Resumos

EFEITO DA ADIÇÃO DE NACL SOBRE AS PROPRIEDADES FUNCIONAIS DO PLASMA BOVINO E DE SEUS HIDROLISADOS TRÍPTICOS¹ 1 Recebido para publicação em 09/08/2000. Aceito para publicação em 29/01/2001

Cléia Batista Dias ORNELLAS² 1 Recebido para publicação em 09/08/2000. Aceito para publicação em 29/01/2001 ; Roberto Gonçalvez JUNQUEIRA³ 1 Recebido para publicação em 09/08/2000. Aceito para publicação em 29/01/2001 ; Marialice Pinto Coelho SILVESTRE³ 1 Recebido para publicação em 09/08/2000. Aceito para publicação em 29/01/2001 ,^* 1 Recebido para publicação em 09/08/2000. Aceito para publicação em 29/01/2001

O efeito da adição de NaCl, numa concentração de0,035 mol/L, sobre algumas propriedades funcionais do plasma e de seus hidrolisados trípticos foi estudado em dois valores de pH (5,0 e 6,0). Foram determinados a solubilidade protéica, a hidrofobicidade, a capacidade emulsionante (EC), o índice de atividade emulsionante (EAI) e a estabilidade da emulsão (ES). Os resultados obtidos indicam que, nos dois valores de pH estudados, a adição de NaCl levou a uma redução significativa da solubilidade, da hidrofobicidade e da EC do plasma, e de alguns de seus hidrolisados trípticos. Por outro lado, aumentou os valores de EAI do plasma, no pH 5,0 assim como da maioria de seus hidrolisados trípticos. Com relação à ES, este tratamento não exerceu qualquer influência sobre o plasma, tendo, entretanto, afetado positivamente alguns hidrolisados trípticos, especialmente no pH 5,0.

Palavras-chave: plasma bovino; propriedades emulsionantes; hidrolisado tríptico; NaCl

SUMMARY

1 – INTRODUÇÃO

As proteínas despertam grande interesse industrial na tecnologia de alimentos, especialmente para os produtos emulsionados. Isto ocorre devido às suas propriedades funcionais e nutricionais. Além de contribuir para a firmeza das emulsões, aumentam sua estabilidade e conferem aos produtos um maior valor nutritivo, por serem fonte de aminoácidos essenciais [13, 20] .

Dentre estes compostos, destaca-se a caseína, principal proteína do leite e derivados, que apesar de apresentar propriedades funcionais desejáveis, elevados investimentos são necessários para sua aquisição. Assim sendo, torna-se importante o estudo de outras proteínas de baixo custo, tais como as do sangue bovino, visando substituir a caseína sem alterar a qualidade físico-química dos alimentos [4] .

O sangue bovino é um dos mais importantes subprodutos do abate em frigoríficos [11]. Devido à sua riqueza em proteínas (17% p/p em média) é muito utilizado em diversos países na alimentação humana, em produtos como sopas, molhos e pães [3,22]. As quantidades de sangue anualmente disponíveis são muito elevadas, sendo no Brasil a produção aproximada em 90 milhões de litros. Porém, somente uma pequena parte é empregada em produtos alimentícios, sendo a maior parte destinada à elaboração de fertilizante, ração para animais ou ainda descartado em coleções d’água [18,22]. Por esse motivo, o emprego do sangue bovino, poderia ser de grande utilidade na indústria alimentícia, pois além de melhorar o valor nutritivo, pode contribuir significativamente para a redução de problemas de poluição ambiental.

Após a centrifugação, o sangue adicionado de anticoagulante dá origem a duas frações, o plasma e as células vermelhas. A globina, proteína extraída destas células, já foi objeto de estudo deste mesmo grupo de pesquisa (dados do autor, ainda não publicados). Portanto, o interesse atual está voltado para a avaliação das propriedades funcionais do plasma e, em especial, ao efeito da adição de NaCl, uma vez que o sal é utilizado pelas indústrias alimentícias para conferir o sabor salgado [20] .

