Resumo

A espécie Cochliomyia hominivorax, conhecida popularmente como mosca da bicheira, é um parasita obrigatório de animais de sangue quente e sua distribuição geográfica estende-se por toda a América do Sul, excetuando-se o Chile. O parasitismo por esta mosca provoca perdas econômicas significativas e tem grande importância no Brasil. São poucos os estudos com foco nos produtos de excreção e secreção desta espécie e este trabalho teve como objetivo estudar as enzimas presentes no produto de secreção e excreção (E/S) dos três estádios larvais de C. hominivorax. O perfil de proteínas foi obtido por eletroforese em gel de poliacrilamida e a atividade proteolítica foi analisada utilizando-se gelatina, azocaseína e Na-benzoil-arginina-nitroanilida (BAPNA) como substrato. Nos produtos de E/S dos três estádios, as proteínas foram detectadas com um peso molecular aparente que variou entre 116 e 20 kDa. No ensaio de azocaseína, em diferentes faixas de pH, a maior atividade proteolítica ocorreu em pH 7,5 para todos os estádios larvais. Os ensaios foram realizados usando-se estes mesmos substratos e as amostras foram tratadas com os inibidores Benzamidina, Pepstatin A, 4-(2-aminoetil)benzenosulfonil fluoreto hidrocloreto (AEBSF), N-α-tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK), N-α-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK), Ácido etilenodiamino tetra acético (EDTA), Leupeptina e Trans-epoxysuccinyl L-leucylamido-4-guanidino butano (E-64). As proteinases presentes nos produtos E/S de L1 são em sua maioria serina proteases do tipo tripsina e quimotripsina, enquanto que para os produtos E/S de L2 e L3 foi evidenciada a presença de serina proteases e aspartil proteases.

Palavras-chave:
enzima; miíase; mosca; parasitas

Abstract

The species Cochliomyia hominivorax, also known as screwworm fly, is an obligate parasite of warm-blooded animals and its geographic range extends thoughout South America, except Chile. This fly causes significant economic losses and has great importance in Brazil. Few studies have focused on the excretion and secretion products of this species, and this research aimed to study the enzymes present in the secretion and excretion (E/S) products of the three larval instars of C. hominivorax. The E/S profile of proteins was obtained by polyacrylamide gel electrophoresis and proteolytic activity was analyzed using gelatin, azocasein and Na-benzoyl-arginine-nitroanilide as substrates. In E/S products of the three instars, proteins were detected with an apparent molecular weight ranging between 116 and 20 kDa. In the azocasein assay, at different pH ranges, the major proteolytic activity occurred at pH 7.5 for all larval instars. Assays were performed using the same substrates in which the samples were treated with the inhibitors Benzamidine, Pepstatin A, 4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), N-α-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK), N-α- tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK), Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), and Leupeptin-trans-Epoxysuccinyl-leucylamido(4-guanidino) butane (E-64). Proteinases present in the E/S product of first larvae instar are mostly serine trypsin and chymotrypsin proteases, whereas for second and third instars serine proteases and aspartyl proteases were predominantly observed. Biochemical characterization of E/S products of all larval stages of C. hominivorax helps to improve the understanding of the physiology and the interaction of this parasite with host tissues.

Keywords:
Enzyme; fly; myiasis; parasites

Introdução

Cochliomyia hominivorax faz parte da família Calliphoridae, Ordem Diptera, e é agente causador de miíase primária obrigatória em animais de sangue quente. É um dos principais parasitas que causam injúria na população de animais domésticos e silvestres em países sul americanos, exceto no Chile⁽¹1 Lopes AM, de Carvalho RA, de Azeredo-Espin AM.Glutamate-gated chloride channel subunit cDNA sequencing of Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae): cDNA variants and polymorphisms. Invert Neurosci. 2014 Sep;14(2):137-146.⁾. No Brasil, os prejuízos causados por esta mosca, ocorridos pela queda de produtividade, pelos custos dos medicamentos para o tratamento, como também pela mão de obra para o manejo de bovinos susceptíveis e/ou doentes, somam 340 milhões de dólares por ano⁽²2 Grisi L, Leite RC, Martins JRDS, Barros ATM De, Andreotti R, Cançado PHD, et al. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Rev Bras Parasitol Vet [Internet]. 2014; 23(2):150-6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25054492
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25054... ⁾.

Em estudos com vários dípteros que causam miíases, verificou-se que a produção de enzimas excretadas e/ou secretadas (E/S) pelas larvas é responsável pelo estabelecimento e sobrevivência desses parasitas nos hospedeiros⁽³3 Muharsini S; Sukarsih GR, Partoutomo S, Hamilton S, Willadsen P, Wijffels G. Identification and characterization of the excreted/secreted serine proteases of larvae of the Old World Screwworn Fly, Chrysomya bezziana. Int J Parasitol. 2000;30(6):705-14.⁾.

