1. 引言
芝麻，又名脂麻、胡麻，一年生直立草本植物，是中国主要油料作物之一。芝麻中油脂、不饱和脂肪酸和蛋白质含量较高，还有芝麻素、芝麻酚、维生素A、维生素E、卵磷脂、钙、铁、铬等营养成分。芝麻常被加工成芝麻油、芝麻糊、芝麻酱等产品，其中芝麻酱因其浓香醇厚的独特风味而深受消费者喜爱 [1] [2]。目前，市场上的芝麻酱产品口感单一，不能满足多样化的市场需求 [3]。另外，芝麻及其深加工产品在储存过程中油脂容易出现氧化哈败等现象，影响产品的保质期 [4] [5]。对于芝麻酱制品来说，这一现象严重影响了芝麻酱的货架寿命，降低了芝麻酱的品质，制约了芝麻酱行业的发展 [6]。
牛肉，指从牛身上获得的肉，为常见的肉品之一。牛肉含有丰富的营养价值，其中最突出的是蛋白质、铁、钙、锌、肌氨酸、维A、维B1的含量，具有滋养脾胃、降胆固醇、提高机体免疫力等功效，其味道鲜美，具有“肉中骄子”的美称 [7]。2017年，全球牛肉消费量为5936.2万吨，中国的年消费量为798.5万吨，位于第4位。中国虽然是牛肉进出口大国以及消费大国，却不是牛肉加工强国 [8]。我国牛肉的附加值非常低，且多为中低端产品，发达国家牛肉加工附加值高达30%~40%，而我国仅为3%~4% [9]。
美拉德反应是指氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白质)与羰基化合物(糖类)之间的非酶褐变反应经过一系列的复杂历程，最终生成含各种小分子和高分子的棕色甚至黑色的混合物。这些混合物称为美拉德反应产物(Maillard Reaction Products，简写MRPs) [10]。美拉德风味肽是MRPs中一类具有风味特征的短肽类化合物。在食品的加热或储存过程中，美拉德反应产物对香气和颜色有所影响，如：为面包提供金黄的颜色和诱人的香味；对茶叶的香气、色泽、滋味及品质的形成具有重要作用 [11] - [16]。文献 [17] 以谷氨酸和木糖为起始原料，通过美拉德反应制备美拉德反应中间体，从反应物配比、初始反应pH及真空脱水方法等方面进行优化，提高了水相中反应中间体转化率，显著提高了桃酥中吡嗪、吡咯的含量，丰富了焙烤风味。另外，美拉德反应产物还具有各种生物活性，能降低胃肠对蛋白质或氨基酸的消化性，从而增加其进入大肠并被肠道微生物发酵和利用的可能性 [18]。美拉德反应产物还具有抗氧化活性。麦芽在焙焦过程中产生的类黑精等物质，在黑啤酒中的抗氧化能力可以达到95%，较麦芽本身含有的酚类抗氧化物质的抗氧化性更强。因此，美拉德反应产物可被作为啤酒中的主要抗氧化剂 [19] [20]。
本研究以芝麻粕为原料制得美拉德风味肽，加入以牛肉、豆瓣酱、芝麻、花生和复合调料为主的牛肉芝麻酱中，拟开发一种既有牛肉与芝麻的鲜香，豆瓣的香辣，又有美拉德风味肽所带来的浓厚和鲜香味的牛肉芝麻酱。并且，通过添加美拉德风味肽，提升产品的氧化稳定性。
2. 材料和方法
2.1. 试验材料
豆瓣酱(成都兆丰和食品有限公司)、料酒(湖州老恒和酿造有限公司)、金龙鱼调和油(上海嘉里食品工业有限公司)、芝麻粕(安徽达园粮油有限公司)、牛肉、芝麻、花生、大葱、小葱、生姜、蒜、干辣椒、香叶、花椒、肉蔻、枸杞、八角、白砂糖、食盐(购于合肥市照山农贸市场)、碱性蛋白酶(2 × 105 U/g，邢台万达生物工程有限公司)、中性蛋白酶(3 × 105U/g，邢台万达生物工程有限公司)、风味蛋白酶(5 × 104 U/g，邢台万达生物工程有限公司)、木瓜蛋白酶(6 × 104 U/g，邢台万达生物工程有限公司)、氢氧化钠(分析纯，上海梯希爱化成工业发展有限公司)、D-木糖(上海梯希爱化成工业发展有限公司)、半胱氨酸(上海梯希爱化成工业发展有限公司)。
2.2. 仪器及设备