Alguns trabalhos têm mostrado que, não apenas as proteínas nativas, mas também os seus hidrolisados enzimáticos podem atuar como agentes funcionais de alimentos [9, 10, 15, 20] .

Desta maneira, esse trabalho teve como objetivo estudar o efeito da adição de NaCl sobre as propriedades funcionais do plasma bovino e de seus hidrolisados trípticos, em pH 5,0 e 6,0, que corresponde à faixa de vários produtos cárneos emulsionados.

2 - MATERIAL E MÉTODOS

2.1 - Obtenção do sangue e do plasma bovinoz

Os animais foram abatidos em frigorífico sob Inspeção Federal, sendo o sangue coletado diretamente da ferida de sangria em frascos já contendo quantidade necessária de anticoagulante (2mL de solução de EDTA a 10g/100mL de sangue total). No momento da coleta, evitou-se o contato entre a vasilha coletora e a pele do animal.

Após liberado pela Inspeção Federal, o sangue foi imediatamente levado ao Laboratório de Bromatologia da Faculdade de Farmácia – UFMG, onde foi centrifugado (centrífuga Jouan, modelo Br4i) a 3000 rpm por 15 min, para a obtenção do plasma, o qual foi transferido para frascos de vidro e mantido a –18 ºC, até o momento de sua utilização.

2.2 – Determinação do teor protéico

O teor de proteína total (N x 6,25), para o plasma bovino e seus hidrolisados trípticos, obtidos como descrito no item 2.3, foi determinado pelo método de Kjeldhal [2] .

2.3 - Hidrólise tríptica das proteínas do plasma bovino

Foi utilizada a metodologia descrita por CHOBERT, BERTRAND-HARD & NICOLAS [7] , com algumas modificações. O plasma foi solubilizado em solução tampão (fosfato dissódico a 0,02mol/L e ácido cítrico a 0,01mol/L), pH 8,0 em uma concentração de 0,1g de proteína/100mL. Posteriormente, foi adicionada a tripsina (de pâncreas bovino, tipo XIII, tratada com TPCK, Sigma Chemical Co), previamente solubilizada no mesmo tampão, de maneira a se obter uma relação enzima:substrato de 1:100. A mistura foi, então, mantida em banho-maria a 37 ºC sob agitação, por intervalos de tempo de 5, 10, 15, 30 e 60 min, para obter os hidrolisados trípticos T1, T2, T3, T4 e T5, respectivamente. Em todos os ensaios, a reação enzimática foi interrompida, reduzindo-se o pH da solução para 2,0 com ácido clorídrico. Os hidrolisados, assim preparados, foram liofilizados (liofilizador, modelo Freezone^â 4.5, Labconco) e mantidos a -18 ºC, até o momento de utilização.

2.4 - Preparo das amostras

O plasma e seus hidrolisados trípticos foram solubilizados em solução tampão (fosfato dissódico a 0,02mol/L e ácido cítrico a 0,01mol/L), em pH 5,0 e 6,0, na concentração de 0,1g de proteína/100mL. Após 30 min, em banho - maria a 35 ºC, estas soluções foram centrifugadas (centrífuga JOUAN, modelo Br4i) a 6.500g por 10 min e filtradas em papel de filtro (QUANTY, modelo JP42). Os filtrados, assim obtidos, foram utilizados imediatamente para as análises ou, mantidos a -18 ºC, até o momento de uso.

2.5 - Determinação da solubilidade

O teor de proteína solúvel foi determinado de acordo com o método de LOWRY et al [14], modificado por HARTREE [12] , utilizando albumina sérica bovina (BSA, Sigma Chemical Co.) como padrão. Foram utilizadas alíquotas (200 –L) do filtrado obtido no item 2.4. A absorbância foi lida a 650nm em espectrofotômetro (UV-VIS - Cecil, modelo CE2041), e a solubilidade foi calculada em termos de porcentagem do nitrogênio total e expressa em g de proteína solúvel por 100mL de solução.