Estudos realizados com produtos E/S de larvas de primeiro estádio de Hypoderma lineatum permitiram a caracterização de três proteases do grupo serina, denominadas hipodermina A, hipodermina B e hipodermina C, que são produzidas durante a migração das larvas de primeiro estádio e estão envolvidas na digestão extra-intestinal⁽⁴4 Casais R, Martín-Alonso JM, Boga JA, Parra F. Hypoderma lineatum: expression of enzymatically active hypodermin C in Escherichia coli and its use for the immunodiagnosis of hypodermosis. Exp Parasitol. 1998 Sep;90(1):14-19.^,55 Baron RW, Colwell DD. Enhanced resistance to cattle grup infestation (Hipoderma lineatum, de Vill.) in calves immunized with purified hypodermin A, B and C plus monophosphoril lipid A (MPL). Vet Parasitol. 1991;38:185-97.⁾. A utilização dessas proteases purificadas na imunização de bovinos propiciou níveis de proteção superiores a 90%⁽⁵5 Baron RW, Colwell DD. Enhanced resistance to cattle grup infestation (Hipoderma lineatum, de Vill.) in calves immunized with purified hypodermin A, B and C plus monophosphoril lipid A (MPL). Vet Parasitol. 1991;38:185-97.⁾.

Kerlin e East⁽⁶6 Kerlin RL, East IJ. Potent immunosuppression by secretory/excretory products of larvae from the sheep blowfly Lucilia cuprina. Parasite Immunol. 1992 Nov;14(6):595-604.⁾ demonstraram que o extrato total contendo a secreção e excreção de Lucilia cuprina tem a capacidade de suprimir a proliferação de linfócitos in vitro e a produção de anticorpos em ovelhas. Testes de diagnóstico utilizando este mesmo extrato foram usados para a seleção de ovelhas resistentes à infestação por L. Cuprina⁽⁷7 Sandeman RM, Feehan JP, Chandler RA, Bowles VM. Tryptic and chymotryptic proteses relased by larvae of the blowfly, Lucilia cuprina. Int J Parasitol. 1990 Dec;20(8):1019-23.⁾. Em outros estudos feitos com L. cuprina, foi verificado que a maioria das proteases secretadas e/ou excretadas pelas larvas são do tipo serina proteases, incluindo tripsina e quimotripsina⁽⁸8 Bowles VM, Feehan JP, Sandeman RM. Sheep plasma protease inhibitors influencing protease activity and growth of Lucilia cuprina larvae in vitro. Int J Parasitol. 1990 Apr;20(2):169-74.⁾, além de enzimas com atividade colagenolítica⁽⁹9 Bowles, VM, Carnegie, PR, Sandeman, RM. Characterization of proteolytic and collagenolytic enzymes from the larvae of Lucilia cuprina, the sheep blowfly. Aust J Biol Sci. 1988, 41:269-78.⁾. Casu et al.⁽¹⁰10 Casu RE, Pearson RD, Jarmey JM, Cadogan LC, Riding GA, Tellam RL. Excretory/secretory chymotrypsin from Luciliacuprina: purification, enzymatic specificity, and amino acid sequencededuced from mRNA. Insect Mol Biol. 1994 Nov;3(4):201-11.⁾ purificaram duas quimotripsinas a partir dos E/S de larvas de primeiro estádio e verificaram que, embora essas proteases induzissem a uma significativa produção de anticorpos, essa resposta não foi capaz de prevenir a infestação dos animais imunizados.

Estudos com Lucilia sericata investigaram o efeito dos seus produtos E/S em fibroblastos, utilizando modelos in vitro com o colágeno e a fibronectina como substratos. Foi demonstrado que o produto E/S desempenha um papel importante em processos como a proliferação celular, remodelação e reepitelização do tecido⁽¹¹11 Horobin AJ, Shakesheff KM, Pritchard DI. Promotion of human dermal fibroblast migration, matrix remodelling and modification of fibroblast morphology within a novel 3D model by Lucilia sericata larval secretions. J Invest Dermatol. 2006 Jun;126(6):1410-8.⁾.

Uma caracterização bioquímica preliminar com larvas de Oestrus ovis utilizando gelatina-SDS-PAGE e análise da sensibilidade aos inibidores demonstrou a presença de pelo menos seis serina proteinases, principalmente "tripsina-like", secretadas do tubo digestório das larvas⁽¹²12 Tabouret G, Bret-Bennis L, Dorchies P, Jacquiet P. Serine protease activity in excretory-secretory products of Oestrus ovis (Diptera: Oestridae) larvae. Vet Parasitol. 2003 Jun;114(4):305-14.⁾.

Brant⁽¹³13 Brant MPR, Guimarães S, Souza-Neto J a., Ribolla PEM, Oliveira-Sequeira TCG. Characterization of the excretory/secretory products of Dermatobia hominis larvae, the human bot fly. Vet Parasitol. 2010;168(3-4):304-11⁾ analisaram os produtos E/S de larvas de Dermatobia hominis e concluiram que nos produtos de larvas de primeiro estádio predominam proteases da classe metalo proteases, enquanto que as serina proteases predominam em larvas de segundo e terceiro estádios. Nas larvas de terceiro estádio, a atividade de proteases do tipo tripsina mostrou-se mais expressiva.

Estudos com C. hominivorax são ainda incipientes, o que torna importante a realização de pesquisas com esta mosca, já que esta é uma espécie presente no Brasil e que causa danos econômicos significativos à agropecuária nacional.

A análise do perfil bioquímico dessas substâncias, além de auxiliar na ampliação do conhecimento sobre o mecanismo parasitário, pode levar à aplicação dessas enzimas no contexto da Medicina Veterinária e Humana. Este trabalho teve como objetivo, portanto, estudar as enzimas presentes no produto de secreção e excreção (E/S) dos três estádios larvais de C. Hominivorax, obtendo o perfil de proteínas e avaliando-se também a atividade proteolitica dos produtos E/S das larvas.

