1. 脓毒症的病理生理

脓毒症是由感染引起的宿主免疫紊乱，可导致多器官功能障碍综合征的一种疾病。以微生物毒素负荷过重、血流动力学改变及器官功能衰竭为主要表现。脓毒症的病理生理学过程与炎症风暴、氧化应激、血管内皮损伤密切相关 [1] 。脓毒症初期，先天性免疫细胞(中性粒细胞、NK细胞、树突状细胞(DC))和适应性免疫细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞)处于高应答状态，从而引起促炎因子、抗炎因子、凝血因子等释放增加 [2] 。脓毒症治疗核心是控制潜在感染、稳定血流动力学、调节免疫反应。脓毒症发生与发展机制复杂，近年来众多研究以脓毒症发生机制为治疗靶点做了大量研究，尽管脓毒症治疗方案多元化，但预后仍差，治愈率无明显提高。

2. 脓毒症的免疫麻痹

2.1. 脓毒症对机体免疫细胞的影响

在脓毒症早期(24小时内)白细胞迅速升高，循环促炎细胞因子水平升高，之后是淋巴细胞减少状态，其特征是适应性免疫细胞以及先天性免疫细胞的数量显著减少 [3] 。淋巴细胞群特别容易受到细胞凋亡的影响，细胞凋亡导致有效的抗原呈递细胞数量，这会影响先天性和适应性免疫反应。首先，在免疫反应方面，过度的细胞凋亡会导致免疫细胞的大量耗竭。例如，巨噬细胞和NK细胞的耗竭会减少微生物清除，这会导致长期的炎症反应 [4] 。第二个是免疫细胞不受控制的凋亡导致具有抗炎特性的免疫耐受性，在细胞凋亡过程中，促炎细胞因子的释放受到抑制，但抗炎因子的分泌被激活，表明从辅助性T细胞因子1型(Th1)向Th2细胞因子产生的转变，脓毒症诱导的免疫细胞功能和数量变化导致淋巴细胞减少，并伴有免疫麻痹的进展 [5] 。在淋巴细胞减少症阶段未能使细胞数量正常化与死亡率增加有关：与非幸存者相比，幸存者的中位绝对淋巴细胞计数更高[1.1个细胞/ul × 10³ (IQR 0.7, 1.5) vs 0.7细胞/ul × 10³ (IQR 0.5, 1.0)]，而且淋巴细胞绝对计数与28天死亡率显著相关(p = 0.009)，校正比值比为0.68 (95% CI 0.51, 0.91) [6] 。从脓毒症中恢复的患者会处于免疫麻痹的长期免疫功能障碍状态 [7] 。

2.2. 免疫麻痹

免疫麻痹状态的特征是先天性和适应性免疫细胞的功能降低，病原体免疫应答减弱，控制新发感染和抑癌能力降低 [8] 。免疫细胞的异常耗竭及免疫应答刺激减弱是造成机体免疫麻痹的重要原因。在免疫麻痹期间，释放促炎细胞因子的细胞能力受损，继而增加了凋亡性免疫细胞的比例。在脓毒症患者中，通过细胞凋亡丢失的大多数细胞是淋巴细胞，并且低绝对淋巴细胞计数被证明与死亡率相关 [9] 。脓毒症诱导的免疫麻痹使患者无法避免后续发生机会性细菌或真菌的继发感染。这与绝大多数脓毒症患者可幸免于前期的过度炎症反应，而是会死于免疫抑制状态下的其他感染的猜想一致 [10] 。免疫麻痹的发展几乎与促炎反应同时开始。几项观察性发现进一步说明了免疫麻痹的临床相关性：1) 在死于脓毒症中的患者中，在接受抗生素治疗超过1周的70例患者中，有63例(89%)观察到持续的脓毒症病灶；2) 在脓毒症晚期，机会性细菌引起的感染从9%增加到18%，念珠菌感染从13%增加到30% (35)；3) 在43%的危重患者中发现潜伏病毒的再激活。有趣的是，阳性病毒PCR结果的检出率随着ICU住院时间的增加而增加，并且与真菌和机会性细菌感染的发展有关 [11] 。近年来的观点指出，脓毒症诱导的免疫麻痹占脓毒症相关死亡的大多数。

2.2.1. 免疫麻痹下的先天性免疫细胞

由于先天性免疫细胞在初始病原体识别和反应以及适应性免疫反应的协调中发挥着重要作用，因此它们的缺陷极大地影响了整体免疫健康。RNA测序显示，脓毒症患者的单核细胞中多种免疫应答通路下调 [12] ；脓毒症患者的单核细胞抑制性配体PD-L1表达增加、HLA-DR表达降低 [13] 。单核细胞/巨噬细胞上的PD-1表达的增加已被证明会影响细菌清除、HLA-DR表达下降会降低单核细胞/巨噬细胞呈递抗原，从而引发B细胞和T细胞反应的能力 [14] 。此外，树突状细胞的产生细胞因子(例如IFN-γ)以响应TLR刺激(使病原体攻击的能力降低)，从而抑制T细胞免疫应答 [15] 。综上所述，脓毒症后先天免疫细胞的缺陷通过先天性抗菌活性降低和刺激适应性免疫反应的能力降低是导致免疫麻痹的重要原因之一。