2.6 - Determinação da hidrofobicidade

A determinação da hidrofobicidade superficial foi realizada segundo a técnica descrita por AKITA e NAKAI [1] . A proteína foi solubilizada em tampão (fosfato dissódico a 0,02mol/L e ácido cítrico a 0,01 mol/L), em pH 5,0 e 6,0, nas concentrações de 1, 5, 8, 10 e 20mg /100mL. Um volume de 3mL destas soluções foi adicionado a 15mL de solução de 8-anilino-naftaleno-1-sulfonato 8mMol/L (ANS), preparada com o mesmo tampão. Posteriormente, foi feita a leitura da fluorescência (fluorímetro TURNER, modelo 450) destas misturas, sendo o l de excitação igual a 374nm e o de emissão igual a 485nm. Foi, então, traçada uma curva da concentração protéica em função da fluorescência, cuja inclinação foi considerada como um índice de hidrofobicidade protéica.

2.7 - Concentração protéica ótima

Para estabelecer a concentração protéica a ser utilizada nos vários experimentos, foram preparadas soluções de plasma bovino, cujas concentrações variaram de 0,05 a 3,0g de proteína/100mL, em tampão (fosfato dissódico a 0,02mol/L e ácido cítrico a 0,01mol/L), pH 3,0. Em cada caso, determinou-se a EC, de acordo com o método descrito a seguir. Posteriormente, traçou-se uma curva de EC em função da concentração protéica.

2.8 - Capacidade emulsionante (EC)

Para a determinação da capacidade emulsionante, foi utilizado o método descrito por VUILLEMARD et al [21] , com as adaptações descritas por DUARTE et al [9] . A EC foi calculada pela Fórmula 1.

na qual OE e OB correspondem à quantidade de óleo emulsionado, respectivamente, pelas amostras e pelo branco (solução tampão sem agente emulsionante).

2.9 - Índice de atividade emulsionante (EAI)

Na determinação do EAI, a metodologia empregada foi baseada no trabalho de PEARCE & KINSELLA [17] , com as modificações feitas por DUARTE et al [9] . O EAI foi calculado pela Fórmula 2, proposta por CAMERON et al [5] .

sendo T a turbidez; q a fração de óleo gasto para formar a emulsão (0,25); e C a concentração inicial de proteína (0,1g /100mL). Por sua vez, a turbidez foi calculada pela multiplicação de 2,303 pela absorbância (A) a 500nm e pelo fator de diluição (100), sendo este produto dividido pelo caminho óptico das cubetas (0,01m).

2.10 - Estabilidade da emulsão (ES)

O método utilizado para a determinação da ES foi relatado por CHOBERT, BERTRAND-HARD & NICOLAS [7] , e adaptado por DUARTE et al [9] . O D EAI% foi calculado pela Fórmula 3.

na qual o EAI _max é o maior valor obtido para as emulsões diluídas logo após sua formação, e o EAI_min é o menor valor de EAI obtido pela alíquotas após o armazenamento por 24 horas ou pelas alíquotas após o aquecimento a 80 ºC. Os valores de ES foram calculados pela Fórmula 4.

2.11 - Efeito da adição de NaCl

Para estudar a influência da adição de NaCl sobre a solubilidade e as propriedades funcionais, foi adicionado à solução tampão (pH 5,0 e 6,0) um volume de uma solução de NaCl a 0,25mol/L, de maneira a se obter uma concentração de sal de 0,025mol/L. Entretanto, considerando também o tampão utilizado no preparo das amostras, este valor corresponde a uma concentração final de sal de 0,035mol/ L. Posteriormente, as soluções de plasma e de seus hidrolisados trípticos foram aquecidas, centrifugadas, filtradas e armazenadas como descrito anteriormente. Procedeu-se, então, às determinações de solubilidade, da hidrofobicidade e das propriedades emulsionantes.

2.12 - Análise estatística

As determinações de proteína solúvel, proteína bruta, EC, EAI, ES e hidrofobicidade foram realizadas em triplicata.

Para verificar o efeito da adição de NaCl sobre as propriedades funcionais do plasma, nos dois valores de pH, e para os cinco hidrolisados foram feitos delineamentos em parcelas sub - subdivididas (nos quais os tempos de hidrólise eram as parcelas, os valores de pH as sub - parcelas e a presença ou ausência de NaCl as sub - sub - parcelas), com análise de variância, para cada propriedade (p < 0,05) e, em seguida, utilizado o teste de Duncan para a comparação das médias [18] .