Material e Métodos

Larvas de terceiro estádio foram coletadas de bezerros naturalmente infestados de fazendas próximas ao município de Caiapônia, Goiás e colocadas em recipientes de polipropileno contendo vermiculita e tampados com tecido voile até a pupação⁽¹²12 Tabouret G, Bret-Bennis L, Dorchies P, Jacquiet P. Serine protease activity in excretory-secretory products of Oestrus ovis (Diptera: Oestridae) larvae. Vet Parasitol. 2003 Jun;114(4):305-14.⁾. Após emergência dos adultos, uma colônia desta espécie foi mantida para obtenção de larvas de primeiro, segundo e terceiro estádios. Foram utilizados substratos à base de mel, ovo em pó e água para os adultos e para o estágio larval uma dieta à base de sangue spray dried, carne moída (corte patinho), ovo em pó e leite em pó desnatado. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Goiás pelo protocolo de número 006/14.

Quatrocentas larvas de primeiro estádio (L1), 300 de segundo (L2) e 110 de terceiro (L3) foram lavadas em solução de hipoclorito a 10% e, em seguida, em água destilada estéril. Após as lavagens, as larvas de L1, L2 e L3 foram incubadas à temperatura ambiente em 1, 2 e 10 mL, respectivamente, de meio composto de água milli-Q estéril contendo 1% de penicilina/estreptomicina⁽¹⁴14 El-Ebiarie A, Taha N. Molecular characterization of serine proteases from both first and third larval instars of Chrysomya megacephala. Life Sci J. 2012;9(3):2086-93.⁾. As L1 foram incubadas por 16 horas, as L2 por 24 h, enquanto as L3 permaneceram no meio por 48 horas. Após o período de incubação, as larvas foram descartadas e o meio contendo o produto E/S foi recolhido, centrifugado a 7000g por 20 minutos a 4 °C e o sobrenadante recolhido (Microcentrífuga 5417 EPPENDORF(r)). Os produtos E/S foram estocados em freezer a -80 °C até o momento do uso. Para quantificar as proteínas totais presentes nas amostras, foi utilizado o método de Bradford⁽¹⁵15 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein dye binding. Anal Biochem. 1976 May 7;72:248-54.⁾. A curva padrão foi construída com albumina de soro bovino.

Para se avaliar a atividade proteolítica dos produtos E/S de larvas de C. Hominivorax, utilizou-se a azocaseína como substrato⁽¹⁶16 La Peyre JF, Schafhauser DY, Rizkalla EH, Faisal M. Production of serine proteases by the oyster pathogen Perkinsus marinus (Apicomplexa) in vitro. J Euk Microbiol. 1995 Sep;42(5):544-51.⁾. Em tubos de microcentrífuga, 20 µL da amostra, 40 µL de azocaseína a 0,25% e 40 µL de tampão foram incubados a 37 ºC por 1h. Foram utilizados os tampões Tris-HCl (50mM) pH 7,5; fosfato (50mM) pH 6,0; acetato de sódio pH 5,0 e pH 4,0. Após a incubação, foram adicionados em cada tubo 100 µL de ácido tricloroacético (TCA) a 10% e os tubos foram estocados a 4 °C por 10 minutos. Decorrido este intervalo, os tubos foram centrifugados a 2500 g por 30 minutos. Após centrifugação, 100 µL do sobrenadante foram transferidos para microplaca contendo 100 µL de NaOH (1M). A absorbância de cada amostra foi lida em leitor de ELISA a 450 nm. O ensaio foi realizado em duplicata assim como os controles, que foram preparados substituindo-se as amostras pelo tampão equivalente. Uma unidade proteolítica foi definida como a quantidade de enzima necessária para produzir uma variação da absorbância por mL de amostra por minuto, sob condições padrões.

Foram feitos ensaios de inibição com os seguintes inibidores: benzamidina a 10 mM, pepstatin a 100 mM, 4-(2-aminoetil)benzenosulfonil fluoreto hidrocloreto-AEBSF a 10 mM, N-α-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona-TPCK a 1 mM, N-α-tosil-L-lisina clorometil cetona - TLCK a 1 mM, ácido etileno diamino tetra acético - EDTA a 10 mM, trans-epoxysuccinyl L-leucylamido-4-guanidino butano - E-64 a 0,1 mM e leupeptina a 0,1 mM. Em microtubos contendo 20 µL da amostra e 20 µL de azocaseína a 3%, foram adicionados 60 µL dos inibidores citados acima e incubados a 37 °C por 15 horas. Após incubação, aos microtubos foram adicionados 120 µL de TCA a 10% e transferidos para a geladeira por 15 minutos. Após esse intervalo, o material foi centrifugado a 9000 g por cinco minutos a 4 °C. O sobrenadante foi transferido para outro microtubo, ao qual foram adicionados 100 µL de NaOH para interromper a reação. Em seguida, 100 µL da solução de cada microtubo foram transferidos para microplacas de polipropileno e a leitura foi realizada em leitor de ELISA a 405 nm. Microtubos contendo os produtos E/S de cada estádio larval, sem adição de inibidores, foram submetidos aos mesmos procedimentos para controle das reações. O controle foi realizado em duplicata, assim como o ensaio com inibidores.

