改良椎板切除法构建脊髓损伤模型大鼠

doi:10.12307/2023.825

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (32): 5173-5177.doi: 10.12307/2023.825

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改良椎板切除法构建脊髓损伤模型大鼠

杜凯然1，邓强2，郭铁峰2，张彦军2，彭冉东2，李军杰2，王雨榕1，张凯东1，罗林钊1

1甘肃中医药大学，甘肃省兰州市 730030；2甘肃省中医院，甘肃省兰州市 730050

收稿日期:2020-09-16 接受日期:2020-11-21 出版日期:2023-11-18 发布日期:2023-03-23
通讯作者: 邓强，硕士，硕士研究生导师，主任医师，甘肃省中医院，甘肃省兰州市 730050
作者简介:杜凯然，男，1993年生，甘肃中医药大学在读硕士，主要从事脊柱疾病中西医结合防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82060879)，项目负责人：邓强；国家自然科学基金(81860860)，项目负责人：邓强；甘肃省重点研发计划(20YF3FA014)，项目负责人：邓强

Improved laminectomy for constructing a rat model of spinal cord injury

Du Kairan1, Deng Qiang2, Guo Tiefeng2, Zhang Yanjun2, Peng Randong2, Li Junjie2, Wang Yurong1, Zhang Kaidong1, Luo Linzhao1

1Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730030, Gansu Province, China; 2Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Received:2020-09-16 Accepted:2020-11-21 Online:2023-11-18 Published:2023-03-23
Contact: Deng Qiang, Master, Chief physician, Master’s supervisor, Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:Du Kairan, Master candidate, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82060879 and 81860860 (both to DQ); the Key Development and Research Plan of Gansu Province, No. 20YF3FA014 (to DQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
牙科磨钻打磨法：定位准确后，选择牙科打磨机安装圆饼形钻头，调整合适转速后以180°水平面打磨棘突，将凸起棘突打磨平整后，再以30°-45°刮磨，初始打磨骨头呈白色，经打磨后慢慢变薄，逐渐转变为红白相间，伴随刺激神经，后下肢无自主性抬起，此时立即停止打磨。
显微器械摘除法：选用精确的显微剪刀沿着T10椎间隙向上剪开被打磨过的骨面，待椎体脊髓正中上方的骨头剔除干净后，两侧的残余不规则的骨头及关节突则选用弯头显微持针器轻轻夹除。

背景：目前脊髓损伤已成为世界性难题，实验动物造模是探索疾病的第一步，但现缺乏较为有效的实验动物模型。
目的：建立一种可复制、可调控、创伤小、死亡率低、出血量少、适用范围广、术中时间短的脊髓损伤大鼠模型。
方法：将选用的体质量相似的40只SD大鼠随机分为常规组和改进组，每组20只，常规组采用Allen法构建脊髓损伤模型，改良组在原有模型的基础上，运用牙科磨钻代替器械咬除，比较两组大鼠手术时间、术中出血量、死亡率及击打后1，3，6，9，12，15 d的BBB运动功能学评分。
结果与结论：改良继发性脊髓损伤模型建立方法比常规建模方法出血量少、死亡率低、造模时间短、BBB评分结果更集中，由此可证明改良后的击打方法更适用于继发性脊髓损伤模型的建立。
https://orcid.org/0000-0003-3042-5192 (邓强)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脊髓损伤, 动物模型, Allen法, 改良, 大鼠, 运动功能, BBB评分

Abstract: BACKGROUND: Spinal cord injury has become a worldwide problem. Experimental animal modeling is the first step to explore the disease; however, there is a lack of experimental animal models that are more effective.
OBJECTIVE: To establish a rat model of spinal cord injury that can be replicated, regulated, has little trauma, low mortality, low blood loss, wide application and short intraoperative time.
METHODS: Forty Sprague-Dawley rats with similar body mass were selected and randomly divided into conventional model group and improved model group (n=20 per group), where the model of spinal cord injury was made using Allen’s method and improved method, respectively. In the improved model group, a dental drill was used for biting. Operation time, intraoperative blood loss, mortality, and Basso-Beattie-Bresnahan locomotor rating scale scores at 1, 3, 6, 9, 12, and 15 days after beating were compared between the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: The improved method for constructing the animal model of secondary spinal cord injury has the advantages of shorter modeling time, less intraoperative blood loss, lower mortablity, and more centralized Basso-Beattie-Bresnahan score data as compared with the conventional method, which proves that the improved method is more suitable for establishing the model of secondary spinal cord injury.