电子天平(JZC-1000MSE，福州科迪电子技术有限公司)、电热锅(C21-SN2105T，美的集团有限公司)、组织破碎机(BL-010，广州铂飞厨房设备有限公司)、中药粉碎机(FW100，天津市泰斯特仪器有限公司)、水浴锅(HH-6，上海力辰仪器科技有限公司)、油浴锅(HH-6，上海力辰仪器科技有限公司)、台式高速离心机(HT190，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、高温灭菌锅(LDZX-50KBS，南京晓晓仪器设备有限公司)、Rancimat氧化酸败仪(743，北京联合科力科技有限公司)、冷冻干燥机(FD-1A-50，上海争巧科学仪器有限公司)，以及量筒、烧杯、铝锅、药匙、移液管、菜刀及菜板等。
2.3. 试验方法
2.3.1. 工艺流程
牛肉芝麻酱工艺流程如图1所示。
Figure 1. Process flow of beef tahini
图1. 牛肉芝麻酱工艺流程
2.3.2. 操作要点
1) 原料预处理
牛肉洗净，去血水，剔除筋腱，切成1 cm3的正方体肉块，添加3~5倍体积的纯净水，添加0.2%木瓜蛋白酶，调节pH为6，在40℃~60℃下，酶解1 h。葱、姜、蒜清理除杂，用水洗净后，用组织破碎机打两分钟备用。辣椒、香叶、花椒、肉蔻、八角、枸杞清理去杂后，用中药粉碎机粉碎两分钟成粉状备用。
2) 牛肉的预煮
将预处理后的125 g牛肉(组织破碎机打5分钟)加入电热锅中，同时加入500 ml纯净水，放入辣椒2 g、香叶2 g、八角5 g、花椒2 g、肉蔻10 g、白砂糖1 g，食盐3 g，料酒15 ml，小火边搅拌边焖煮，使肉与汁液均匀受热，并除去浮沫，煮沸后保持40~60 min。将煮好的牛肉捞出，用组织破碎机将其打碎成肉末备用。
3) 复合调料的制备
在电热锅中加入250 ml调和油，点火加热，使油温快速上升至220℃~230℃，调小火焰，将大蒜20 g、生姜5 g、葱段50 g依次加入，将其炸干炸香。关掉火，将大蒜、生姜、葱段捞出弃去，将辣椒5 g加入，利用锅中油的余温将其炸香后捞出弃去。调味油经过过滤装入烧杯中，待用。
4) 芝麻、花生预处理
芝麻预处理：芝麻分选后水洗，干燥后170℃烘烤20 min。冷却后芝麻磨浆。
花生预处理：花生分选后水洗，干燥后140℃烘烤30 min，冷却后将花生脱皮破碎为小粒花生碎并磨浆。
5) 美拉德风味肽的制取
参考余敏等 [21] 的美拉德风味肽制备方法，在此基础上进行修改制取美拉德风味肽。
芝麻多肽制取工艺：芝麻粕粉碎后过100目筛，按质量比1:10加入超纯水并搅拌均匀，并于80℃下预煮30 min。用4 mol/L的NaOH溶液调pH至9.5，搅拌浸提4 h后，离心(8000 r/min)取上清液即为芝麻蛋白液。将芝麻蛋白液初始pH调至9.5，添加质量分数为1%碱性蛋白酶在50℃下酶解2 h后，90℃加热15 min灭酶。再用4 mol/L的HCl溶液调pH至6.5，添加0.8%的木瓜蛋白酶、0.8%的中性蛋白酶和0.5%的风味蛋白酶于55℃下酶解3 h后，90℃加热15 min灭酶。离心(8000 r/min)取上清液，冷冻干燥后粉碎过60目筛，即为芝麻多肽。
美拉德风味肽的制取工艺：取10 ml超纯水，加入0.1 g芝麻多肽、0.1 g半胱氨酸和0.2 g木糖混匀后，置于螺旋密封管中，于180℃油浴反应90 min后，反应物置于冰水中快速冷却至室温，冷冻干燥后粉碎过60目筛，即为美拉德风味肽。
6) 牛肉芝麻酱的制备
将制备好的复合调料(计量)加入电热锅中开火加热，调节开关控制火焰，油温升至180℃左右，放入制备好的豆瓣酱(计量)进行炒制，关小火后倒入牛肉末(计量)，枸杞粉(计量)，芝麻酱(计量)，花生(计量)，美拉德风味肽(计量)和44.8%水，翻炒至浓稠状，使各种原辅料充分混合、渗透和熟化，制得的成品酱中水分含量：≤28%。