3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 - Concentração protéica ótima

Observa-se, na Figura 1, que a EC das proteínas do plasma bovino apresentou um máximo quando a concentração protéica foi de 0,1g/100mL. De acordo com PEARCE & KINSELLA [17] , este valor refere-se à concentração mínima necessária para se obter resultados reprodutíveis na determinação de propriedades emulsionantes. Assim, esta concentração foi a escolhida para ser utilizada em todas as determinações neste trabalho.

Em trabalhos realizados, anteriormente, pelo mesmo grupo com proteínas isoladas, foi obtido o mesmo valor do plasma (0,1g de proteína/100mL) tanto para a globina bovina, em pH 3,0 (dados do autor, ainda não publicados) quanto para a caseína bovina, em pH 7,0 [9].

3.2 - Efeito da adição de NaCl sobre a solubilidade

Observa-se na Figura 2 que a adição de NaCl foi prejudicial para a solubilidade do plasma bovino nos dois valores de pH estudados (5,0 e 6,0)

Portanto, estes resultados contradizem a ação benéfica do sal, mencionada por alguns autores, pela qual este procedimento levaria a um aumento da solubilidade de agentes emulsionantes presentes em vários produtos alimentícios [20] . Além disto, o efeito salting out observado para concentrações salinas acima de 1mol/L [6] não poderia explicar estes resultados, uma vez que trabalhou-se com concentrações de NaCl bem inferiores a este valor.

Estudando proteínas isoladas, SILVA [19] mostrou, no pH 6,0, que a solubilidade da globina foi reduzida pela adição de 0,25mol/L de NaCl. Para a caseína, o efeito do sal, na concentração de 0,02mol/L, foi benéfico para a solubilidade, tanto no pH 4,0 quanto no pH 5,0 [10].

O efeito da adição de sal sobre a solubilidade dos hidrolisados protéicos do plasma foi variado, tendo sido benéfica apenas em alguns casos: pH 5,0 (5 min de reação) e pH 6,0 (5 e 60 min). Por outro lado, DUARTE et al [10] verificaram que este mesmo tratamento, provocou um aumento significativo da solubilidade de todos os hidrolisados trípticos da caseína, nos dois valores de pH estudados (4,0 e 5,0).

3.3 - Efeito da adição de NaCl sobre a hidrofobicidade

Pode-se notar na Figura 3 que, como descrito para a solubilidade, a adição de NaCl foi prejudicial para a hidrofobicidade do plasma bovino nos dois valores de pH estudados. Considerando os hidrolisados protéicos, verifica-se um efeito semelhante no pH 5,0, pois apenas o hidrolisado obtido após 30 min teve a hidrofobicidade elevada com este tratamento. Por outro lado, no pH 6,0, o efeito da adição de sal foi mais vantajoso, tendo contribuído para melhorar a hidrofobicidade dos hidrolisados obtidos após 5, 10 e 60 min de reação hidrolítica.

Não foram encontrados na literatura, relatos abordando a influência da adição de sal sobre a hidrofobicidade de proteínas e seus hidrolisados enzimáticos ou de misturas protéicas.

3.4 - Efeito da adição de NaCl sobre a capacidade emulsionante

Observa-se na Figura 4 que, como descrito para a solubilidade e para a hidrofobicidade, a adição de NaCl prejudicou a EC do plasma, em ambos os valores de pH. Esse procedimento foi prejudicial também para todos os hidrolisados trípticos estudados tanto no pH 5,0 quanto no pH 6,0.

Segundo MANGINO [15], a EC mede a capacidade da proteína em migrar para a interface óleo/água. Assim sendo, como a adição de sal reduziu a solubilidade, a proteína e seus hidrolisados passaram, provavelmente, a apresentar maior dificuldade de migração, o que levou a uma redução dos seus valores de EC.