Key words: spinal cord injury, animal model, Allen’s method, improved, rat, motor function, Basso-Beattie-Bresnahan locomotor rating scale

中图分类号:

杜凯然, 邓强, 郭铁峰, 张彦军, 彭冉东, 李军杰, 王雨榕, 张凯东, 罗林钊. 改良椎板切除法构建脊髓损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(32): 5173-5177.

Du Kairan, Deng Qiang, Guo Tiefeng, Zhang Yanjun, Peng Randong, Li Junjie, Wang Yurong, Zhang Kaidong, Luo Linzhao. Improved laminectomy for constructing a rat model of spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(32): 5173-5177.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年5-8月在甘肃中医药大学SPF级实验室完成，实验设施合格证号：SYXK (甘)2015-0005，该实验遵守国家健康与医学研究委员会(NHNRC)+动物道德准则，并经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准。
1.3 材料清洁级健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，体质量200-300 g，由甘肃中医药大学SPF级实验室提供。头孢他啶(1 g/瓶，海南海灵化学制药有限公司，国药准字：H20023524)、体积分数为75%乙醇、生理盐水、无菌纱布、高压消毒锅、显微手术器械(泗洪县玛克瑞医疗器械有限公司，备案号：苏宿械备20170087号)、常规手术器械、外科手术线、缝合针、牙科打磨机及圆饼形磨头(型号：STRONG 204；制造商：佛山市南海区靓雅齿科器械有限公司；产地：中国)、尖头磨头、扁平形磨头各1个、击打装置、大鼠手术操作台、剃毛刀、无菌手套。
1.4 实验方法
1.4.1 动物模型建立及分组将40只雌性SD大鼠随机分为2组，每组20只，分别进行标记区分。
常规手术建立继发性脊髓损伤模型：①SD大鼠给予3%戊巴比妥钠按30 mg/kg腹腔注射麻醉，然后将大鼠T8-T10脊柱正中周围的毛发用剃毛刀剔除干净，以俯卧位放置在手术操作台面上，固定四肢[11-12]；②穿戴好一次性手术服及外科手套，常规手术铺巾，体积分数为75%乙醇常规消毒3遍，以肋骨为标志，计数第8肋骨，沿其正中切开长约3 cm的切口，然后用手术刀逐层剥离组织及肌肉直至显露棘突，沿正中棘突向两侧剥离粘连棘突的组织直至暴露横突[8]，为减少出血可以在出血点用纱布按压止血后再进行下一步操作；③清晰暴露脊柱后发现T9的棘突倾向尾侧，T10的棘突呈中立位，以此为解剖标志，再次确认是否定位准确[13-14]；④定位准确后用小弯钳夹住下位椎体的棘突，轻轻向上提起，使其脊柱呈弓型，眼科剪剔除棘突，利用椎板钳或眼科剪沿着椎间隙向上咬除周围的骨头，先暴露一部分脊髓，以此为参照，逐步扩大脊髓暴露范围[15]；⑤针对难以剔除骨块，选用神经剥离子保护脊髓，保证脊髓未被触及到的情况下清除残余骨块；⑥待完全暴露T8-T10的脊髓后，观察脊髓有无发黑红肿，大鼠尾巴痉挛摆动及躯体回缩扑动后双下肢瘫痪等行为，排除人为损伤，然后用外科缝合手法，逐层缝合手术切口[16]；⑦最后将头孢他啶粉末均匀涂抹覆盖于伤口，以防止伤口感染。
改良后继发性脊髓损伤模型的建立：前期操作方法与常规手术组一样，消毒，固定，铺单，穿戴手术衣，暴露 T8-T10脊柱节段[17]。定位准确后，选择牙科打磨机安装圆饼形钻头，见图1，调整合适的转速后(7 000 r/min，具体情况根据大鼠骨质)，以180°水平面打磨棘突，将凸起棘突打磨平整后，再以30°-45°刮磨T8-T10脊柱，初始打磨骨头呈白色，经打磨后慢慢变薄，转变为红白相间，伴随刺激神经，后下肢无自主性抬起，此时立即停止打磨。使用牙科打磨机打磨时，尤其注意两侧皮肤用持针器或直头弯钳保护，避免钻头伤及皮肤，造成伤口难以愈合。因之前牙齿打磨机已将骨面打磨至薄薄一层，待用纱布擦除骨面的渗血后，用显微持针器咬除椎间隙只需轻轻用力便可轻松咬除。先暴露椎间隙周围包裹的脊髓，然后以此深度及骨面薄厚程度为参照，用神经剥离子轻轻按压SD大鼠的脊髓，利用以“空间换空间”原则，逐步扩大脊髓暴露的范围，当椎间隙周围的脊髓完全暴露在视野下，再选用精确的显微剪刀沿着T10椎间隙向上剪开被打磨过的骨面，待椎体脊髓正中上方的骨头剔除干净后，两侧的残余不规则的骨头及关节突则选用弯头显微持针器轻轻夹除。在椎间隙周围操作尤其注意神经根，避免剔除骨头太多而伤及神经，造成不可逆的神经根损伤，脊髓暴露面积约0.8 cm×1.3 cm则证明脊髓暴露完全。暴露完全后将SD大鼠逐层缝合，在其表皮均匀喷撒一层头孢他啶以防止伤口感染。