2.2.2. 免疫麻痹下的适应性免疫细胞

除了多种先天免疫细胞群的定量和定性改变外，T细胞的细胞内在缺陷在脓毒症免疫麻痹状态下也持续存在 [16] 。其中，淋巴细胞抗击外来病原体的能力降低，这又许多原因：1) 淋巴细胞耗竭引起的无反应适应性免疫反应，在病原体感染中，持久性抗原和炎症因子的刺激下T细胞逐渐衰竭 [17] 。2) 抗原呈递活性的抑制，在脓毒症中，人白细胞抗原DR同种型(HLA-DR)在抗原呈递细胞(APC)上的表达降低 [18] 。3) 调节性T细胞和髓源性抑制细胞(MDSC)群体的扩增，调节性T细胞通常通过抑制自身反应性效应T细胞的活化来维持自我耐受，在生理条件下预防自身免疫性疾病。在脓毒症期间，调节性T细胞异常活化，并通过抑制效应T细胞产生病理性免疫抑制 [19] 。MDSC可抑制抗原特异性CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞活化 [20] 。综上所述，脓毒症后适应性免疫细胞的缺陷通过免疫应答减弱、抗原呈递能力低下及细胞免疫抑制也是导致免疫麻痹的重要原因。

2.2.3. 缓解脓毒症诱导的免疫麻痹的临床实验

由于淋巴细胞减少和功能缺陷，缓解脓毒症诱导的免疫麻痹的疗法侧重于减少细胞死亡、增加存活细胞的数量以及恢复这些细胞的功能。通过表达抗凋亡分子Bcl-2或抑制半胱天冬酶来阻断细胞凋亡的初步实验显示，脓毒症患者具有明显的生存益处 [21] 。然而，由于半胱天冬酶对其他细胞过程的重要性以及难以确定提供临床益处的剂量和给药时机，使用它治疗脓毒症的想法戛然而止。正因为如此，目前最有前途的策略涉及具有γc受体依赖性细胞因子的单一或联合疗法以及抑制分子的阻断，这两者都有可能增加细胞数量和恢复细胞功能。常见的γc细胞因子有IL-2、IL-7和IL-15，可促进幼稚、效应和记忆CD4和CD8T细胞的存活 [22] 。其中IL-7的治疗给药效果良好，并有望改善脓毒症患者的免疫麻痹，IL-7给药可提高T细胞存活率和恢复T细胞的代谢缺陷。最近的临床试验结果表明，IL-7给药在脓毒症患者中效果良好，表现在CD4和CD8T细胞的数量和功能得到恢复 [23] 。这种基于免疫的疗法应该对许多细菌和真菌病原体具有广泛的抗击作用。由此可知，免疫麻痹的调节是治疗脓毒症的有效途径之一。

3. 外泌体

3.1. 外泌体的概述

外泌体是体内衍生的囊泡，携带蛋白质、脂质和遗传物质，促进细胞间通讯。外泌体广泛存在于多种体液中，其结构高度复杂，在许多细胞信号转导通路中发挥着举足轻重的作用。其在体细胞上具有特殊表面标记蛋白，如CD63、CD81、TSG101等。机体绝大部分细胞都可以分泌外泌体(血小板、干细胞等) [24] 。

3.2. 血浆外泌体

近年来，外泌体作为炎症标志物在肿瘤与心血管疾病被广泛研究，它在炎症反应中起重要作用。此外，外泌体带来了炎症因子，包括IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、TNF-α和IFN-γ，促进炎症细胞的迁移并导致组织损伤，被证明与脓毒症的病理生理学有关。除了与炎症过程有关外，外泌体还与脓毒症的器官功能障碍有关，影响NADPH氧化酶活性产生超氧化物，NO和过氧亚硝酸盐诱导EC的caspase-3活化和凋亡，引起脓毒症心肌病 [25] 。此外，外泌体的数量与血肌酐呈负相关，这可能与脓毒症相关的肾功能损害有关 [26] 。Im等研究评估了脓毒症患者血浆外泌体的总体水平，并评估了外泌体水平是否与器官衰竭和死亡率相关，其研究观察到脓毒症和感染性休克组外泌水平较对照组明显升高，通过队列研究观察到总体外泌体水平与序贯器官衰竭(SOFA)评分之间存在正线性关系，血浆外泌体水平升高与器官衰竭的严重程度相关，并可与脓毒症患者的死亡率相关 [27] 。另有研究发现，其在脓毒症时发挥了明显的促进炎症细胞聚集的作用。在Chang等人的一项研究中，在脓毒症的小鼠模型中，来自健康人的脂肪来源的间充质干细胞来源的外泌体减少了小鼠的全身炎症并提高它的了存活率，这表明外泌体可能与脓毒症的炎症反应相关 [28] 。