Comparando-se os resultados obtidos para o plasma com os de algumas proteínas isoladas, observa-se que, no caso da globina, a adição de sal também provocou uma redução da EC [19]. Entretanto, para a caseína este tratamento foi benéfico, tanto para a proteína nativa quanto para os seus hidrolisados tríptico [10].

3.5 - Efeito da adição de NaCl sobre o índice de atividade emulsionante

NaFigura 5, observa-se que a adição de sal, no pH 5,0, foi benéfica para o EAI tanto do plasma quanto de seus hidrolisados enzimáticos, ao contrário do verificado para a solubilidade, hidrofobicidade e EC. No entanto, realizando esta mesma avaliação no pH 6,0, nota-se que este tratamento foi prejudicial para o EAI do plasma e do hidrolisado obtido após 10 min de reação. Neste caso, os resultados negativos, poderiam ser, pelo menos em parte, explicados pelo fato de como o EAI mede a capacidade da proteína em permanecer na interface óleo/água, logo após a formação da emulsão [15], a adição de sal poderia aumentar a passagem da proteína da interface para a fase aquosa, reduzindo assim o seu EAI.

O mesmo comportamento foi observado ao estudar algumas proteínas isoladas, uma vez que a adição de NaCl reduziu o EAI da globina [19] e da caseína [10]. Entretanto, este tratamento contribuiu para elevar o EAI de hidrolisados trípticos da caseína, como o observado para a maioria dos hidrolisados trípticos do plasma.

3.6 - Efeito da adição de NaCl sobre a estabilidade da emulsão

Pelos dados apresentados na Figura 6, observa-se que o NaCl não exerceu qualquer influência sobre a ES do plasma, nos dois valores de pH estudados, sendo o mesmo mostrado para a maioria dos hidrolisados trípticos. Assim, este tratamento foi benéfico para a ES dos hidrolisados obtidos após 15 e 30 min de reação no pH 5,0 e, apenas os hidrolisados obtidos após 10 min (pH 5,0) e 30 min de reação (pH 6,0) foram prejudicados pela adição de sal.

O estudo de proteínas isoladas mostrou um comportamento semelhante ao do plasma, para a globina, no pH 6,0 [19] e para a caseína no pH 4,0 [10], visto que a adição de NaCl não afetou a ES destas proteínas. Por outro lado, a presença de sal provocou pequena elevação da ES da caseína no pH 5,0. De acordo com DAS & KINSELLA [8] e McCLEMENTES [16], a adição de sal pode levar a uma redução da estabilidade de emulsões óleo/água, nas quais o agente emulsionante é uma proteína. Isto ocorre devido à deposição em dupla camada dos íons oriundos do sal, provocando uma redução das forças de repulsão entre as gotículas de gordura. Entretanto, como este resultado não foi observado no caso do plasma e das proteínas isoladas citadas acima, pode-se sugerir que a quantidade de sal utilizada nestes estudos, provavelmente, não foi suficiente para produzir esse efeito negativo sobre a ES. Quanto aos hidrolisados trípticos de caseína, os resultados obtidos foram bastante variados [10], como mostrado para os hidrolisados trípticos do plasma.

4– CONCLUSÕES

O efeito da adição de NaCl sobre as propriedades funcionais do plasma mostrou ser vantajoso apenas para o EAI no pH 5,0. Com relação aos hidrolisados trípticos do plasma, observou-se que a ação benéfica deste procedimento, em cada valor de pH, variou com o tempo de reação hidrolítica. De maneira geral, pode-se concluir que, como no caso do plasma, dentre todas as propriedades estudadas, o EAI de seus hidrolisados trípticos foi o mais afetado positivamente pela presença de sal.

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 -AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à FAPEMIG e ao CNPq pelo apoio financeiro.

²Autora da Dissertação de Mestrado da qual esse artigo faz parte

³ Depto. de Alimentos Faculdade de Farmácia - UFMG. Av. Olegário Maciel, 2360 CEP 31180-112. Fone. 31 339-7633 - email: malice@farmacia.ufmg.br

* A quem a correspondência deve ser enviada.

Datas de Publicação

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