1.4.2 术后护理上述两组SD大鼠，每组20只，均安置在温度18-22 ℃房间内，给予正常食物及水，均在其彻底苏醒后第2天给予膀胱排尿1-3 d，直至膀胱建立自主排尿反射[18]。随时观察是否有伤口感染及死亡，一旦发生感染则立即腹腔注射头孢他啶0.02 g/kg[19]。未完全苏醒的SD大鼠分开放置，以避免互咬导致死亡。每3 d更换1次敷料。

1.5 主要观察指标记录两组SD大鼠手术时间、出血量、BBB运动功能学评分及每组SD大鼠的死亡数。在击打后1，3，6，9，12，15 d进行运动功能学评分，0分代表后肢完全瘫痪，21分代表后肢运动功能正常，评分越高则表示大鼠肢体功能越健全[20-21]。选择经过培训且与实验无关的实验人员进行评分，以保证实验无任何倾向性。
术中出血量计量方法：将明胶海绵剪成0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm的方形止血棉，每块止血棉蘸满血液则出血量约为0.5 mL，以该方法计量术中出血量[22]。
1.6 统计学分析所得数据均采用SPSS 22.0进行统计学处理，其中服从正态分布的计量资料以x±s表示，完全随机设计两组间比较采用两独立样本t检验，重复测量设计组间比较采用重复测量方差分析；计数资料以构成比(%)表示，组间比较采用Fisher确切概率法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

