抗肿瘤药物开发中体外心脏的安全性风险评估

doi:10.12307/2024.560

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (27): 4265-4272.doi: 10.12307/2024.560

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抗肿瘤药物开发中体外心脏的安全性风险评估

郑双佳，赵婷，任翠霞，王保强，陈兰兰，林沫旭，李英骥，张旭

北京爱思益普生物科技股份有限公司神经心脏中心，北京市 100000

收稿日期:2023-09-12 接受日期:2023-11-08 出版日期:2024-09-28 发布日期:2024-01-26
通讯作者: 张旭，博士，北京爱思益普生物科技股份有限公司神经心脏中心，北京市 100000
作者简介:郑双佳，女，1987年生，河北省廊坊市人，汉族，2020年内蒙古民族大学毕业，硕士，主要从事体外心脏安评研究。
基金资助:
北京市科委科技计划资助项目(Z211100002521003)，项目负责人：李英骥

Safety risk assessment of in vitro heart in antitumor drug development

Zheng Shuangjia, Zhao Ting, Ren Cuixia, Wang Baoqiang, Chen Lanlan, Lin Moxu, Li Yingji, Zhang Xu

Neurocardiology Center, Ice-Biosci, Beijing 100000, China

Received:2023-09-12 Accepted:2023-11-08 Online:2024-09-28 Published:2024-01-26
Contact: Zhang Xu, MD, Neurocardiology Center, Ice-Biosci, Beijing 100000, China
About author:Zheng Shuangjia, Master, Neurocardiology Center, Ice-Biosci, Beijing 100000, China
Supported by:
Beijing Municipal Science and Technology Commission Science and Technology Program, No. Z211100002521003 (to LYJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

酪氨酸激酶抑制剂：是一种药物或化合物，用于抑制酪氨酸激酶的活性。酪氨酸激酶是一种酶，参与调节细胞的生长、分化和代谢等生物学过程。通过抑制酪氨酸激酶的活性，酪氨酸激酶抑制剂可以影响细胞信号传导途径，从而对癌症、炎症和其他疾病具有治疗作用。
体外心脏灌流实验：用于研究心脏的功能和代谢。在此实验中，动物的心脏被取出，然后通过一种特殊的装置(体外心脏灌流装置)加以灌流，保持心脏正常的血液供应和供氧。

背景：酪氨酸激酶抑制剂以及其他种类的小分子癌类药物会导致严重的心脏毒性。

目的：通过观察抗肿瘤药物在兔体外心脏心电图、心肌动作电位及相关离子通道和心肌细胞毒性的作用，对心脏安全再评价。
方法：将兔进行体外心脏灌流，采用舒尼替尼(Sunitinib，0.3，3，10 μmol/L)，克唑替尼(Crizotinib，0.3，1，3 μmol/L)，多柔比星(Doxorubicin，1，30 μmol/L)顺序灌流120 min，并设空白对照组进行对比，记录心电图和左心室内压。采用手动膜片钳检测3种药物对人源诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)动作电位及相关离子通道hERG，Nav1.5和Cav1.2通道电流的影响，采用CellTiter-Glo荧光细胞活力法检测hiPSC-CMs中ATP的水平。

结果与结论：①体外心脏灌流实验结果显示：与空白对照组相比，Sunitinib和Crizotinib在≥3 μmol/L浓度灌流下可减慢兔心率(P < 0.01)，延长QT/QTc间期(P < 0.01)，左心室内压有不同程度的降低。②手动膜片钳实验显示，与空白对照组相比，Sunitinib和Crizotinib在3 μmol/L浓度灌流时可明显延长hiPSC-CMs动作电位时程(P < 0.01)，抑制hERG，Nav1.5和Cav1.2离子通道电流；并结合供试品分析，标识浓度与回收液测定浓度有不同程度的差异。③细胞活力检测结果显示，与空白对照组相比，Sunitinib(IC50=4.64 μmol/L)，Doxorubicin (IC50=4.21 μmol/L)和Crizotinib(IC50=2.87 μmol/L)处理后hiPSC-CMs细胞内ATP水平明显降低，即细胞活力显著降低(P < 0.01)。④上述结果证实，实验成功建立了抗肿瘤药物的早期心脏安全性评价方法，为后续抗肿瘤药物的开发提供良好的支持和帮助。

https://orcid.org/0009-0007-5921-4758(郑双佳)；https://orcid.org/0000-0003-4199-2029(张旭)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 舒尼替尼, 克唑替尼, 多柔比星, 体外心脏灌流, 电生理膜片钳, 心脏安全评价