Ensaios utilizando o substrato N-α-benzoil-L-anginil-p-nitroanilida (BAPNA) também foram realizados para se investigar a cinética da atividade enzimática específica para tripsina. Em placas de polipropileno, foram adicionados aos poços 190 µL de solução do substrato (BAPNA 3 mM em tampão Tris-HCl pH 8,15; CaCl₂ 1 mM) e 10 µL de cada amostra dos produtos E/S das larvas em seus diferentes estádios. A absorbância foi medida a 405 nm e as leituras foram registradas a cada 10 minutos durante quatro horas. Para cada amostra, foram realizadas reações em triplicata e os resultados foram expressos com as médias das absorbâncias. O controle negativo da reação também foi realizado em triplicata, incluindo nos poços apenas o substrato. Os tratamentos foram distribuídos seguindo o delineamento inteiramente casualizado. Para as variáveis com distribuição normal foi aplicado teste F à análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Skott-Knott (P ≤ 0,05). As análises foram realizadas pelo software Assistat versão 7.7 beta.

Para a visualização do perfil eletroforético dos produtos E/S das larvas, foi realizada uma eletroforese em gel de poliacrilamida de acordo com a metodologia de Laemmli⁽¹⁷17 Laemmli UK. Cleavage of structural protein during the assembly of the bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5.⁾ , utilizando-se gel de acrilamida/bisacrilamida 12% na presença de dodecil sulfato de sódio 10% (SDS). Amostras contendo 15 µg de proteína para L1, 9 µg de proteína para L2 e 7 µg de proteína para L3, foram diluídas, volume a volume em tampão da amostra (Tris-HCl 500 mM, pH 6,8; SDS 10%; 2-mercaptoetanol 120 mM; glicerol 10%; azul de bromofenol 0,05%). Foram aquecidas à temperatura de 100 °C por dois minutos e em seguida aplicadas no gel num volume de 20 µL por canaleta. A corrida eletroforética foi realizada em temperatura ambiente, sob corrente de 120 V, 40 mA e 60 W, no equipamento Mini-Protean da marca Bio-Rad de acordo com as instruções do fornecedor. Os géis foram corados com nitrato de prata e comassie blue.

Para se analisar o perfil de hidrólise de proteases contidas nos produtos E/S das larvas, foi realizado zimograma em gel de SDS-PAGE de acordo com Williams e Coombs⁽¹⁸18 Williams AG, Coombs GH. Multiple protease activities in Giardia intestinalis trophozoites. Int J Parasitol. 1995 Jul;25(7):771-8.⁾, com algumas modificações. Cada amostra foi diluída (v/v) em tampão da amostra (Tris-HCl 500 mM, pH 6,8; SDS 10%; 2-mercaptoetanol 120 mM; glicerol 10%; azul de bromofenol 0,05%) e aplicadas num volume de 20 µL por canaleta. A eletroforese foi realizada aplicando-se as amostras em gel de acrilamida a 12%, copolimerizado com gelatina a 0,5% e a corrida foi realizada sob uma corrente de 80 V. Após a corrida, os géis foram incubados em Triton X-100 (2,5% - v/v) a 37 °C, por 30 minutos, sob agitação constante. Para detectar a atividade proteolítica, os géis foram incubados em tampão Tris-HCl pH 8,15 contendo CaCl₂ 1 mM e ditiotreitol (DTT a 1 mM) durante 15 horas a 37 °C⁽¹⁹19 Terra WR, Ferreira C. Insect digestive enzymes: properties, compartmentalization and function. Comp Biochem Physiol. 1994 Sep;109(1):1-62.⁾. Para a visualização das bandas de proteólise, os géis foram corados com comassie blue (solução de Azul de Comassie G-250 0,1%, metanol 25%, ácido acético 5%) por uma hora e descorados com solução de ácido acético a 10%.

A inibição da atividade proteolítica dos produtos E/S foi analisada por meio de zimograma em géis de poliacrilamida a 12% copolimerizado com gelatina a 0,5%, nos quais as amostras foram aplicadas após incubação prévia com os inibidores de proteases. Amostras dos três estádios larvais, contendo o equivalente 30 µg de proteínas, foram incubadas por uma hora a 37 °C com cada um dos inibidores. Após a incubação, as amostras foram diluídas em tampão da amostra (Tris-HCl 500 mM, pH 6,8; SDS 10%; 2-mercaptoetanol 120 mM; glicerol 10%; azul de bromofenol 0,05%) e aplicadas no gel num volume final de 20 µL. A corrida eletroforética foi realizada sob corrente de 80V. Após a corrida, os géis foram submetidos aos mesmos procedimentos descritos para o zimograma.

Resultados

A atividade proteolítica dos produtos E/S dos três estádios larvais de C. hominivorax utilizando a azocaseína como substrato mostrou-se variável em todas as faixas de pH. Para larvas de primeiro e segundo estádio, essa variação foi diferente em todos os níveis de pH testados, sendo que em pH 7,5 verificou-se a maior atividade proteolítica. Para produto E/S de larvas de terceiro estádio, a atividade proteolítica em pH 7,5 foi igual estatisticamente à atividade observada em pH 6,0, mas maiores do que no pH 5,0 e 4,0 os quais não diferiram significativamente (P > 0,05) (Figura 1).