7) 灌装
根据不同产品包装形式的要求，用天平校准产品净含量，调整灌装机灌装精度，进行灌装，灌装后及时封口，放入灭菌锅中，在120℃~130℃杀菌30 min，冷却后贴标，即为成品。
2.3.3. 单因素试验
1) 豆瓣酱的添加量对感官品质的影响
固定添加芝麻7.75%、复合香料4%、花生5.75%、美拉德风味肽0.3%、牛肉粒10%、枸杞0.95%，分别加入30、35、40、45及50%的豆瓣酱。以色泽、风味、口感和组织状态为指标，确定豆瓣酱的最适添加量。
2) 芝麻添加量对感官品质的影响
固定添加豆瓣酱40%、复合香料4%、花生5.75%、美拉德风味肽0.3%、牛肉10%、枸杞0.95%，分别加入3.75、5.75、7.75、9.75及11.75%的芝麻。以色泽、风味、口感和组织状态为指标，确定芝麻的最适添加量。
3) 花生的添加量对感官品质的影响
固定添加豆瓣酱40%、芝麻7.75%、复合香料4%、美拉德风味肽0.3%、牛肉10%、枸杞0.95%，分别加入4.75、5.75、6.75、7.75及8.75%的花生。以色泽、风味、口感和组织状态为指标，确定花生的最适添加量。
4) 复合香料的添加量对感官品质的影响
固定添加豆瓣酱40%、芝麻7.75%、花生5.75%、美拉德风味肽0.3%、牛肉10%、枸杞0.95%，分别加入2、3、4、5及6%的复合香料。以色泽、风味、口感和组织状态为指标，确定复合调料的最适添加量。
5) 美拉德风味肽的添加量对感官品质的影响
固定添加豆瓣酱40%、芝麻7.75%、复合香料4%、花生5.75%、牛肉10%、枸杞0.95%，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4及0.5%的美拉德风味肽。以色泽、风味、口感和组织状态为指标，确定美拉德风味肽的最适添加量。
6) 牛肉的添加量对感官品质的影响
固定添加豆瓣酱40%、芝麻7.75%、复合香料4%、花生5.75%、美拉德风味肽0.3%、枸杞0.95%，分别加入4、6、8、10及12%的牛肉。以色泽、风味、口感和组织状态为指标，确定牛肉的最适添加量。
7) 枸杞的添加量对感官品质的影响
固定添加豆瓣酱40%、芝麻7.75%、复合香料4%、花生5.75%、美拉德风味肽0.3%、牛肉10%，分别加入0.85、0.95、1.05、1.15及1.25%的枸杞。以色泽、风味、口感和组织状态为指标，确定枸杞的最适添加量。
2.3.4. 产品配方正交试验
在单因素试验结果基础上，筛选出对牛肉芝麻酱感官质量影响较大的4个因素(分别是芝麻、豆瓣酱、美拉德风味肽、枸杞)，进行L9 (34)正交试验。以色泽、口感、组织形态、香气和滋味为评价指标，根据感官质量，确定芝麻、豆瓣酱、美拉德风味肽和枸杞对牛肉芝麻酱感官质量影响的主次顺序和最优组合。因素水平表如表1所示。
Table 1. Orthogonal test factors and level table of product formula
表1. 产品配方正交试验因素及水平表
组织8个人的感官评定小组对牛肉芝麻酱进行感官评定，评定满分为100分，评价指标包括色泽(25分)、香气与滋味(25分)、口感(30分)、组织形态(20分)4个方面，感官评分标准如表2所示。
Table 2. Sensory evaluation criteria for beef tahini
表2. 牛肉芝麻酱感官评分标准表
2.3.5. 牛肉芝麻酱稳定性分析