Abstract: BACKGROUND: Tyrosine kinase inhibitors, as well as other types of small-molecule cancer drugs, can cause severe cardiotoxicity.
OBJECTIVE: To perform a heart safety re-evaluation by observing the effects of antitumor drugs on isolated heart electrocardiograph, cardiac action potential and associated ion channels and cytotoxicity.
METHODS: Extracorporeal cardiac perfusion was given to the isolated rabbit heart using Langendorff perfusion: Sunitinib (0.3, 3, 10 μmol/L), Crizotinib (0.3, 1, 3 μmol/L), and Doxorubicin (1, 30 μmol/L) were perfused sequentially for 120 minutes to record electrocardiograph and left ventricular pressure. A blank control group was set for comparison. Manual patch clamp was used to record the effects of Crizotinib, Sunitinib, Doxorubicin on hERG, Cav1.2, Nav1.5 channel currents and action potential in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Adenosine triphosphate level in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes was detected by CellTiter-Glo luminescent cell viability assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Isolated rabbit heart using Langendorff perfusion: Compared with the blank ontrol group, Sunitinib and Crizotinib at ≥ 3 μmol/L decreased heart rate (P < 0.01) and prolonged QT/QTc interval (P < 0.01), and reduced left ventricular pressure to different extents. Manual patch clamp recording: Compared with the blank control group, Sunitinib and Crizotinib at 3 μmol/L inhibited the activities of hERG, Nav1.5 and Cav1.2 channels and significantly prolonged the duration of action potential (P < 0.01). According to the analysis of the test article, the difference between the labeled concentration and the measured concentration of the recovered solution was not significant. Cell viability assays: Compared with the blank control group, adenosine triphosphate content in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes significantly decreased after treatment with Sunitinib (IC50=4.64 μmol/L), Doxorubicin (IC50=4.21 μmol/L) and Crizotinib (IC50=2.87 μmol/L), indicating that cell viability significantly decreased (P < 0.01). To conclude, this study successfully established an early cardiac safety evaluation method for antitumor drugs, which provides good support and help for the subsequent development of antitumor drugs.

Key words: Sunitinib, Crizotinib, Doxorubicin, Langendorff, patch clamp, cardiac safety evaluation

中图分类号:

郑双佳, 赵婷, 任翠霞, 王保强, 陈兰兰, 林沫旭, 李英骥, 张旭. 抗肿瘤药物开发中体外心脏的安全性风险评估[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4265-4272.

Zheng Shuangjia, Zhao Ting, Ren Cuixia, Wang Baoqiang, Chen Lanlan, Lin Moxu, Li Yingji, Zhang Xu. Safety risk assessment of in vitro heart in antitumor drug development[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(27): 4265-4272.

图/表（结果） 17

2.1 实验动物数量分析 31只兔均进入结果分析，无脱落。
2.2 不同抗肿瘤药物对兔体外心脏灌流的影响表2和图1A结果显示，在同一心脏中与给药前相比，1 μmol/L和3 μmol/L的Crizotinib有明显降低心率(P < 0.05和P < 0.01)，延长PR间期(P < 0.05)，延长QT间期的作用(P < 0.05和P < 0.01)；3 μmol/L的Crizotinib有明显缩短QTc间期(P < 0.01)，降低左心室收缩压(P < 0.01)，降低左心室内压最大上升速率和最大下降速率的作用(P < 0.01)。