O ensaio com BAPNA mostrou que, nos produtos E/S de larvas de primeiro estádio, a atividade enzimática específica para tripsina é pequena, mas cresce com o decorrer do tempo. Para os produtos E/S de larvas de segundo estádio, a atividade enzimática específica se mostrou maior do que para larvas de primeiro estádio e se manteve praticamente constante com o decorrer do tempo. A atividade enzimática específica para tripsina teve seu pico aos 60 minutos para larvas de terceiro estádio e, com o decorrer do tempo, foi diminuindo, ficando constante após as duas primeiras horas de incubação (Figura 2).

No geral, os perfis da taxa de inibição da atividade proteolítica foram semelhantes para os produtos E/S dos três estádios larvais (Figura 3).

Os dados obtidos pela incubação dos produtos E/S de larvas de primeiro estádio com os inibidores de proteases mostraram que os reagentes AEBSF e TPCK inibiram similarmente a atividade proteolítica. Em seguida, os inibidores Pepstatin-A e TLCK inibiram em cerca de 50% a atividade proteolítica dessas larvas, não diferindo significativamente entre si (P > 0,05). Benzamidina, EDTA, Leupeptina e E-64 inibiram a atividade proteolítica de forma igual, porém em porcentagem inferior aos demais inibidores. Para produtos E/S de larvas de segundo estádio, a incubação com Pepstatin-A, AEBSF e TPCK causou a maior redução da atividade proteolítica, não tendo diferença significativa entre os três inibidores. O reagente TLCK inibiu a atividade dos produtos E/S dessas larvas de forma intermediária e o restante dos inibidores não diferiram entre si (P > 0,05), inibindo de forma bastante inferior em comparação com os três inibidores anteriores. Incubando os produtos E/S de larvas de terceiro estádio com Pepstatin A, AEBSF e TPCK, também se verificou maior inibição da atividade proteolítica, seguido do TLCK, que inibiu em menor porcentagem a atividade proteolítica desse produto. Para este último estádio larval, os demais inibidores não diferiram do controle (P > 0,05).

Os perfis proteicos dos produtos E/S de larvas de primeiro estádio de C. hominivorax estão apresentados na Figura 4. Em larvas de primeiro estádio, evidenciou-se a presença de bandas de proteínas com pesos moleculares aparentes variando entre 115 kDa a 24 kDa. O perfil protéico dos produtos E/S de larvas de segundo estádio revelou a presença de proteínas cujas bandas encontram-se distribuídas entre 116 e 20 kDa. Nos produtos E/S de larvas de terceiro estádio visualizam-se proteínas entre 116 kDa e 23 kDa, destacando-se dentro deste intervalo bandas com 68, 65, 38 e 35 kDa.

A análise do zimograma mostra o perfil de hidrólise da gelatina produzidos por amostras dos produtos E/S de L1, L2 e L3, nas concentrações de 10, 20, 30 e 50 µg. Em maiores concentrações, houve maior degradação do substrato, com a formação de um número maior de bandas de hidrólise para amostras de produto E/S de L3 (Figura 5).

Na Figura 6, encontram-se os perfis de hidrólise de gelatina produzidos pelos produtos E/S de larvas de L1, L2 e L3. Para o produto E/S de larvas de L1, os inibidores que produziram maior inibição da atividade enzimática foram AEBSF, TLCK e EDTA. Comparando-se os padrões de hidrólise produzidos pela amostra de L2 tratadas com os inibidores, notou-se que os inibidores que produziram maior inibição da atividade enzimática foram AEBSF e TLCK, inibindo boa parte da atividade proteolítica dessas larvas. A análise do gel em que os inibidores de proteases foram adicionados à amostra dos produtos E/S de L3 permitiu observar o desaparecimento de bandas quando utilizados os inibidores AEBSF e TLCK.

