摘要: 目的：通过网络药理学探究复方双金颗粒有效成分、泌尿系结石之间的网络关系，探究复方双金颗粒作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库分析平台(TCMSP)、中药分子机制的生物信息分析工具(BATMAN-TCM)筛选复方双金颗粒有效成分及相应的靶点；从GeneCards、DisGeNET、OMIM、Drugbank数据库中获取泌尿系结石疾病相关靶点；使用在线软件平台Venny2.1绘制药物、疾病的交集靶点维恩图；通过Metoscape数据库对交集靶点进行基因本体功能(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析；通过STRING在线数据库构建PPI网络，同时导入Cytoscape3.9.1获取核心靶点；通过Cytoscape3.9.1绘制活性成分–靶点网络。结果：复方双金颗粒129种活性成分，共作用于502个靶点；疾病靶点743个，疾病和药物交集靶点70个；核心靶点包括肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A (VEGFA)、核因子红细胞2相关因子2 (NFE2L2)、白细胞介素6 (IL6)、白介素-1β (IL1B)等；GO富集分析在BP上主要为细胞对氧化应激、活性氧、脂质等的生物学过程，在CC上表现为细胞膜、膜微区、膜筏等结构的细胞定位，在MF上表现为肾上腺素能受体、细胞因子、配体激活转录因子等分子功能；KEGG富集分析主要包括流体剪切应力和动脉粥样硬化、AGE-RAGE、癌症、钙信号通路、肿瘤坏死因子等通路。结论：复方双金颗粒有效成分可能通过各类氧化应激、炎症相关通路作用于泌尿系结石。
Abstract:
Objective: To explore the network relationship between the active components of Compound Shuangjin granules and urinary calculi through network pharmacology, and to explore the mechanism of action of compound Shuangjin granules. Methods: The effective components and corresponding targets of Compound Shuangjin granules were screened by TCMSP and BATMAN-TCM. The targets of urinary calculi disease were obtained from GeneCards, DisGeNET, OMIM and Drugbank databases. Venny2.1, an online software platform, was used to draw the intersection target Venn diagram of drugs and diseases. Metoscape database was used for gene ontology function (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis for intersection targets. Construct PPI network through STRING online database and import Cytoscape3.9.1 to obtain core target. Draw the active ingredient-target network via Cytoscape3.9.1. Results: There were 129 active components of Compound Shuangjin granules, which acted on 502 targets. There were 743 disease targets and 70 disease and drug intersection targets. Core targets include tumor necrosis factor (TNF), vascular endothelial growth factor A (VEGFA), nuclear factor erythrocyte 2-associated factor 2 (NFE2L2), interleukin-6 (IL6), interleukin-1β (IL1B), etc. In BP, GO enrichment analysis is mainly the biological process of cells to oxidative stress, reactive oxygen species, lipids, etc. In CC, it is the cell localization of cell membrane, membrane microregion, membrane raft and other structures. In MF, it is the molecular function of adrenergic receptors, cytokines, lig-and-activated transcription factors and so on. KEGG enrichment analysis mainly included fluid shear stress and atherosclerosis, AGE-RAGE, cancer, calcium signaling pathways, tumor necrosis factor and other pathways. Conclusion: The active components of Compound Shuangjin granules may act on urinary calculi through various pathways related to oxidative stress and inflammation.