表3和图1B结果显示，在同一心脏中与给药前相比，3 μmol/L和10 μmol/L的Sunitinib明显降低心率(P < 0.01)，延长QT间期(P < 0.01)，降低左心室收缩压(P < 0.05和P < 0.01)，降低左心室内压最大上升速率(P < 0.05和P < 0.01)和最大下降速率的作用(P < 0.01)；10 μmol/L的Sunitinib有明显延长PR间期(P < 0.01)和延长QTc间期的作用(P < 0.01)。

表4和图1C结果显示，在同一心脏中与给药前相比，30 μmol/L Doxorubicin的药效有QT间期延长和心率降低的趋势，但是没有显著性差异(P > 0.05)，有明显降低左心室内压最大上升速率和最大下降速率的作用(P < 0.05)。

2.3 不同抗肿瘤药物对离子通道的影响
2.3.1 受试物对各通道的抑制比例及IC50结果图2为受试物对Late-Nav1.5通道电流的浓度-效应曲线；表5结果显示Doxorubicin在100 μmol/L下抑制率为(67.76±4.23)%，IC50值为38.49 μmol/L。而Sunitinib和Crizotinib在3 μmol/L时抑制率超过50%，分别为(63.18±2.83)%、(82.44±0.65)%，两个化合物的IC50值分别为1.61 μmol/L和1.03 μmol/L。

图3为受试物对Nav1.5通道电流的浓度-效应曲线；表6结果显示Doxorubicin在100 μmol/L下抑制率为(8.66±2.90)%，在测试浓度范围内IC50值为> 100 μmol/L；Sunitinib在10 μmol/L时抑制率超过50%，为(60.32±2.17)%，IC50值为6.36 μmol/L；Crizotinib在3 μmol/L时抑制率超过50%，为(53.53±0.73)%，IC50值为2.39 μmol/L。

图4，5为受试物对hERG通道和hERG-CiPA通道电流的浓度-效应曲线。表7结果显示Doxorubicin在100 μmol/L下抑制率为(10.36± 3.14)%，在测试浓度范围内IC50值为> 100 μmol/L；Sunitinib在1 μmol/L时抑制率超过50%，为(65.04%±1.81)%，IC50值为0.55 μmol/L；Crizotinib在3 μmol/L时抑制率超过50%，为(65.61±3.28)%，IC50值为1.81 μmol/L。

表8和图5的结果为hERG-CiPA结果，与hERG结果较一致。结果显示：Doxorubicin对hERG通道具有弱抑制或无抑制作用；Sunitinib对hERG通道具有强抑制作用；Crizotinib对hERG通道具有中度抑制作用。实验采用文献报道的标准判断受试物对hERG的抑制作用[12] ：极强抑制：IC50 < 0.1 μmol/L；强抑制：0.1 μmol/L ≤ IC50 ≤ 1 μmol/L；中度抑制：1 μmol/L < IC50 ≤ 10 μmol/L；弱抑制或无抑制：IC50 > 10 μmol/L。

图6结果显示Sunitinib损失率范围为-20.00%-51.70%，Crizotinib损失率范围为23.00%-46.67%，Doxorubicin损失率范围为9.06%-26.67%。结合供试品结果对每种受试物经灌流系统的回收液和标识浓度进行对比，每种受试物的5个浓度点存在不同程度的损失。

图7为受试物对Cav1.2通道电流的浓度-效应曲线。表9结果显示，Doxorubicin在100 μmol/L下抑制率为(32.74±3.07)%，在测试浓度范围内IC50值为> 100 μmol/L；Sunitinib在10 μmol/L时抑制率超过50%，IC50值为5.83 μmol/L；Crizotinib在10 μmol/L时抑制率超过50%，IC50值为3.84 μmol/L。
2.3.2 受试物对hiPSC-CMs动作电位的影响表10结果显示，Doxorubicin在测试浓度范围内对hiPSC-CMs的动作电位时程APD90延长(10.85±1.70)%，对APD30和APD50无明显变化，同时，对hiPSC-CMs动作电位的幅度(APA)和静息电位(RMP)也无明显变化。