参考刘玉兰等 [22] 的氧化诱导时间测定方法。准确称取5 g牛肉芝麻酱，分离出油脂，将其置于Rancimat氧化酸败仪中，控制空气流速为20 L/h，分别在110、120、130及140℃下，测定氧化诱导时间。
2.3.6. 牛肉芝麻酱水分、氨基酸态氮的测定
参照《GB/T 5009.3-食品安全国家标准食品中水分的测定》 [23]。采用直接干燥法测定水分含量。参照《GB5009.235-2016-食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》 [24]，采用酸度计法测定氨基酸态氮含量。
2.3.7. 统计分析
所有试验重复三次。采用ORIGIN 2021软件处理数据，结果以平均值±标准差表示。
3. 结果与分析
3.1. 单因素试验
3.1.1. 豆瓣酱的添加量对产品感官品质的影响
考察不同豆瓣酱添加量(30%~50%)对牛肉芝麻酱感官质量的影响，结果如图2所示。随着豆瓣酱添加量的增加，感官质量呈现明显的上升趋势。添加量达到40%时，感官评分最高，达到82.25分。随后豆瓣酱添加量继续增加，感官评分却逐渐下降。整个变化过程可以分析如下：一方面，发酵过程中产生的多肽、氨基酸和脂肪酸等，使豆瓣酱具有独特的风味特性，可以提高产品的酱香。因此，随着豆瓣酱添加量的增加，产品感官质量明显上升。另一方面，豆瓣酱本身呈深褐色且制作过程中添加盐等调味品。随着豆瓣酱添加量的增加，产品颜色过深过暗且口味过咸，导致感官质量逐渐下降。故选择豆瓣酱添加量为40%。
3.1.2. 芝麻添加量对产品感官品质的影响
考察不同芝麻添加量(3.75%~11.75%)对牛肉芝麻酱感官质量的影响，结果如图3所示。随着芝麻添加量的增加，感官质量先呈现上升趋势，并且在添加量为8%时感官评分最高，达到82.00分。随后芝麻添加量继续增加，感官质量明显下降。这种现象可分析如下：首先，由于芝麻酱在制作过程中会产生吡嗪类、醛类、呋喃类、醇类等挥发性风味物质，使产品带有芝麻高温烘烤过后的特殊香气，风味层次更加丰富。因此，在添加量小于8%时，随着豆瓣酱添加量的增加，产品感官质量明显上升。其次，芝麻酱本身呈土黄色。随着芝麻酱添加量的增加，造成产品颜色过浅，影响感官评定员的食欲，导致感官质量逐渐下降。故选择芝麻添加量为8%。
Figure 2. Effect of bean paste addition on sensory quality
图2. 豆瓣酱添加量对牛肉芝麻酱感官质量的影响
Figure 3. Effect of seasame paste addition on sensory quality
图3. 芝麻酱添加量对牛肉芝麻酱感官质量的影响
3.1.3. 花生的添加量对感官品质的影响
考察不同花生添加量(4.75%~8.75%)对牛肉芝麻酱感官质量的影响，结果如图4所示。当花生添加量小于5.75%时，随花生添加量的增加感官质量有显著上升趋势，并且在添加量为5.75%时感官评分最高，达到82.12分。而当花生添加量大于5.75%时，感官评分有较为明显的下降趋势，并且在添加量为8.75%时感官分数最低，为74.37分。出现这种现象是由于，花生预处理后带有浓郁炒花生香味，丰富了产品的风味层次。因此，在添加量小于5.75%时，随着豆瓣酱添加量的增加，产品感官质量明显上升。然而花生口感和香气较于芝麻更为明显，当添加量继续增加时，酱体呈现明显的土黄色，且花生香气过重，并非牛肉芝麻酱所需要的滋味与色泽，导致产品感官质量下降。故选择花生的添加量为5.75%。
Figure 4. Effect of peanut paste addition on sensory quality
图4. 花生添加量对牛肉芝麻酱感官质量的影响
3.1.4. 复合香料的添加量对感官品质的影响
