realizados três ensaios de digestibilidade in vivo. O primeiro com camundongos isentos de germes, o segundo com camundongos convencionais e o terceiro com ratos Wistar.

Para o teste com camundongos, foram preparadas uma ração aprotéica e outras três rações cujas fontes protéicas foram: albumina, globulina e caseína como padrão. Adicionou-se água às dietas, na proporção de 1 : 1 (P/V). As rações foram esterilizadas a 120ºC, por 40min.

No experimento com ratos, foram preparadas uma ração aprotéica e quatro rações cujas fontes protéicas foram: albumina, globulina, feijão sem casca e caseína como padrão. No preparo da ração à base de feijão sem casca, este sofreu cocção com água na proporção de 1 : 1,5 (feijão : água), em autoclave a 105ºC, por 30min. O feijão autoclavado foi seco em estufa com circulação de ar, a 60ºC, por 15h e, em seguida, moído em moinho de facas.

Ensaios biológicos

Ensaio com camundongos isentos de germes

Utilizaram-se neste ensaio 24 camundongos, machos, isentos de germes, raça Suíço NIH, recém-desmamados, com peso inicial variando de 7 a 10 g. Estes animais foram criados no Laboratório de Gnotobiologia e Nutrição da Universidade Federal de Minas Gerais a partir de matrizes obtidas da Taconic (USA). Eles foram divididos em quatro grupos de seis e mantidos em isoladores de plástico flexível (Class Biological Clean, USA), em gaiolas individuais aramadas, onde receberam água e alimento ad libitum. Os grupos experimentais foram: dieta aprotéica, dieta de caseína, dieta de albumina e dieta de globulina (Tabela 1). O experimento foi conduzido por 10 dias (Durigan et al., 1987).

Ensaio com camundongos convencionais

Utilizaram-se neste experimento 24 camundongos convencionais, machos, raça Suíço NIH, com peso inicial variando de 7 a 10 g. Os animais foram divididos em quatro grupos de seis e mantidos em gaiolas individuais aramadas, onde receberam água e alimento ad libitum. O tempo de duração da experiência e os grupos foram os mesmos do ensaio com camundongos isentos de germes (Tabela 1).

Ensaio com ratos

Utilizaram-se 30 ratos machos, linhagem Wistar, recém-desmamados, com média de 23 dias de idade e com peso variando de 50 a 60 g. Os animais foram divididos em cinco grupos com seis ratos cada, de modo que a diferença dos pesos médios entre os grupos não excedesse 5 g, conforme recomendação da Association of Official... (1975), sendo os mesmos distribuídos em gaiolas individuais aramadas, onde receberam água e alimento ad libitum. As dietas eram isoprotéicas e isocalóricas (Tabela 1). Os grupos experimentais foram: Grupo 1: dieta aprotéica; Grupo 2: dieta de caseína; Grupo 3: dieta de albumina; Grupo 4: dieta de globulina; Grupo 5: dieta de feijão sem casca (Tabela 2). O experimento foi conduzido durante 10 dias, e o controle do peso foi feito no 1º e no 10º dia (Angelis et al., 1982; Durigan et al., 1987).

Determinação da digestibilidade in vivo

Para a determinação da digestibilidade, as dietas foram marcadas com indigocarmin, na proporção de 200 mg/ 100 g, e foram oferecidas aos animais no 3º e no 9º dia, nos três ensaios realizados.

As fezes foram coletadas do 4º ao 10º dia, em recipiente individual, e mantidas sob refrigeração, no caso dos camundongos convencionais e ratos; no caso dos camundongos isentos de germes, elas foram retiradas dos isoladores somente no final do experimento.

Ao término da experiência, as fezes foram secas em estufa com circulação de ar a 105ºC, por 24h. Foram resfriadas, pesadas e trituradas em multiprocessador para determinação do teor de nitrogênio.

A digestibilidade verdadeira foi calculada, medindo-se a quantidade de nitrogênio ingerida na dieta, a quantia excretada nas fezes e a perda metabólica no material fecal. Esta última foi estimada pelo montante de nitrogênio excretado pelos ratos alimentados com a dieta livre desta substância (Amaya et al., 1991).

Determinação do escore químico corrigido pela digestibilidade da proteína (PDCAAS)

Calculou-se Escore Químico Corrigido pela Digestibilidade da Proteína pela equação:

PDCAAS = escore mais baixo do aminoácido essencial x digestibilidade da proteína.