表11结果显示，Sunitinib一定程度延长了hiPSC-CMs动作电位时程，在1 μmol/L浓度下，对APD90延长(36.99±11.99)%，在3 μmol/L浓度下，对APD90延长(63.00±19.84)%，同时减小了hiPSC-CMs动作电位的幅度APA(-15.66±2.11)%和心肌细胞的静息电位RMP(-15.28±0.15)%，并减缓了细胞动作电位最大除极速度dV/dtmax (-53.02±4.63)%，差异均有显著性意义(P < 0.05)，结合离子通道检测结果1 μmol/L和3 μmol/L浓度超过了APD90风险阈值(10%-15%)[13-16]，有致心律失常的风险。

表12结果显示，Crizotinib在1 μmol/L浓度及以下，对hiPSC-CMs动作电位时程，幅度、静息电位没有太大变化，同时受试物在3 μmol/L时会导致细胞节律不稳定，导致细胞停止自发跳动。

2.4 细胞毒性实验结果图8结果显示，3种受试物在各测试浓度对hiPSC-CMs中ATP含量有较明显损失，具有剂量依赖性的心脏毒性[17]，IC50在低微摩尔范围内。根据ATP产生的剂量反应数据，在iPSC-CMs细胞中Doxorubicin的IC50=4.21 μmol/L，Sunitinib的IC50=4.64 μmol/L，Crizotinib的IC50=2.87 μmol/L。

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引言

材料方法

1.1 设计动物体外实验，单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于 2022 年 11-12 月在北京爱思益普生物科技有限公司神经心脏中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康雄性新西兰大白兔31只购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司，体质量2.0-3.0 kg，许可证号：SCKX(京)2020-0003。实验已经通过BioWork亦庄加速器实验动物福利与伦理委员会进行批准，伦理批准号：BW.NO20221102T121326[003]。
1.3.2 细胞 hNav1.5-CHO细胞购自北京爱思益普生物科技股份有限公司；hCav1.2-CHO细胞购自北京爱思益普生物科技股份有限公司；人源诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)及相应培养基购自南京柏寿生物技术有限公司(货号：300106)；hERG-HEK293钾通道细胞购自Creacell公司(货号：A-0320)
1.3.3 设备和试剂主要仪器和试剂包括超高效液相色谱仪(UPLC，Waters Corporation公司)，Langendorff体外心脏灌流系统(美国Radnoti公司)，膜片钳放大器(HEKA公司，德国)，高端多功能酶标仪(LABTECH PHERAstar FSX，德国BMG公司)，二氧化碳培养箱(ESCO)，舒尼替尼(Sunitinib，MedChemExpress，HY-10255A)，克唑替尼(Crizotinib，MedChemExpress，HY-50878)，多柔比星(Doxorubicin，MedChemExpress，HY-15142A)，发光法细胞活力检测试剂盒(CellTiter-Glo®，日本同仁公司)，DMEM(美国Gibco公司，10013-CV)，F12培养基(美国Gibco公司，31765035)，FBS胎牛血清(AusGeneX，FBS500-S)，Hygromycin B(Solarbio公司，H8080)，Zeocin(Solarbio，Z8020)，G148(GPC公司，AK108)，实验中的其他相关试剂均购自美国Sigma公司。
1.4 实验方法
1.4.1 兔子体外心脏灌流实验用体积分数25%的乌拉坦和体积分数0.1%的肝素按兔子体质量换算比例混合后耳缘静脉注射进行麻醉，麻醉成功后开胸暴露出心脏迅速取出，放入到提前预冷好的4 ℃工作液(118 mmol/L NaCl，4.8 mmol/L KCl，2.5 mmol/L CaCl2，1.2 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L KH2PO4，0.5 mmol/L Na2EDTA，25 mmol/L NaHCO3，2 mmol/L pyruvic acid，5.5 mmol/L D-Glucose，持续充以体积分数95% O2+体积分数5%CO2混合气体，pH=7.4)中[6]，通过主动脉插管将体外心脏置于Langendorff装置上进行灌流[7-8]，灌流工作液温度保持在(37.0±0.5) ℃，灌注流速为21 mL/min，灌注压维持在70-80 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，将电极的负极置于主动脉根部，正极置于心尖部位，持续记录心电图。兔心脏跳动稳定后，通过左心耳开口将球囊放入，连接压力放大器后持续记录左心室内压的变化，稳定1 h后开始给药。
将31只动物按给药类型分为3组，Crizotinib组11只，Sunitinib组11只，Doxorubicin组9只，均采用单浓度给药，每只灌注2 h。通过BIOPAC多导生理记录仪配套AcqKnowledge软件记录兔离体心脏心电信号和左心室内压，通过Labchart分析数据，分析各组给药前和给药后90 min心脏的心率(次/min)、PR间期 (ms)、QT间期 (ms)、QTc间期 (ms)、左心室收缩压(mmHg)、左心室舒张末期压力(mmHg)、左心室内压最大上升速率 (mmHg/s)、左心室内压最大下降速率(mmHg/s)。