Discussão

Poucos estudos foram realizados com as espécies causadoras de miíaes mais importantes no Brasil quanto à caracterização dos produtos E/S. Neste estudo, caracterizou-se o perfil bioquímico de algumas proteinases produzidas por larvas de diferentes estádios de C. hominivorax. A maior atividade frente à azocaína dos produtos E/S de C. hominivorax foi observada no pH 7,5 o que é semelhante ao observado em outros dípteros que produzem miíases. Por exemplo, em O. ovis, a atividade enzimática máxima dos produtos E/S de L3 foi observada em pH 8,0⁽²⁰20 Angulo-Valadez CE, Cepeda-Palacios R, Ascencio F, et al. Proteolytic activity in salivary gland products of sheep bot fly (Oestrus ovis) larvae. Vet Parasitol. 2007 Oct 21;149(1-2):117-125.⁾. O pH ótimo observado para as proteases oriundas de produtos E/S de L. sericata, L. cuprina e Oxysarcodexia thornax esteve entre 7,0 e 9,5⁽⁹9 Bowles, VM, Carnegie, PR, Sandeman, RM. Characterization of proteolytic and collagenolytic enzymes from the larvae of Lucilia cuprina, the sheep blowfly. Aust J Biol Sci. 1988, 41:269-78.^,2121 Chambers L, Woodrow S, Brown AP, Harris PD, Phillips D, Hall M, Church JC, and Pritchard D I. Degradation of extracellular matrix components by defined proteinases from the greenbottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement of non-healing wounds. Br. J. Dermatol. 2003;148:14-23.^,2222 Cuervo P, Mesquita-Rodrigues C, d'Avila Levy CM, Britto C, Pires FA, Gredilha R, et al. Serine protease activities in Oxysarcodexia thornax (Walker) (Diptera: Sarcophagidae) first instar larva. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2008 Aug;103(5):504-6.⁾. Ainda em L. cuprina, Guerrini et al.⁽²³23 Guerrini VH, Murphy GM, Broadmeadow M. The role of pH in the infestation of sheep by Lucilia cuprina larvae. Int J Parasitol. 1988 Apr;18(3):407-9.⁾ relataram que o maior crescimento e sobrevivência das larvas foi conseguido com pH 8,0-9,0 em ovelhas infestadas artificialmente. Hipodermina (A) e (B) produzidas por H. lineatum tiveram atividade ótima em pH 8,5⁽²⁴24 Lecroisey A, Boulard C, Keil B. Chemical and enzymatic characterization of the collagenase from the insect Hypoderma lineatum. Eur J Biochem. 1979 Nov;101(2): 385-393.^,2525 Lecroisey A, Gilles AM, De Wolf A, Keil B. Complete amino acid sequence of the collagenase from the insect Hypoderma lineatum. J Biol. 1987 Jun 5;262(16):7546-51.⁾ e ainda o pH ótimo de colagenase ficou entre 8,0 e 8,5⁽²⁶26 Lecroisey A, Keil B. Specificity of the collagenase from the insect Hypoderma lineatum. Eur J Biochem. 1985 Oct 1;152(1):123-30.⁾. Em contraste ao mencionado anteriormente, a atividade de tripsina e quimotripsina de produtos de excreção e secreção de larvas de C. bezziana foi alta sobre uma ampla gama de pH, variando entre 5,0 a 10,0⁽³3 Muharsini S; Sukarsih GR, Partoutomo S, Hamilton S, Willadsen P, Wijffels G. Identification and characterization of the excreted/secreted serine proteases of larvae of the Old World Screwworn Fly, Chrysomya bezziana. Int J Parasitol. 2000;30(6):705-14.⁾.

Segundo Brant et al.⁽¹³13 Brant MPR, Guimarães S, Souza-Neto J a., Ribolla PEM, Oliveira-Sequeira TCG. Characterization of the excretory/secretory products of Dermatobia hominis larvae, the human bot fly. Vet Parasitol. 2010;168(3-4):304-11⁾, a atividade proteolítica dos produtos E/S de D. hominis foi muito baixa para larvas de primeiro estádio emanteve-se constante no decorrer de 24 horas, uma atividade intermediária foi observada em larvas de segundo estádio e a maior atividade foi obtida para larvas de terceiro estádio, o que é similar ao encontrado no presente estudo para C. hominivorax.

A análise do SDS-PAGE dos produtos E/S de larvas de C. hominivorax revelou a presença de proteínas cujas bandas encontram-se distribuídas entre 116 e 20 kDa para os três estádios larvais. Em estudos feitos com produtos E/S de D. Hominis, foram identificadas bandas protéicas que se situavam em uma faixa de distribuição entre 100 e 14 kDa⁽¹³13 Brant MPR, Guimarães S, Souza-Neto J a., Ribolla PEM, Oliveira-Sequeira TCG. Characterization of the excretory/secretory products of Dermatobia hominis larvae, the human bot fly. Vet Parasitol. 2010;168(3-4):304-11⁾ e, a partir de sobrenadante de macerado total de larvas de D. hominis em SDS-PAGE a 12% corado por prata, foram reveladas proteínas entre 94 a 14 kDa em larvas de segundo estádio e 63 a 21 kDa em larvas de terceiro estádio⁽²⁷27 Pires FA, Moya-Borja GE, Barreira JD, Pinho RT, Alves CR. The main proteinases in Dermatobia hominis second and third instars larvae are serine-proteinases. Vet Parasitol. 2007;145:326-31.⁾, resultados que se assemelham aos valores de pesos moleculares encontrados para os produtos E/S de larvas de C. hominivorax. Estudos com produtos E/S de outros dípteros, como S. magellanica, revelaram o perfil de proteínas produzidas por larvas de terceiro estádio caracterizado por bandas de 63 kDa a 23 kDa⁽²⁸28 Pinilla YT, Moreno-Pérez D a., Patarroyo M a., Bello FJ. Proteolytic activity regarding Sarconesiopsis magellanica (Diptera: Calliphoridae) larval excretions and secretions. Acta Trop [Internet]. Elsevier B.V.; 2013;128(3):686-91.⁾. Para C. bezziana, foram identificadas bandas entre 65 e 14 kDa⁽³3 Muharsini S; Sukarsih GR, Partoutomo S, Hamilton S, Willadsen P, Wijffels G. Identification and characterization of the excreted/secreted serine proteases of larvae of the Old World Screwworn Fly, Chrysomya bezziana. Int J Parasitol. 2000;30(6):705-14.⁾. Analisando o SDS-PAGE dos produtos E/S de larvas de segundo e terceiro estádios de O. ovis, verificou-se a presença de um complexo conjunto de bandas de proteínas que variaram em peso molecular de 79,0 a 14,6 kDa⁽²⁹29 Alborzi A, Jolodar A, Seyfi M, Shapouri A, Bagherian E. Isolation and identification of excretory-secretory and somatic antigens from the Oestrus ovis larvae by SDS-PAGE and immunoblotting. 2014;5(4):307-11.⁾. A análise de produtos E/S de larvas de terceiro estádio de C. megacephala produziu uma única banda a 16 kDa , uma banda entre 16 kDa e 23 kDa e uma ampla faixa entre 23 kDa e 45 kDa⁽¹⁴14 El-Ebiarie A, Taha N. Molecular characterization of serine proteases from both first and third larval instars of Chrysomya megacephala. Life Sci J. 2012;9(3):2086-93.⁾. Comparando os pesos moleculares das proteínas identificadas nos produtos E/S desses dípteros, notou-se que as espécies biontófagas como C. hominivorax, D. hominis, O. ovis e C. bezziana, produzem proteínas com massas moleculares superiores às espécies necrobiontófagas. É provável que essa diferença esteja relacionada à biologia destas espécies, já que espécies necrobiontófagas geralmente não penetram ativamente nos tecidos, alimentando-se superficialmente.

