1. 引言

茴香醛(p-anisaldehyde, 4-methoxybenzaldehyde)又称对茴香醛、对甲氧基苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛、大茴香醛，是一种重要的香料，具有强烈的茴芹和山楂香气，芬芳持久，在很多日用化工、食品加工中被广泛用于香精的生产；作为无氰镀锌添加剂的优良光亮剂，它能在较宽的电流范围内提高阳极极化，获得光亮镀层；在医药工业用于制造抗微生物的药物羟氨苄基青霉素等，是抗组织胺药物的中间体。

八角(大茴香，大料，star anise，拉丁学名：Illicium verum)是著名的调味香料和中药，在食品和医药有重要应用。广西是八角的主产区，八角及其提取物茴香油是目前主要的产品形式，在深加工方面仍然薄弱，附加值低。茴香油中的主要成分是反式茴脑(在茴香油中的含量为85%~95%)，用生物合成法将反式茴脑转化生成的茴香醛可归为天然香料，对提高广西八角产业的附加值具有重要意义。

反式茴脑(trans-anethole)又称反式茴香烯、反式对甲氧基丙烯基苯(trans-p-methoxypropenylbenzene)、反式对丙烯基苯甲醚(trans-p-propenylanisole)，是八角茴香油中的主要成分。自然界存在很多可以反式茴脑为唯一碳源的微生物，它们可将反式茴脑代谢为一系列产物，其中就包括茴香醛。目前市场上的茴香醛大部分产品是用化学法合成，存在分离困难、反应条件苛刻、污染严重等问题。根据欧洲和美国的法律规定，“天然”香料只能从物理过程(从天然原料中萃取)或酶、微生物工艺来制备，因此用微生物、酶来合成的茴香醛可归为更受市场欢迎的“天然”香料 [1] [2] [3]，而且不会受到季节、气候的限制。

2. 产茴香醛的真菌

目前文献报道的合成茴香醛的真菌大部分是白腐菌，也有极少量霉菌、酵母菌。担子菌Pleurotus菌丝体在MYG (麦芽浸膏，酵母粉，葡萄糖)培养基生长，发酵液中会出现茴香醛。这个培养过程没有涉及到反式茴脑，一般认为是由芳基醇氧化酶(aryl-alcohol oxidase, AAO)将从莽草酸途径生成的茴香醇氧化生成茴香醛，同时将分子氧转变为过氧化氢 [4] [5] [6]。担子菌Pleurotus sapidus的菌丝体可将反式茴脑转化为茴香醛。经过疏水作用层析与离子交换层析纯化、质谱分析，研究人员鉴定出催化生成茴香醛的酶是染料脱色过氧化物酶(DyP)。Mn²⁺和过氧化氢酶可提高酶的催化活性 [7] [8]。

奥地利Wolfgang Kroutil课题组筛选出一株白腐担子菌Trametes hirsuta G FCC047，可以将反式茴脑转化为茴香醛，用细胞裂解液作催化剂的反应得率为83% [9]。此后，该课题组进行了一系列深入研究，包括底物特异性、金属离子的影响、氧的影响、反应条件的优化，克隆了该酶的基因并在大肠杆菌中表达出了重组酶 [10]。研究表明，催化反式茴脑生成茴香醛的酶AlkCE是一种依赖于Mn³⁺的蛋白酶，与Trametes versicolor FP-101664 SS1的天冬氨酸肽酶A1有90%的一致性。该酶含412个氨基酸残基，在大肠杆菌中表达量极低，SDS-PAGE无法检出。当用大肠杆菌表达缺失N-端84个氨基酸残基的截短AlkCE时，SDS-PAGE可检测到重组酶条带，但大部分不可溶，可溶部分的重组蛋白可将反式茴脑转变成茴香醛，而且该蛋白会降解自己，降低可溶部分的蛋白量，无法满足动力学研究要求 [11] [12] [13]。该酶催化反应的机制不是经典的双加氧酶或单加氧酶机制 [14]。该课题组还意外发现辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶、Coprinus cinereus过氧化物酶可催化反式茴脑生成茴香醛，同时生成副产物1-(4'-甲氧基苯基)丙烷-1,2-二醇 [15]。

国内也有一些真菌合成茴香醛的报道，但没有任何一篇分离鉴定出相关的酶。广西大学粟桂娇等筛选出一株黑曲霉ZJ-9，可将反式茴脑转化为茴香醛、茴香酸 [16]。广西大学李海云分离出多株可降解反式茴脑的真菌，其中Lasiodiplodia pseudotheobromae BJEF32可利用反式茴脑合成异香兰酸，推测其代谢途径为：反式茴脑、反式茴脑环氧化物、反式茴脑二醇、茴香醛/茴香醇、茴香酸、异香兰酸 [17]。苏畅等筛选得到一株转化茴香醛能力较高的菌株Saccharomyces cerevisiae S11，并初步研究了其培养转化条件，转化12 h，茴香醛的产率达到0.19% [18]。

3. 产茴香醛的细菌

以色列Eyal Shimoni等从土壤中筛选到一株以反式茴脑、茴香酸或茴香醇为唯一碳源的细菌Arthrobacter aurescens TA13。反式茴脑可诱导菌体表达出4-甲氧基苯甲酸O-脱甲基酶，对羟基苯甲酸3-羟化酶，原儿茶酸4,5-双加氧酶。由此作者推测反式茴脑的中间代谢产物有反式茴脑二醇、茴香醛、茴香酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸。通过对突变株的分析，作者推测出反式茴脑的代谢途径及催化每个步骤的酶 [19] [20]。