1.4.2 手动膜片钳检测3种药物对hiPSC-CMs动作电位及相关离子通道hERG，Nav1.5和Cav1.2通道电流的影响检测方法主要参考了制药领域公认的方法[9-10]，在液体和刺激方案上略有调整，具体内容见下文。Doxorubicin、Crizotinib、Sunitinib用DMSO溶解，用细胞外液进行浓度梯度稀释，最终工作液中含有0.1%DMSO，Doxorubicin检测浓度1，3，10，30，100 μmol/L；Crizotinib和Sunitinib检测浓度0.1，0.3，1，3，10 μmol/L。测试受试物以及不含受试物的外液利用重力灌流的方法依次流经记录浴槽从而作用于细胞，见表1。

稳定表达Nav1.5、Cav1.2通道的CHO细胞系分别培养在添加体积分数10%FBS+200 µg/mL Hygromycin B和体积分数10%FBS、200 µg/mL Hygromycin B、100 µg/mL Zeocin、800 µg/mL G418的F12培养基中；hERG钾通道稳定表达的HEK293细胞系培养在含有体积分数10% FBS+0.8 µg/mL G418的DMEM培养基；hiPSC-CMs用心肌细胞培养基(Maintenace Medium 400305)培养，每隔48 h换液1次。所用到的细胞均放在37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中；细胞融合度不能超过90%。每次膜片钳实验之前，将适量细胞铺到24孔板(含盖玻片)上培养18 h后进行检测。
刺激方案：①Cav1.2通道从-80 mV至+10 mV维持0.3 s(具体除极电压参考先导的Ⅳ测试)，每隔20 s重复采集数据；②Nav1.5通道从-120 mV至-30 mV维持100 ms(具体电压参考先导的Ⅳ测试)，每隔10 s重复采集数据；③hERG通道首先从-80 mV至-50 mV维持0.5 s(作为漏电流检测)，然后阶跃至30 mV维持2.5 s，再迅速恢复至-50 mV维持4 s可以激发出hERG通道的尾电流，每隔10 s重复采集数据；④CiPA-hERG当形成全细胞封接后细胞膜电压钳制于-80 mV，阶跃至-90 mV维持100 ms，又恢复至-80 mV，然后阶跃至40 mV维持500 ms，然后给予100 ms Ramp刺激至-80 mV。每隔10 s重复采集数据；⑤Late-Nav1.5当形成全细胞封接后细胞膜电压钳制于-95 mV，阶跃至-120 mV维持200 ms，后阶跃至-15 mV维持40 ms，再阶跃至40 mV维持200 ms，随后在100 ms内Ramp至-95 mV，每隔10 s重复采集数据，观察药物对Nav1.5晚钠电流峰值的作用；⑥动作电位：当形成全细胞封接后，转为电流钳(Current Clamp)模式，细胞膜电流钳制于0 pA，记录至少3 min并给药。
按照公式Ix =(1-Iaddition/IIbaseline)×100%[11] ，计算Ix=各浓度抑制率，Iaddition=加药后电流峰值，IIbaseline=加药前电流峰值。
1.4.3 供试品分析使用超高效液相色谱仪根据3种受试物Doxorubicin、Crizotinib、Sunitinib的化学性质进行方法开发，使用Empower3软件对数据进行采集和处理。首先用DMSO将受试物配制成 1 mmol/L的母液，然后将母液用稀释剂配制成4，8，16，32，64，128，256 nmol/L(500 nmol/L)上机检测，将浓度与峰面积进行线性拟合(其中权重为1/χ2)，得到Y=aX+b线性方程。从细胞给药处收集供试品经灌流系统的回收液(每个浓度测定3次)，对回收液稀释处理后进样分析，计算回收液浓度、平均值和损失率。损失率=(标识浓度-平均实际浓度)/标识浓度×100%[12]。