As proteinases presentes no produto E/S de larvas de primeiro estádio, evidenciadas tanto pela clivagem da azocaseína quanto pelo zimograma, indicam que elas são em sua maioria serina proteases do tipo quimotripsina. Os resultados corroboram os obtidos por vários autores que estudaram parasitas invasores de tecidos⁽³⁰30 Broutin-L'Hermite I, Ries-Kautt M, Ducruix A. 1.7 A X-ray structure of space-grown collagenase crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000 Mar;56(Pt 3):376-8.⁾, incluindo as principais espécies causadoras de miíases. Em H. lineatum, a degradação de proteínas (C3) do sistema complemento⁽³¹31 Boulard C. Degradation of bovine C3 by serine proteases from parasites Hypoderma lineatum (Diptera, Oestridae). Vet Immunol Immunopathol. 1989 Mar;20(4):387-98.

32 Casais R, Marti'n-Alonso JM, Boga JA, Parra F. Hypoderma lineatum: expression of enzymatically active hypodermin C in Escherichia coli and its use for the immunodiagnosis of hypodermosis. Exp Parasitol. 1998 Sep;90(1):14-19.

33 Baron RW, Colwell DD. Enhanced resistance to cattle grup infestation (Hipoderma lineatum, de Vill.) in calves immunized with purified hypodermin A, B and C plus monophosphoril lipid A (MPL). Vet Parasitol. 1991;38:185-97.^-3434 Khaznadji E, Boulard C, Moire N. Expression of functional hypodermin A, a serine protease from Hypoderma lineatum (Diptera, Oestridae), in Schneider 2 cells. Exp Parasitol. 2003;104:33-9.⁾ foi atribuída a uma enzima digestiva produzida pelas larvas de primeiro estádio e caracterizada como uma protease da classe das serinaproteases. Em O. ovis⁽³3 Muharsini S; Sukarsih GR, Partoutomo S, Hamilton S, Willadsen P, Wijffels G. Identification and characterization of the excreted/secreted serine proteases of larvae of the Old World Screwworn Fly, Chrysomya bezziana. Int J Parasitol. 2000;30(6):705-14.⁾ e em L. cuprina⁽³⁵35 Elvin CM, Vuocolo T, Smith WJ, Eisemann CH, Riddles PW. An estimate of the number of serine protease genes expressed in sheep blowfly larvae (Lucilia cuprina). Insect Mol Biol. 1994 May;3(2):105-15.⁾, a clivagem de IgG foi atribuída a uma protease digestiva identificada como serina protease. Estudos realizados por Cuervo et al.⁽²²22 Cuervo P, Mesquita-Rodrigues C, d'Avila Levy CM, Britto C, Pires FA, Gredilha R, et al. Serine protease activities in Oxysarcodexia thornax (Walker) (Diptera: Sarcophagidae) first instar larva. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2008 Aug;103(5):504-6.⁾ identificaram também que as principais proteases expressas por O. thornax pertencem à classe de serina proteases. Pires et al.⁽²⁷27 Pires FA, Moya-Borja GE, Barreira JD, Pinho RT, Alves CR. The main proteinases in Dermatobia hominis second and third instars larvae are serine-proteinases. Vet Parasitol. 2007;145:326-31.⁾ detectaram atividades de cisteína e serina proteinases em larvas de segundo e terceiro estádios de D. hominis e mostraram uma maior atividade de serina proteinase quando comparada à atividade de cisteína proteinase para esta espécie.