A proteína cujo PDCCAS for igual ou superior a 1,0 é considerada de boa qualidade (Henley & Kurster, 1994).

Para se obter o perfil aminoacídico, a albumina e a globulina foram submetidas a três hidrólises distintas, sendo uma ácida, uma básica, e uma terceira onde foi feita uma oxidação com ácido perfórmico, para a recuperação da metionina e da cisteína. Posteriormente, as amostras hidrolisadas foram evaporadas e rediluídas em ácido. Em seguida, elas foram filtradas e injetadas em aparelho previamente calibrado com padrão externo. O aparelho utilizado foi o Amino Acid Analyzer, modelo Hitachi L-8500 A, exclusivo para análises de aminoácidos.

Análise estatística

Procedeu-se à análise de variância (ANOVA), para determinação do valor de "F". Para "F" significativo, utilizou-se o teste de Tukey, a 5% de probabilidade, para comparação entre as médias. A dispersão da média foi expressa nas tabelas de resultados, como desvio-padrão da média.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O teor de proteína encontrado, para o feijão preto sem casca, foi de 19,7% (Tabela 3), inferior ao valor de 22,17% obtido por Rosa (1996) com a mesma leguminosa. Esta variação pode ser decorrente da diferença entre os cultivares estudados, da diferença nas condições de plantio e/ou de armazenamento ou da variabilidade ao se descascar o feijão manualmente. Este teor difere também dos 22,0% encontrados por Varriano-Marston & Omana (1979) no feijão preto com casca e dos 22,9% obtidos por Hernandez et al. (1984) com o feijão preto cru. Já Durigan et al. (1987) encontraram para o feijão preto cru, variedade Rico 23, 24,5%, e para o tipo Iguaçu, 27,2%. Bressani et al. (1981) obtiveram resultados que variaram de 19,2 a 25,9%, para cinco espécies desta mesma leguminosa. Observa-se, portanto, a existência de variação no teor protéico entre feijão inteiro e sem casca.

O grau de extração das frações protéicas, utilizando NaCl 0,2 M, foi de 41,7 e 58,3%, respectivamente, para a albumina e a globulina, em relação ao total de proteína do feijão preto sem casca. Marquez e Lajolo (1981) apresentaram um rendimento de 31,5 e 51,9%, respectivamente, para a albumina e a globulina extraídas do feijão variedade Carioca, enquanto Chang & Satterlee (1981) identificaram no feijão Great Northern 43,3 e 56,7%, respectivamente. Verifica-se que, quando se utiliza NaCl 0,2 M, obtém-se melhor grau de extração, tanto da albumina quanto da globulina.

Segundo Rodriguez (1995), a concentração de cada fração protéica e sua composição polipeptídica dependem da forma de extração, pois, utilizando diferentes soluções extratoras, conseguem-se rendimentos distintos.

Os teores protéicos encontrados nas frações de albumina e globulina foram de 59,80 e 73,80%, respectivamente. Segundo Bhatty (1982), a albumina de feijão contém de 9,50 a 12,40% de nitrogênio, o que corresponde de 59,40 a 77,50% de proteína, utilizando para cálculo do teor protéico o valor de nitrogênio multiplicado por 6,25.

O valor obtido no experimento para a digestibilidade verdadeira do feijão preto sem casca foi de 77,0%, portanto, próximo ao encontrado por Sgarbieri & Whitaker (1982), o qual foi de 76,8% (Tabela 3).

Wu et al. (1995), ao submeterem o feijão vermelho kidney beans a nove tratamentos térmicos, identificaram valores de digestibilidade aparente e verdadeira entre 67,9 e 78,8% e entre 72,6 e 82,1%, respectivamente. Com a variedade Rosinha G2, Sgarbieri & Whitaker (1982) encontraram marcantes diferenças na digestibilidade entre a proteína total da farinha integral (59,0%), a proteína total isolada (73,0%), a fração albumínica (72,0%) e a fração globulínica (83,0%). Estas preparações foram autoclavadas a 121ºC, por 15min, antes do preparo das dietas dos ratos.

Eicher & Satterlee (1988) obtiveram um resultado de 20,8% para a digestibilidade aparente do feijão cru. Sgarbieri & Whitaker (1982) acrescentam ser baixo o valor biológico das proteínas do feijão, quando comparado com o de outros alimentos.