1.4.4 CellTiter-Glo®发光细胞活力测定方法将hiPSC-CMs按照2万/孔的密度铺在黑色底透的384孔板内，在体积分数5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养，每隔1 d观察细胞状态，直至细胞跳动均匀；准备受试物的工作液，用细胞培养基配制；倒扣离心去掉培养基，取配制好的受试物加入到相应实验孔中，离心后置于体积分数5%CO2的37 ℃恒温培养箱中孵育72 h；孵育完成后，按照CellTiter-Glo®试剂盒说明书添加相应体积，400×g摇晃2 min，然后再1 000 r/min离心2 min，放置室温孵育28 min；孵育完成后，利用多功能酶标仪检测读值。
1.5 主要观察指标各组兔心率、动作电位时程和心脏细胞活力。
1.6 统计学分析实验结果数据以均值±标准误表示，曲线拟合以及IC50的计算利用Graphpad Prism 8软件完成，多组间数据差异采用单因素方差分析和SNK事后检验法比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 研究结果讨论在实验的兔体外心脏灌流结果中，30 μmol/L Doxorubicin有延长QT间期和降低心率的趋势，明显降低左心室内压最大上升速率和最大下降速率，与基于大鼠灌注心脏模型的报道一致[18-19]。Doxorubicin对 hERG通道无明显的抑制作用。在hiPSC-CMs上的结果显示100 μmol/L Doxorubicin延长hiPSC-CMs动作电位APD90(最终复极90%时的动作电位持续时间)，此外，Doxorubicin已被证明可以延长豚鼠心室心肌APD90[20]。且在临床观察到的输注Doxorubicin后24 h会引起QT间期延长[21]。然而在另外一项研究中证明，Doxorubicin引起的动作电位持续时间的延长和QT间期的延长不是通过抑制hERG通道的机制[22]。进而同时对 Ca1.2，Na1.5和Late-Na1.5通道进行检测，均无明显的抑制作用。然而实验同时也发现在细胞毒性CellTiter-Glo assay方面对细胞ATP含量的测定，Doxorubicin对hiPSC-CMs心肌细胞有较明显的损伤，与临床上显示的心脏毒性一致[18]。
目前关于Sunitinib的研究报道显示cmax范围为0.5-1.4 μmol/L[23-24]，实验表明，在兔体外心脏心电图中延长QT间期和降低心率，降低左心室收缩压。文献报道在临床上也观察到Sunitinib会引起QT间期延长[25]。也有研究报道，在患者中与Sunitinib治疗相关的心脏不良事件出现左心室射血分数(LVEF)降低[26]。另外Sunitinib对hERG通道有较强抑制作用，同文献报道较一致[1]，进而同时也发现延长hiPSC-CMs动作电位时程APD。为了进一步探讨Sunitinib对心脏关键通道的抑制作用，对Nav1.5，Late-Nav1.5和Ca1.2通道的均匀较强的抑制作用，以及对hiPSC-CMs心肌细胞在ATP水平有较强的消耗，均和Sunitinib引起的心脏毒性相关文献报道较一致[1-27]。