1. 引言
泌尿系结石(urolithiasis)是泌尿外科的常见病，在住院患者中居首位。我国泌尿系结石整体发病率为1%~5%，南方高达5%~10%，年新发病率为(150~200)/10万人，其中25%的患者需住院治疗 [1]。其主要症状为疼痛及血尿，同时也是诊断该病的主要临床症状。复方双金颗粒以传统中医辨证施治理论作为基础，主要机理特点是利水通淋、排石止痛 [2]。本方由贵州中医药大学第二批全国名老中医药专家继承人常青主任医师在廖润泉教授多年的临床应用经验方基础上归纳、整理、总结而成。本方临床加减应用己1年有余，在临床上有明确的排石、止痛等效果，其安全有效，费用低廉，但在疗效方面尚缺少一定的临床数据支持。本文基于网络药理学探究复方双金颗粒治疗结石的作用机制，期望为该方后续研究及临床推广提供一定的理论支持。
2. 资料与方法
2.1. 复方双金颗粒活性成分及靶点筛选
通过中药系统药理学数据库分析平台(TCMSP)，对复方双金颗粒中11味药(金钱草、海金沙、车前草、萹蓄、葛根、白茅根、芍药、甘草、延胡索、枳壳、石韦)进行筛选，筛选标准为OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18。活性成分筛选完成后，再次筛选出对应靶标蛋白，通过Uniprot基因库(https://www.uniprot.org/)将靶标蛋白转换成靶点基因。因TCMSP数据库中不包含冬葵子及瞿麦，因此通过中药分子机制的生物信息分析工具(BATMAN-TCM) [3]，对复方双金颗粒中其余2味中药(冬葵子、瞿麦)进行分析，分析标准为Score cutoff = 20，P ≤ 0.05。
2.2. 复方双金颗粒治疗泌尿系结石潜在靶点的预测
以“urolithiasis”“kidney stone”“ureteral calculus”为关键词分别GeneCards (https://www.genecards.org/)、DisGeNET (https://www.disgenet.org/)、OMIM (https://omim.org/)、Drugbank (https://go.drugbank.com/)数据库中检索相关疾病靶点。通过Venny2.1.0在线平台绘制韦恩图，得到复方双金颗粒药物活性成分靶点与疾病靶点的交集靶点，即潜在的预测靶点，最终预测出70个靶点。
2.3. 复方双金颗粒治疗泌尿系结石的关键活性成分及靶点预测
通过Cytoscape3.9.1软件构建“中药–活性成分–疾病靶点”网络图，同时进行拓扑分析得到复方双金颗粒治疗泌尿系结石的关键活性成分及靶点。
2.4. 蛋白质–蛋白质相互作用网络(PPI)构建
通过STRING数据库(https://cn.string-db.org/)构建蛋白质互作网络，将预测的靶点70个导入该数据库，去除游离节点4个后导入Cytoscape3.9.1通过CytoNCA进行拓扑分析，筛选出复方双金颗粒治疗泌尿系结石的核心靶点蛋白。
2.5. 基因富集分析
通过Metoscape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，进行基因本体功能(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，P ≤ 0.01，Min Enrichment = 3。
3. 结果
3.1. 复方双金颗粒的活性成分及其作用靶点
在TCMSP及BATMAN-TCM中检索得到金钱草、海金沙、车前草、萹蓄、葛根、白茅根、芍药、甘草、延胡索、枳壳、石韦、冬葵子、瞿麦的活性成分分别为10、9、5、5、4、4、8、88、14、5、4、3、7种，其中共有成分13种。合并去重后得到129种活性成分，共作用于502个靶点。
3.2. 交集靶点
分别从GeneCards、DisGeNET、OMIM、Drugbank数据库中检索得出与泌尿系结石相关靶点447、290、32、57个，合并去重得到743个疾病相关靶点，与复方双金颗粒活性成分作用靶点取交集靶点，最终得出70个交集靶点(见图1)。
Figure 1. Intersection of drug and disease targets
图1. 药物–疾病靶点交集
Figure 2. Active ingredient-target network diagram (note: A1 - A8 two taste of Chinese traditional medicine ingredients, B1 - B5 many kinds of traditional Chinese medicine common composition, BMG, cogongrass rhizome, BS: radix paeoniae alba, BX: Bian storage, CQC, plantain, DKZ: winter sun, GC: licorice, GG: puerarin, HJS: sea sands, QM: dianthus superbus, SW: herba pyrrosiae, ZQ: orange, YHS: (Note: A1-A8 common constituents, B1-B5 common constituents, Polygonum aviculare, Polygonum aviculare, Polygonum aviculare, CQC: plantago, DKZ: DKZ, glycyrrhiza, GG: Radix glycyrrhiza, HJS: Haijinsha, QM: Qu Mai, SW: Shi Wei, ZQ: Fructus aurantii, YHS: Rhizoma Corydalis. The shape, size and shade changes in the figure are determined by Degree value)