考察不同复合香料添加量(1%~5%)对牛肉芝麻酱感官质量的影响，结果如图5所示。当复合调料的添加量小于3%时，产品感官评分随复合调料的添加而迅速上升，并且在添加量为3%时感官评分最高。而复合调料添加量超过3%时，产品感官评分明显下降。可能是由于添加少量复合调料时，酱体色泽较暗无光泽，产品滋味较为平涩，当复合调料添加量过多时，酱体与复合调料出现分层，口感较为油腻。当复合调料的添加量为3%时，酱体有光泽且不易出现分层，产品口感顺滑不涩口，感官得分最高。故选择复合调料的添加量为3%。
Figure 5. Effect of spices addition on sensory quality
图5. 复合香料添加量对牛肉芝麻酱感官质量的影响
3.1.5. 美拉德风味肽的添加量对感官品质的影响
考察不同美拉德风味肽添加量(0%~0.4%)对牛肉芝麻酱感官质量的影响，结果如图6所示。随美拉德风味肽的增加，牛肉芝麻酱感官评分逐渐上升。在添加量为0.3%时，感官评分达到最高，为82.37分。然而添加量高于0.3%后，产品感官质量出现下降趋势，感官评分在添加量为0.4%时下降至77.00分。可能是由于美拉德反应的过程中吡嗪类、吡咯类、嘧啶类、含硫类、酚类物质的产生，美拉德风味肽带有浓郁肉香。所以适量的添加美拉德风味肽可以赋予牛肉芝麻酱浓郁的肉香味和烧烤味。但添加量超过0.3%时，其风味过于突出，掩盖了其他原辅料香气，使得整体香气不协调。当美拉德风味肽的添加量为0.3%时，产品风味层次丰富且整体气味协调，感官质量最高。故选择美拉德风味肽的添加量为0.3%。
Figure 6. Effect of Maillard flavor peptide addition on sensory quality
图6. 美拉德风味肽添加量对牛肉芝麻酱感官质量的影响
3.1.6. 牛肉的添加量对感官品质的影响
考察不同牛肉添加量(4%~12%)对牛肉芝麻酱感官质量的影响，结果如图7所示。随牛肉的增加，牛肉芝麻酱感官评分逐渐上升。当牛肉添加量为12%时，产品感官评分最高(93.75分)。但添加量超过10%后，产品感官评分上升趋势逐渐平缓。这种结果是由于，适量的添加牛肉可以提高牛肉芝麻酱的肉香味和口感，但添加量超过10%后，对牛肉芝麻酱整体的感官质量影响不大。所以基于成本的考虑，选择牛肉的添加量为10%。
Figure 7. Effect of beef addition on sensory quality
图7. 牛肉粒添加量对牛肉芝麻酱感官质量的影响
3.1.7. 枸杞的添加量对感官品质的影响
考察不同枸杞添加量(0.85%~1.05%)对牛肉芝麻酱感官质量的影响，结果如图8所示。当枸杞添加量小于0.95%时，随枸杞添加量的增加感官评分有显著上升趋势。当添加量为0.95%时，产品在香辣的同时带有一丝甘甜，感官得分最高(87.87分)。而当添加量大于0.95%时，感官评分有较为明显的下降趋势。可能是由于当添加量过多时，芝麻酱入口虽然甘甜但带有酸涩味。故选择枸杞的添加量为0.95%。
Figure 8. Effect of Chinese wolfberry addition on sensory quality
图8. 枸杞添加量对牛肉芝麻酱感官质量的影响
3.2. 产品配方的正交试验
