1. 引言
我国糖尿病的发病率以达10%以上，其中近一半死于心血管合并症。糖尿病的严重合并症之一，即糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM) [1] ，发病机制十分复杂，迄今尚不明确。钙敏感受体(CaSR)属于G蛋白耦联受体超家族C家族成员之一，在国际研究已经成为热点内容，国内研究刚起步，主要集中对肾脏、胃肠道、神经系统等方面进行研究，在心血管系统研究的较少 [2] 。本实验主要检测DCM大鼠不同时段心肌组织CaSR蛋白的表达规律及心肌超微结构损伤的程度，为进一步揭示DCM的发生机制以及指导临床治疗奠定了一定的理论基础。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
健康雄性Wistar大鼠(210 g~250 g)购自哈尔滨医科大学附属二院动物研究所。
2.2. 主要试剂
佐链脲菌素(STZ, Biosharp, Japan)，AA、TEMED、浓缩胶浓缩液、分离胶浓缩液、转移缓冲液、电泳缓冲液(北京普利莱)；蛋白定量试剂盒(北京碧云天)，GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz, CA)，CaSR抗体(Alpha Diagnostic International Inc., USA)，其他试剂为国产分析纯。
2.3. 主要器材
BECKMAN低温离心机，透射电镜(H-7650, Japan)，Western blot电泳槽(北京六一厂)，紫外分光光度计(US-640)，紫外凝胶检测和成像系统(Bio-Rad)，酶标仪(DG3022 A)，V
-86 ℃
超低温冰箱日本SANYO公司等。
2.4. 型糖尿病模型的制备
30只雄性大鼠，饲养在22℃~24℃的安静环境中。正常饲养一周后，动物随机分为3组，每组各10只。对照组大鼠给予正常的饮食、饮水。糖尿病4周组和8周组大鼠给喂养高糖高脂饮食(成分：2%胆固醇，1%胆酸钠，67%基础饲料，20%糖，10猪油%)。4周后，糖尿病组通过腹腔注射低剂量STZ (30 mg/kg) [3] 。三天后检测血糖高于16.7 mmol/L为造模成功。观察大鼠一般状态，每周监测血糖、饮食、饮水量，至实验完成。
2.5. 实验分组
1) 正常对照组(Con)；2) 糖尿病4周组(D4w)；3) 糖尿病8周组(D8w)。
2.6. 大鼠血糖水平测定
实验结束前一天，采用剪尾法，通过大鼠尾静脉采血用血糖仪(ACCU CHEK, Roche, Germany)检测血糖。
2.7. 电镜观察超微结构
取左心室心尖部组织，切成1 mm3大小组织多块，PBS洗涤1遍，2.5%戊二醛固定；PBS洗三次，4℃、1%锇酸固定，常规乙醇系列脱水，环氧树脂包埋，铅–铀双重染色，干燥后置于H-7650型透射电镜下，观察并摄片。
2.8. Western Blot检测蛋白的表达
将大鼠心室肌组织通过液氮研磨后加入组织裂解液，置于4℃条件下裂解1小时，每15分钟混匀一次。然后4℃，12,000 g离心15分钟，取上清进行蛋白质定量。取50 ug总蛋白样品进行10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印至PVDF膜，用5%封闭液室温封闭1小时后，分别用CaSR抗体(1:2000)、GAPDH(1:500)抗体4℃震荡过夜。再用二抗(1:1000的羊抗兔IgG二抗；1:1000的兔抗鼠IgG二抗，碱性磷酸酶标记)孵育，室温下振荡1小时。显色，在凝胶成像系统下拍照、分析。计算各蛋白条带的光密度值，蛋白表达水平以其与内参GAPDH光密度比值来表示。
2.9. 统计学处理
实验数据采用均数 ± 标准差(
± S)，采用方差分析和配对t检验判断其差异显著性。采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析。
3. 结果
3.1. 大鼠一般体征
实验中观察了大鼠的一般状态，发现正常对照组大鼠精神良好，反应灵敏。糖尿病组大鼠都出现了饮水量增加，饮食增多，精神状态差，动作迟缓(表1)。
Table 1. General characteristics in control and diabetic rats
表1. 大鼠饮饮食饮水测定
＃P < 0.05 vs Control; △P < 0.05 vs Dia-4w, n = 10.