针对目前脊髓损伤的发病率高、高致死率、治愈率低、费用高等特点共同促使其成为脊柱外科领域最为棘手的医学难题之一，导致患者终身瘫痪甚至死亡[23]。因此，迫切需要对其发病机制具有清晰的认识，建立一个国际化、标准化、程序化的治疗方案，深化对脊髓损伤治疗方面的研究。针对目前的医学技术而言，人类尚未能在此领域取得令人欣喜的成就，仍需医学者对其进行科学实验研究及探索。目前面临首要难题是研究过程中如何选择一个与人类脊髓损伤相近的动物模型。从而在研究动物模型的基础上对于脊髓损伤的生物学机制有更加深入的了解，以便更好地指导临床[24]。此次实验在Allen’s重物打击法的基础上改进挫伤型脊髓损伤模型方法，相对传统的模型建造方法，改良后的模型在术中的时间、出血量、死亡率及BBB运动功能学评分都具有一定的优势。
常规Allen法构建脊髓损伤模型有着诸多缺点：首先，椎板钳或眼科剪在咬除椎管过程中，实验人员大多凭借着既往操作经验建立脊髓损伤模型，而在暴露椎管的过程中，会因人为因素导致无法明确把握咬除椎管的深度、力度，从而造成对脊髓挤压引起脊髓损伤；其次，在咬除椎管过程中，因大鼠本身个体上的差异而影响脊髓损伤造模的成功，由于部分大鼠暴露出的脊髓表面有明显瘢痕粘连，咬除椎管过程中可能造成人为撕破硬膜，导致脊髓损伤；最后，传统脊髓损伤造模所耗费时间过长、失血量大、麻醉时间长，从而导致大鼠死亡率的增加。而改良椎板切除方法在原有模型的基础上，运用牙科磨钻代替器械咬除椎管可有效避免此类问题。
第一，改良型脊髓损伤模型建立方法相较于传统方法具有操作时间短的优势。改进后操作方法采用牙科打磨机剔除骨头，相对于用椎板钳或持针器咬除骨头的可控性高且操作面积大，减少人为损伤因素，增加实验标准性、可重复性，减少实验人员手术时间。由于大部分实验者在操作过程中并不能保证处在一个相对无菌的环境中，术中操作时间缩短有利于减少大鼠伤口在空气中暴露的时间，从而降低伤口感染的风险；同时避免因麻醉时间过长，导致大鼠呼吸肌过度抑制，缩短手术时间，可以有效减少麻醉造成的动物死亡；手术时间缩短也从侧面证明此种改良型脊髓损伤造模方式操作更简单、重复率更高、损伤更小、死亡率更低。
第二，相对于传统手术组而言，改进组的术中出血量明显减少。术中出血量减少不仅可以避免因出血量大而造成的失血性休克及低体温造成SD大鼠的死亡，同时可以避免缝合伤口后伤口渗血过多，血液凝结成淤血块压迫大鼠脊髓，从而导致脊髓缺血，造成脊髓二次损伤。
第三，术后常规组SD大鼠死亡率高于改进组，究其原因主要为：①常规操作过程中使用手术器械方面选用不尽合理，在使用弯钳或剪刀剔除骨头暴露脊髓的过程中，操作手法过于笨重，在咬除的过程中损伤两侧神经或破坏硬膜造成脊髓损伤；②术中操作时间与出血量呈正相关，由于操作时间的过长，导致出血量过大，增加大鼠低血容量休克的可能，引起大鼠心脏和大脑间接死亡；同时，出血量过大，也会造成SD大鼠体温过低，导致SD大鼠死亡，大量出血及术后伤口渗出也是造成常规组死亡的重要原因；③手术操作过程中，常规组使用眼科剪或椎板钳暴露椎管的过程中相较改进组使用牙科打磨机及显微器械所需的操作空间更大，组织破坏程度也相对更高，术后SD大鼠所忍受的疼痛等级也相对较高，其中一部分SD大鼠因疼痛耐受能力低下，无法耐受脊髓损伤造模术后产生的疼痛，最终导致死亡；④常规组在逐层缝合后，部分大鼠隐性出血点会不断渗出，手术部位血液凝结成块压迫T8-T10节段脊髓而造成脊髓缺血坏死，导致大鼠死亡。
第四，通过BBB运动功能评分可以看出，改进组暴露脊髓后未造成脊髓损伤的情况下，经过半个月评分可见改进组功能评分较传统组评分集中。由此可以得出，改进组采用牙科打磨机配合显微器械，可减少部分人为因素对脊髓造成的损伤，提高实验操作的标准性、可重复性和实验数据的真实性。
第五，抛开数据指标，纵观整个模型的建立过程，传统方式采用“蚕食咬除”的方法，对于残余难以剔除的骨块强行咬除时，可能造成施术部位出血量增加，同时极易造成因用力过大或操作不娴熟而造成的非实验性脊髓损伤；若残余骨块不剔除，则可能导致在击打过程中因残余骨块阻碍撞针接触脊髓，导致撞针不能均匀作用于脊髓，使脊髓受到的击打力度不完全，造成实验误差。改良组使用牙科打磨机的优势在于操作过程可以对整个骨面进行打磨，对于难以剔除的两侧骨块也能触及，因此可以有效避免因咬除力度过大或牵拉力量过大而造成脊髓非实验性损伤。椎板打磨呈红白相间后，改进组采用显微器械，以“空间换空间”的方式，此器械最大的优点在于：①器械精密、灵巧利于在狭窄且容易误伤的敏感部位进行操作，相较于传统器械，可有效减少因器械笨重、操作不便而造成的脊髓损伤；②相对于椎板钳，此器械的价格便宜，且功能齐全；③对于两侧难以剔除的残余骨块，选用弯头持针器及剪刀的配合，可以在狭小的空间内进行操作，降低咬破或误伤脊髓的可能；④最为重要的原因在于牙科打磨机器在将椎板骨面打磨至红白相间时，利用显微持针器可以轻松咬除薄膜，避免传统器械因骨面太厚不便操作，而用蛮力牵拉造成的脊髓损伤。
综上所述，脊髓损伤动物模型的建立最终目的都是为了模拟人体脊髓损伤状态，研究脊髓损伤的病理机制，探索未来脊髓损伤的研究方向，从而研究出最适合的治疗方案，更好地服务于临床。此次实验模型比较的目的：在Allen’s打击模型的基础上进行改进，针对术中开创的繁琐步骤及笨重的操作方式进行优化，减少手术时间、出血量、死亡率，同时增加脊髓损伤造模的可重复性、标准性，尽可能减少人为干预的因素，提高实验的可靠性、规范性。通过改进组BBB运动功能评分可以看出，15 d后排除伤口对SD大鼠功能活动的影响，其功能评分仍未能达到术前分数，由此可得此实验方法及步骤仍未获得理想的模型，造模过程中可能还存在一些人为因素，对脊髓造成一定的非实验性损伤，脊髓损伤模型的建立仍需在今后科研工作中继续改进。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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