奥地利Kerstin Steiner课题组从超嗜热厌氧菌Thermotoga maritima中分离出一个金属蛋白TM1459，对苯乙烯衍生物有活性，可将反式茴脑转化成茴香醛，转化率为11% [21] [22]。

韩国光州科技院的Hor-Gil Hur研究组从土壤中分离到Pseudomonas putida JYR-1，该菌能以高浓度的反式茴脑(100 mM)为唯一碳源和能源，代谢产物包括茴香脑环氧化合物、茴香酸和对羟基苯甲酸 [23]。推断的代谢途径与Arthrobacter aurescens TA13的非常相似。该研究组通过构建菌株JYR-1的基因组文库、Tn5突变分析，分离出一个长度为1047 nt的ORF，该ORF可使大肠杆菌将反式茴脑转变为茴香醛，证实ORF编码的产物为反式茴脑加氧酶(TAO, trans-anethole oxygenase)。该酶催化反式茴脑的加氧反应，需要NADH辅酶，不需要类似辅助蛋白的电子传递黄素还原酶，因此属于自给自足类型(self-sufficient)的单组分黄素蛋白单加氧酶。与异丁香酚单加氧酶的底物谱相比，TAO的底物谱较宽，除了反式茴脑，还能够催化异丁香酚、O-甲基异丁香酚、异黄樟素分别生成香草醛、藜芦醛、洋茉莉醛 [24] [25] [26]。在四种底物中，TAO对反式茴脑的催化效率最高，但最高的转换数却是以异丁香酚作底物时得到。FAD与NADH是TAO催化反应时需要的辅因子，FMN、NADPH也可作辅因子，但催化效率较低。Trp-38、Thr-43、Tyr-55可能涉及到TAO与FAD的结合，突变体(W38A/T43A/Y55A)的活力仅为野生型的1.6%，可见这三个氨基酸残基有关键作用。TAO催化反式茴脑转变为茴香醛的过程，很可能经历了环氧化、环氧基的水解、C-C键的断裂等过程。目前发现的催化环氧化反应的天然黄素蛋白单加氧酶，大多数都是双组分单加氧酶，而TAO与它们不同，只是一个组分，就可催化环氧化反应。与双组分的单加氧酶相比，自给自足的单加氧酶表现出更高的催化效率。这是国际上首次报道的反式茴脑加氧酶(trans-anethole oxygenase, TAO)，其反应如图1所示。底物为反式茴脑，被TAO催化变成茴香醛，同时NADH被氧化为NAD⁺。该研究组还进一步分离出了将茴香醛氧化为茴香酸的茴香醛脱氢酶基因paadh。将tao基因与paadh基因在大肠杆菌中共表达，可从反式茴脑生成茴香酸 [21]。

江南大学闻鹏等对Pseudomonas putida JYR-1的tao基因(GenBank No: HQ889281)进行定向进化，不过他们的研究目的不是为了提高茴香醛产量，而是通过易错PCR筛选出突变的TAO，得到的突变酶可高效地将反式茴脑转变为茴香醛、将异黄樟素转变为洋茉莉醛 [27]。

广西大学武波课题组以反式茴脑为唯一碳源，筛选得到一株细菌Burkholderia WGB30，培养60 h茴香醛的摩尔转化率达到5.08% [28]。此外，他们还筛选到可以催化反式茴脑生成茴香酸的WGBP9、Burkholderia sp. WGB31以及Pseudomonas sp. AT39 [29] [30] [31]，从Pseudomonas sp. AT39的DNA中克隆了反式茴脑加氧酶基因tao，再通过质粒导入AT39菌体细胞，显著提高了茴香酸的产量及转化率。广西大学粟桂娇、广西中医药大学张健等也分离出了利用反式茴脑合成茴香酸的假单胞菌 [32] [33]，但均未涉及到酶的分离和基因的克隆。虽然这几篇论文关注的重点是茴香酸，均未提到茴香醛，但从现有的文献来看，细菌降解反式茴脑都要经过中间产物茴香醛才能得到茴香酸。

目前文献公开报道的反式茴脑加氧酶均来自Pseudomonas假单胞菌属，没有发现其他细菌的反式茴脑加氧酶。鉴于能够将反式茴脑转化生成茴香醛的细菌有多种，不仅仅局限于假单胞菌属，因此随着研究的深入，应该会发现更多其他种类细菌的反式茴脑加氧酶。

4. 展望

从已经发表的文献来看，虽然发现了多种微生物可以合成茴香醛，但产量、时空产率都比较低，无法达到工业生产的要求。反式茴脑、茴香醛对微生物均有较强的毒性 [34]，因此在利用微生物合成茴香醛时要设法克服。一方面通过反式茴脑加氧酶基因的克隆与改造，实现酶的高效表达及固定化；另一方面，建立原位产物分离工艺(in situ product removal, ISPR)，探索高效的茴香醛生物合成与分离方法，这对广西八角产业水平的提升具有重要的理论及应用价值。

基金项目

玉林市自然科学基金(玉市科能20183201)，广西自然科学基金(2020GXNSFAA259015)。

参考文献