3.2. 大鼠血糖测定
与正常对照组大鼠血糖相比，糖尿病4周组和8周组大鼠随机血糖显著升高(P < 0.05) (表2)。
Table 2. Random blood glucose measured in rats
表2. 大鼠血糖监测
＃P < 0.05 vs Control, n = 10.
3.3. 透射电镜下各组心肌组织超微结构的改变
电镜结果显示对照组心肌细胞排列规则，心肌细胞质膜完整，线粒体大小均一、排列整齐。糖尿病4周组和8周组出现心肌细胞排列杂乱，心肌细胞质膜不清晰、肌丝松散，部分发生断裂，线粒体大小不一，出现肿胀，甚至空泡样变，排列不规则，糖尿病8周组更为明显(图1)。
Control Dia-4w Dia-8w
Figure 1. The ultrastructure alteration of rat myocardium in different groups (×5000)
图1. 心肌超微结构的改变(×5000)
3.4. 心肌组织 CaSR蛋白表达的变化
通过Western blot检测CaSR蛋白的表达，与正常对照组相比，糖尿病4周组大鼠心肌组织CaSR表达降低，糖尿病8周组更低(P < 0.05) (表3)。
Table 3. Protein expression of CaSR in heart analyzed by Western blot
表3. 通过Western blot检测大鼠心肌CaSR蛋白表达
＃P < 0.05 vs Control; △P < 0.05 vs Dia-4w, n = 6.
4. 讨论
本研究复制了糖尿病大鼠模型，监测了大鼠的一般状态、饮食、饮水及血糖，通过透射电镜观察心肌超微结构变化，并检测心肌组织CaSR蛋白的动态表达来探讨CaSR在大鼠DCM发生中的作用。
复制糖尿病的方法有多种，我们在实验中采用先用高糖高脂饮食诱导，然后进行腹腔注射STZ的方法来复制大鼠DCM动物模型。与对照组大鼠相比，糖尿病组大鼠出现多食、多饮，血糖一直处于高水平。上述结果，说明本实验成功建立了大鼠糖尿病动物模型。通过透射电镜观察发现与正常大鼠相比，糖尿病各组大鼠心肌出现了肌原纤维断裂、心肌细胞排列不规则，线粒体发生肿胀、空泡样变。心肌超微结构的损伤与文献报道的DCM的特点一致 [4] 。
DCM的发生机制迄今尚不明确。CaSR是G蛋白偶联受体，以前研究发现高脂血症和动脉粥样硬化能使心肌CaSR表达增加，心肌凋亡严重 [5] [6] ，这说明CaSR在心脏功能异常中发挥了至关重要的作用。但是，CaSR在DCM大鼠心肌的表达规律，迄今鲜见报道。我们检测了糖尿病大鼠心肌CaSR蛋白的表达情况，结果发现与正常对照组相比，糖尿病大鼠心肌CaSR蛋白的表达降低，尤其糖尿病8周组更低，心肌超微结构损伤也是糖尿病8周组更加严重。Ward等检测了1型糖尿病大鼠肾脏CaSR表达也是显著降低的 [7] 。
总之，我们的研究发现2型糖尿病大鼠心肌组织CaSR表达有一定的规律性，即随着病程延长逐渐降低，且心肌损伤逐渐加重，可能与CaSR表达减少造成细胞内钙稳态紊乱有关，在后续的研究中我们将进一步探讨。
基金项目
黑龙江省教育厅科技研究项目资助(12541276)。
NOTES
*通讯作者。