单因素试验的结果为：豆瓣酱40%、芝麻7.75%、花生5.75%、复合香料6.5%、美拉德风味肽0.3%、牛肉10%和枸杞0.95%。选取对产品感官质量影响较大的芝麻酱、豆瓣酱、美拉德风味肽及枸杞添加量来进行四因素三水平的L9(34)正交试验。选择各因素水平为芝麻添加量(5.75、7.75及9.75%)、豆瓣酱添加量(35、40及45%)、美拉德风味肽添加量(0.2、0.3及0.4%)及枸杞添加量(0.85、0.95及1.05%)。其他因素固定为：花生5.75%、复合香料3%及牛肉10%。结果由表3所示。因素A、B、C、D对应的极差R分别为4.72、2.90、2.70、6.68，故可得对牛肉芝麻酱感官品质影响因素的主次顺序为：D > A > B > C。在芝麻酱的添加量因素中K1最高，说明在芝麻酱添加量因素中选取A1水平；在豆瓣酱的添加量因素中K1最高，说明在豆瓣酱添加量因素中选取B1水平；在美拉德风味肽的添加量因素中K3最高，说明在美拉德风味肽添加量因素中选取C3水平；在枸杞的添加量因素中K3最高，说明在枸杞添加量因素中选取D3水平。故由极差分析可得芝麻酱、豆瓣酱、美拉德风味肽、枸杞的最优配方组合为A1B1C3D3，即芝麻酱5.75%、豆瓣酱35%、美拉德风味肽0.4%、枸杞1.05%。并在此条件下，进行3次平行验证试验，验证值与预测值的误差在允许误差5%内，说明该模型合理可靠。
Table 3. Experimental results of orthogonal design
表3. 正交试验结果分析
3.3. 氧化诱导时间
为了提高牛肉芝麻酱氧化稳定性，加入不同添加量(0.2%、0.3%及0.4%)的美拉德风味肽并研究其对牛肉芝麻酱的诱导氧化时间的影响，结果如图9所示。添加了美拉德风味肽的牛肉芝麻酱的氧化诱导时间均随氧化温度的升高而减少，这与温度越高油脂越容易发生氧化反应的原理是一致的。同时，不添加美拉德风味肽的芝麻酱初始氧化诱导时间为8.7 h，添加美拉德风味肽的样品中，添加0.4%的初始氧化诱导时间最长，为14.8 h，比不添加的样品的氧化诱导时间延长了6.1 h，说明美拉德风味肽的添加有利于增强芝麻酱抗氧化性。在140℃的加速氧化条件下，不添加美拉德风味肽的样品氧化诱导时间由初始的8.7 h缩短至4.8 h，添加0.4%美拉德风味肽的氧化诱导时间由初始的14.8 h缩短至6.5 h，添加0.4%和添加0.3%的样品氧化诱导时间在140℃时差别较小，说明添加0.3%和添加0.4%的抗氧化作用趋于相近。考虑到添加0.4%美拉德风味肽时感官质量得分较高，选择美拉德风味肽添加量0.4%较为合适。
Figure 9. Effects of Maillard flavor peptide supplement allevelon oxidation induction time
图9. 美拉德风味肽添加量对氧化稳定性的影响
3.4. 产品水分及氨基酸态氮含量
在实验室测定最佳方案产品的水分含量为26.8%，氨基酸态氮含量为0.58 g/100ml，满足国家标准，为合格产品。
4. 结论
本文以豆瓣酱、花生、芝麻、美拉德风味肽、牛肉及枸杞为主要原料，以感官质量为评价指标，依次通过单因素和四因素三水平L9(34)正交试验，得到一种风味层次丰富且氧化稳定性较高的牛肉芝麻酱。产品最佳的配方为：牛肉10%，枸杞1.05%，豆瓣酱35%，芝麻8%，花生5.75%，复合香料3%，美拉德风味肽0.4%。此配方所得的牛肉芝麻酱既有牛肉与芝麻的鲜香，豆瓣的香辣，又有美拉德风味肽所带来的浓厚和鲜香味。并且，当美拉德风味肽的添加量达到0.4%时，产品在110℃下的氧化诱导时间从8.7 h提高至14.8 h，提高了6.1 h，表明添加美拉德风味肽后牛肉芝麻酱的储存稳定性显著提高。本研究可为芝麻酱产品进一步的开发与利用提供理论依据。
基金项目
1) 国家自然科学基金项目“基于分子修饰的黑米花青素对肠道益生菌的增殖作用及构效关系研究，项目编号：31771974”；
2) 2019年度安徽省科技重大专项项目“芝麻高值化加工关键技术研究及产业化”，项目编号： 201903a06020024。
NOTES
*通讯作者。