Quando Fukuda et al. (1982) determinaram a digestibilidade aparente do feijão preto cozido, os valores encontrados variaram entre 65,6 e 66,7%. Segundo estes autores, a cocção do feijão não somente produz a destruição e a inativação de fatores antinutricionais, mas também afeta a estrutura da proteína, tornando-a mais digerível. Sathe & Salunkle (1981) acrescentam que o calor úmido melhora a digestibilidade das proteínas do feijão em relação ao calor seco.

Amaya et al. (1991) estudaram o feijão preto submetido à recocção, a cada 12h, à temperatura de ebulição do caldo (96ºC), durante 15min. Este experimento teve como resultado valores de digestibilidade aparente e verdadeira variando de 66 a 89% e de 68 a 91%.

Hernandez et al. (1984) encontraram um percentual de 62,8% para a digestibilidade aparente do feijão preto e de 58,4% para a digestibilidade in vitro. Bressani (1989) obteve taxas de 49,6 a 54,6% para a digestibilidade aparente deste mesmo produto em humanos.

Deshpande & Nielsen (1987) relatam ocorrer uma drástica redução da digestibilidade da albumina do feijão, quando submetida ao calor. Contradizendo este relato, a digestibilidade verdadeira da albumina (82,62%) foi superior à da globulina (68,53%), nesta pesquisa (Tabela 3).

Segundo Bressani (1989), os valores de digestibilidade in vivo são mais altos que os da digestibilidade in vitro. De acordo com Carias et al. (1995), a digestibilidade verdadeira é sempre maior que a aparente, isto porque esta última não considera as perdas obrigatórias de nitrogênio nas fezes.

A digestibilidade é o primeiro fator a afetar a eficiência da utilização protéica da dieta. Quando certas ligações peptídicas não são hidrolisadas no processo digestivo, parte da proteína é excretada nas fezes ou transformada em produtos do metabolismo pelos microorganismos do intestino grosso (Sgarbieri & Whitaker, 1982). Boonvisut & Whitaker (1976) acrescentam que a estrutura terciária da proteína afeta a digestibilidade e pode não ser facilmente destruída pelo tratamento térmico. Registram, ainda, que o inibidor da enzima proteolítica do feijão é conhecido por conter ligações dissulfídricas, as quais contribuem para a estabilização da estrutura terciária da proteína.

A melhoria da capacidade de digestão não implica necessariamente o aumento da qualidade protéica, pois os aminoácidos podem estar sendo bem absorvidos, mas podem não estar participando da síntese protéica em virtude da deficiência de alguns aminoácidos essenciais.

De acordo com Bressani (1989), o tegumento do feijão preto é rico em taninos, os quais interferem no processo digestivo, por interação com a proteína ingerida ou com as enzimas digestivas presentes no trato gastrintestinal. Portanto, é de se esperar a digestibilidade e qualidade protéica mais elevadas e o menor conteúdo de taninos no feijão descascado e cozido. Segundo o mesmo autor, a digestibilidade protéica requer estudos adicionais sobre os fatores inerentes à semente e sobre o processo que a torna tão baixa. Ele sugere levar isto em consideração quando se trata de seu consumo.

Os valores de digestibilidade com camundongos isentos de germes foram superiores aos com camundongos convencionais. Estes resultados podem ser decorrentes da interferência da flora intestinal, isto é, nos camundongos convencionais parte do nitrogênio excretado nas fezes é proveniente das células microbianas, cujo crescimento é favorecido pelos nutrientes não digeridos e não absorvidos no intestino delgado, como as fibras alimentares e algumas proteínas.

De acordo com os resultados obtidos, a albumina apresenta valores inferiores aos da globulina para os seguintes aminoácidos: arginina, ácido aspártico, isoleucina, leucina, ácido glutâmico, lisina, cistina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptofano, histidina e serina. Esta maior deficiência da albumina em aminoácidos pode ter sido compensada pela sua maior digestibilidade no experimento com ratos. Observa-se, também, que a albumina e a globulina se complementam (Tabelas 4 e 5).

AGRADECIMENTO

Ao Professor Ênio Cardillo Vieira, pela orientação do experimento com animais isentos de germes, realizado no Laboratório de Gnotobiologia e Nutrição da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Recebido para publicação em 5 de setembro de 2000 e aceito em 30 de março de 2001.

Datas de Publicação

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