图2. 活性成分–靶点网络图(注：A1-A8两味中药共有成分，B1-B5多味中药共有成分，BMG：白茅根，BS：白芍，BX：萹蓄，CQC：车前草，DKZ：冬葵子，GC：甘草，GG：葛根，HJS：海金沙，QM：瞿麦，SW：石苇，ZQ：枳壳，YHS：延胡索，图中形状大小、明暗变化由Degree值决定)
3.3. 活性成分–靶点网络构建
应用Cytoscape3.9.1软件绘制复方双金颗粒活性成分及作用靶点间的可视化网络(见图2)。发现degree靠前的成分主要为槲皮素、山萘酚、甾醇、亚油酸等。
3.4. PPI网络构建及核心靶点获取
将交集靶点导入STRING数据库，去除游离节点4个，成功构建PPI网络含有66个节点、525条边，将PPI网络导入Cytoscape3.9.1通过插件CytoNCA进行拓扑分析，经过筛选得出核心靶点11个(见图3)。核心靶点为肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A (VEGFA)、核因子红细胞2相关因子2 (NFE2L2)、基质金属蛋白酶-9 (MMP9)、一氧化氮合酶(NOS3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARG)、白细胞介素6 (IL6)、白介素-1β (IL1B)、过氧化氢酶(CAT)、表皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素(INS)。说明这些靶点可能是复方双金颗粒治疗泌尿系结石的核心靶点。在中药中的主要成分为槲皮素、芍药苷、山柰酚、儿茶素、亚油酸，说明中药中的这些成分在复方双金颗粒治疗泌尿系结石时起主要作用。
3.5. 靶点的GO功能和KEGG通路富集分析
通过Matescape平台对交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析后得到，生物学过程(BP)、分子功能(MF)、细胞定位(CC)相关条目(见图4)。KEGG通路富集分析得到142条信号通
Figure 3. PPI network and core target
图3. PPI网络及核心靶点
Figure 4. GO enriched column diagram and bubble diagram
图4. GO富集柱状图及气泡图
Figure 5. KEGG enrichment column and bubble diagram
图5. KEGG富集柱状图及气泡图
路，主要包括流体剪切应力和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、癌症通路、钙信号通路、化学致癌–受体激活、椎虫病、非酒精性脂肪肝、胰岛素抵抗、疟疾、糖尿病心肌病、癌症蛋白聚糖、类风湿性关节炎、MAPK信号通络、化学致癌–活性氧、肝细胞癌、肿瘤坏死因子信号通路等，多与炎症、血管病变、糖尿病、肿瘤相关(见图5)。
4. 讨论
通过网络药理学分析，复方双金颗粒中主要活性成分槲皮素、芍药苷、山柰酚、儿茶素、亚油酸。其中槲皮素 [4] 、山萘酚 [5] 均为黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化的作用，对泌尿系结石可能通过TLR4/NF-κB通路进行作用。芍药苷，具有抗炎、抗过敏、抗氧化作用，可能跟ERK/p38MAPK信号通路的激活有关 [6]。儿茶素属黄烷-3-醇类化合物，具有抗氧化、抗过敏、抗菌等作用，可能通过Nrf2信号通路进行作用 [7]。亚油酸是一种必须脂肪酸，具有抗炎的作用，可能通过TLR4/NF-κB通路进行作用 [8]。据此推测复方双金颗粒主要有效成分可能通过抗炎、抗氧化等对泌尿系结石起作用。
GO富集分析结果提示，复方双金颗粒有效成分在BP上主要为细胞对氧化应激、活性氧、脂质、激素、化学压力、有机环化合物等的生物学过程，在CC上表现为细胞膜、膜微区、膜筏、突触、树突、胞质囊腔等结构的细胞定位，在MF上表现为肾上腺素能受体、细胞因子、配体激活转录因子、核受体、受体配体、信号受体的活性及羧酸结合等分子功能。
KEGG通路富集分析结果显示，主要富集通路为以下通路，流体剪切应力和动脉粥样硬化通路，由于血管结构功能的异常使涡流产生，导致高血流剪切力下降，增大内皮细胞渗透性，使氧化应激产物和促炎因子增多 [9]。AGE-RAGE信号通路，血液中的葡萄糖含量过高时，会产生糖基化终末端(advanced glycation endproducts, AGEs)，可与其受体结合，即晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end product, RAGE)结合，最终可促进氧化应激及炎性反应 [10]。脂质和动脉粥样硬化通路，血管壁脂质沉积、纤维化、钙化等血管病变导致动脉粥样硬化，其中重要的环节为血管内皮的氧化应激和炎症 [11]。癌症通路 [12]，其中氧化应激状态下可使机体产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，在大量ROS刺激下可造成细胞异常的增殖、分化、突变、癌变等 [13]。钙信号通路 [14] 、肿瘤坏死因子通路 [15]，MAPK信号通路 [16] 等，均在氧化应激及炎症方面起着重要作用。此外FOXO信号通路 [17] 、P13K-Akt信号通路 [18] 同氧化应激、癌症通路等密切相关。
综上推测，复方双金颗粒有效成分可能通过各类氧化应激、炎症相关通路作用于疾病相关靶点，核心靶点TNF、VEGFA、Nrf2、NOS3、PPARG、IL6、IL1B等均与氧化应激、炎症相关。对于复方双金颗粒网络药理学探究，可为后期对复方双金颗粒的进一步研究提供一定的理论依据。