3.3. 血小板外泌体-T细胞在脓毒症免疫抑制中的功能

炎症反应和凝血激活是宿主防御感染的两个重要反应，其中，血小板扮演者重要的角色，血小板来源的外泌体约占血浆中外泌体的70%，介导了凝血激活、促炎反应、血管内皮受损等病理生理过程 [29] 。在发生脓毒症的人和小鼠血小板以及在IFN-γ和LPS刺激的巨核细胞中，血小板MHC-I的表达显著增加，且MHC-I的上调有效增加了抗原特异性与CD8⁺ T细胞相互作用的方式 [30] 。研究显示，富含IL-12和IL-4的血浆外泌体有效促进了脓毒症中晚期辅助性T细胞的分化，外泌体中的生长因子GM-CSF可增强T细胞的增殖能力 [31] 。相反，血浆来源的外泌体也会导致免疫抑制，携带MHC-II和CD11b的血小板外泌体可部分通过Fas/FasL依赖性途径抑制抗原特异性免疫反应 [32] 。因此，血小板与T细胞的相互作用在脓毒症免疫抑制中有着重要的作用。

3.4. 血小板外泌体携带PD-L1所发挥的功能

近年来，针对肿瘤浸润性T淋巴细胞中的程序性死亡受体1/程序性死亡受体–配体1 (PD-1/PD-L)通路的治疗在癌症免疫治疗领域成绩斐然，而脓毒症中的免疫麻痹同样涉及T淋巴细胞的耗竭 [33] 。有研究针对脓毒症患者脾脏中的T细胞检测发现，T细胞在持续的抗原和炎症信号刺激下逐渐耗竭，而PD-1在T细胞、巨噬细胞和内皮细胞中却显著上调 [34] 。来源于血小板的外泌体是携带多种分子的脂囊体，在脓毒症期间会引起炎症和心肌功能障碍 [35] 。而外泌体携带的PD-L1似乎对T细胞上的PD-1与外泌体PD-L1相互作用的PD-L1抗体阻断剂具有一定的抗性 [36] 。另有研究显示，在脓毒症患者的血浆外泌体中，PD-L1和PD-L2的协同可促进外泌体和淋巴细胞的结合，并通过PD-1传递的负信号抑制T细胞的活化 [37] 。这提示我们，血小板外泌体携带的PD-L1可能是调节T细胞活化以及形成脓毒症免疫麻痹效应的重要途径。另一方面，血小板外泌体还通过携带高迁移率组框1促进感染性休克期间中性粒细胞胞外诱捕网的形成 [38] 。过度形成的NETs通过与血小板的相互作用促进凝血状态的加重，进一步导致炎症因子的产生 [39] 。在肿瘤研究中抑制NET会通过增加CD8⁺ T细胞浸润和细胞毒性，进而抑制抗PD-1阻断剂的活性 [40] 。更有最新研究显示，aspase-11/GSDMD通路的激活，抑制了脓毒症期间中性粒细胞的NET释放，有效抑制了脓毒症导致的多器官功能衰竭，并提升了小鼠的存活率 [41] 。提示我们，血小板外泌体可通过促进NET的形成抑制CD8⁺ T细胞浸润，形成脓毒症免疫麻痹效应。

4. 讨论

脓毒症疾病进展过程中免疫细胞的凋亡和炎症因子分泌紊乱导致的免疫麻痹是大多数患者死亡的主要原因。研究表明，刺激T淋巴细胞的增殖和成熟，可通过恢复循环血CD4⁺和CD8⁺ T细胞绝对数量，有效降低脓毒症患者的存活率。在脓毒症患者的血浆外泌体中，PD-L1和PD-L2的协同可促进外泌体和淋巴细胞的结合，并通过PD-1传递的负信号抑制T细胞的活化。另一方面，血小板外泌体还将通过HMGB1促进感染性休克期间NET的形成。而抑制NET会通过增加CD8⁺ T细胞浸润和细胞毒性。在抗肿瘤领域大放异彩的外泌体，是否在脓毒症中也能惊艳四座呢，其如何通过某些通路影响机体的免疫麻痹状态，仍需进一步研究。

基金项目

2023年度湖南省自然科学基金项目(2023JJ50448)。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献