此外，Crizotinib在临床上被观察到会引起心动过缓、心脏骤停和QT间期延长[28]。在此次实验结果中，Crizotinib在兔体外心脏心电图中明显地延长QT间期和降低心率，3 μmol/L作用下导致hiPSC-CMs细胞停止自发跳动，并对细胞内ATP水平有明显降低。Crizotinib抑制hERG的浓度与以往实验报道的结果一致，同时Crizotinib对hERG通道强抑制，支持该药物有可能延长QT间期的发现。文章的一系列体外实验结果提示Crizotinib可以引起心脏毒性，且这种毒性都在该药物的cmax值(0.73-1.06 μmol/L)范围附近观察到[28-29]。
酪氨酸激酶抑制剂极大地改善了多种癌症类型的治疗和预后。然而，在使用这些药物治疗的一小部分患者中出现了未预测到的心脏毒性，这是围绕动物毒性研究和抑制人类Ether-à-go-go-Related Gene(hERG)通道的临床前测试无法完全预测的。在2020年ICH E14/S7B指导原则以问答的形式，进行了深度的修订：强调了体外研究的价值以及确定了“双阴性场景”通过核心试验界定“双阴性场景”体外研究的价值[30]。美国FDA指南要求对每一种新药进行心脏毒性评估，包括两项仅以心律失常和QT间期延长为核心的测试。新的化合物进行体外筛选，以确定药物是否阻断KCNH2/hERG通道；并进行体内筛选，以确定QT间期是否延长[31-32]。阻断hERG是药物诱导QT间期延长最常见的形式，增加室性心动过速的风险。然而，这两种方法的范围都有局限，在动物上的研究并不一定总是与人的结果相关，另外对于hERG的结果，虽然对预测QT间期延长和心律失常有效，但不能解释药物诱导毒性的其他机制。实验试图确定评估药物对体外组织、细胞和电生理水平影响的多平台检测来预测心脏毒性的准确性，对心脏安全性做出较完整的评价体系，从药物致心律失常(电生理学)以及对心肌结构性影响多个方面以及药物处于不同的开发阶段开展不同的研究，为预防和治疗抗肿瘤药物导致的心血管疾病提供更多的现实借鉴意义。
3.2 研究局限性 ①由于是体外以及体外的急性作用，因此没有考虑到给药途径、药物在体内代谢以及药物作用机制的问题，得到的结果在帮助非人灵长类以及临床试验设计和决策中可以给出提示和建议。②只选用了两种酪氨酸激酶抑制剂以及一种蒽环类化合物，数量有限。③缺少整体啮齿类动物(例如豚鼠的研究)。
3.3 小结及展望目前还缺少就抗肿瘤药物系统性的体内、体外研究，有的研究内容没有和指导原则最新的修订贴合起来，检测内容也是针对细胞毒性或者电生理特性单一维度，同时检测技术方法不够统一[33-35]。实验系统性的从心肌细胞毒性角度，指导原则所关注的也是心脏系统中重要的离子通道，诱导多能干细胞诱导的心室肌细胞动作电位以及体外心脏灌流多个维度开展了研究，结果更加完整和系统性。实验方法上，也采用了制药工业界认可度较高的检测方法和评价手段，避免了目前存在的不同实验室用于检测方法差异带来的结果误差，最后该实验方案的设计紧跟ICH颁布的S7B指导原则的升级内容，可以更好地符合工业界的需求[30]。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

抗肿瘤药物开发中体外心脏的安全性风险评估

Safety risk assessment of in vitro heart in antitumor drug development

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[1]	邢丽娜，张学军，王颖，牛志云，王福旭，温树鹏. 氧化石墨烯负载多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5636-5641.
[2]	张辉，薛忠林，靳安民，李森，叶建东. 包裹多柔比星微球骨水泥的制备及其表征[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(8): 1386-1391.