A análise do efeito dos inibidores sobre a clivagem da azocaseína pelos produtos E/S de segundo e terceiro estádios permitiu concluir que as proteases de L2 e L3 são em sua maioria aspártico e serina proteases. A presença de aspartil proteases em secreções larvais também foi verificada para L. sericata, em que foram detectadas quatro enzimas proteolíticas, compreendendo duas serina proteases, uma aspartil proteinase e uma metalo proteinase, com pesos moleculares que variavam de 20 a 40 kDa e atividade ao longo de uma ampla faixa de pH⁽²¹21 Chambers L, Woodrow S, Brown AP, Harris PD, Phillips D, Hall M, Church JC, and Pritchard D I. Degradation of extracellular matrix components by defined proteinases from the greenbottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement of non-healing wounds. Br. J. Dermatol. 2003;148:14-23.⁾. Assim como verificado no presente trabalho, vários autores observaram diferença de proteases entre os diferentes estádios. Para a espécie D. hominis, foram detectadas metalo proteases em produto E/S de larvas de primeiro estádio e serina proteases em larvas de segundo e terceiro estádios⁽¹³13 Brant MPR, Guimarães S, Souza-Neto J a., Ribolla PEM, Oliveira-Sequeira TCG. Characterization of the excretory/secretory products of Dermatobia hominis larvae, the human bot fly. Vet Parasitol. 2010;168(3-4):304-11⁾. Young et al.⁽³⁶36 Young AR, Meeusen EN, Bowles VM. Characterization of ES products involved in wound initiation by Lucilia cuprina larvae. Int J Parasitol. 1996 Mar;26(3):245-52.⁾ verificaram que há uma modificação no padrão de proteínas durante o desenvolvimento larval de L. cuprina, passando de uma predominância de proteínas com alta massa molecular para um padrão com proteínas de massas inferiores à medida que ocorre o desenvolvimento larval. Esses autores também inferiram que o padrão de proteínas secretadas por larvas desta espécie muda dramaticamente e o aparecimento e desaparecimento de certas moléculas refletem a função que estas desempenham em diferentes estádios de desenvolvimento.

A hidrólise de gelatina pelos produtos E/S de larvas de C. hominivorax, caracterizada por maiores bandas de hidrólise, especialmente nas larvas de terceiro estádio, indicam uma atividade proteolítica mais intensa do que a observada em larvas de primeiro estádio. A cinética da atividade proteolítica da azocazeína, na qual a quantidade de cromóforo liberado foi significativamente inferior em larvas de primeiro estádio, reforçam essa constatação. Essa maior atividade proteolítica observada nas larvas de segundo e terceiro estádios também foi verificada nos produtos E/S de larvas de D. hominis⁽¹³13 Brant MPR, Guimarães S, Souza-Neto J a., Ribolla PEM, Oliveira-Sequeira TCG. Characterization of the excretory/secretory products of Dermatobia hominis larvae, the human bot fly. Vet Parasitol. 2010;168(3-4):304-11⁾e de O. ovis⁽¹²12 Tabouret G, Bret-Bennis L, Dorchies P, Jacquiet P. Serine protease activity in excretory-secretory products of Oestrus ovis (Diptera: Oestridae) larvae. Vet Parasitol. 2003 Jun;114(4):305-14.⁾. Esta maior atividade foi interpretada pelos últimos autores como relacionada ao grande crescimento da larva de terceiro estádio, a qual adquire cerca de 45% do seu peso final já no início do seu desenvolvimento. Levando em conta que as proteases são produzidas em função de requerimentos fisiológicos do parasita, pode-se inferir que as larvas de segundo e terceiro estádios de C. hominivorax apresentam um repertório de enzimas maior em decorrência da maior necessidade de ingestão de nutrientes oriundos da digestão do tecido de seus hospedeiros.

No presente estudo, observou-se que a atividade tríptica está presente em todos os estádios larvais, sendo que em larvas de primeiro estádio é baixa, porém aumenta com o decorrer do tempo. A atividade em larvas de segundo estádio é intermediária e tende a estabilizar-se com o tempo. A atividade tríptica é maior para larvas de terceiro estádio e tende a decair com o tempo. Estes resultados são similares aos encontrados para a espécie D. hominis⁽¹³13 Brant MPR, Guimarães S, Souza-Neto J a., Ribolla PEM, Oliveira-Sequeira TCG. Characterization of the excretory/secretory products of Dermatobia hominis larvae, the human bot fly. Vet Parasitol. 2010;168(3-4):304-11⁾ e refletem a maior atividade trófica das larvas de terceiro estádio para as duas espécies, o que é compatível com o expressivo desenvolvimento que ocorre nesse estádio.

A caracterização bioquímica dos produtos E/S de todos os estádios larvais de C. hominivorax pode contribuir para investigações futuras sobre a fisiologia desse parasita e sua interação com o hospedeiro. Também poderá auxiliar outros estudos sobre específicos da atividade hidrolítica destas enzimas, sejam de origem sintética ou natural, os quais poderão constituir ferramentas importantes para o desenvolvimento de novas moléculas que inibam proteases essenciais na fisiologia do parasita, bem como nos processos patológicos por ele gerados.

Conclusão

Os produtos E/S de larvas de primeiro e segundo estádio de C. hominivorax apresentam maior atividade proteolítica em pH neutro. Para larvas de terceiro estádio, a atividade proteolítica se mostrou estatisticamente igual em pH 7,5 e 6,0 e diminuiu proporcionalmente com a redução do pH.

Os perfis proteicos dos produtos E/S dos três estádios larvais mostra a presença de bandas de proteína com pesos moleculares aparentes variando de 20 a 116 kDa. O zimograma evidencia maiores bandas de hidrólise para PE/S de larvas de terceiro estádio.

As proteinases presentes no produtos E/S de larvas de primeiro estádio são em sua maioria serina proteases do tipo quimotripsina. Para larvas de segundo e terceiro estádios as proteinases são em geral serina e aspártico proteases.

Agradecimentos

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa.

Referências

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