唑来膦酸促进去势大鼠牙槽骨的成骨作用

doi:10.12307/2023.518

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (28): 4494-4501.doi: 10.12307/2023.518

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唑来膦酸促进去势大鼠牙槽骨的成骨作用

宋娜，刘官娟，程余婷，熊玥，罗珊珊，洪伟，廖健

贵州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-07-08 接受日期:2022-08-24 出版日期:2023-10-08 发布日期:2023-01-29
通讯作者: 廖健，博士，教授，主任医师，硕士，博士生导师，贵州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州省贵阳市 550004
作者简介:宋娜，女，1995年生，贵州省贵阳市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事口腔修复与种植学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82060207，81660179)，项目负责人：廖健；贵州省卫生健康委科学技术基金(gzwkj2022-165)，项目负责人：廖健

Zoledronic acid promotes alveolar bone formation in ovariectomized rats

Song Na, Liu Guanjuan, Cheng Yuting, Xiong Yue, Luo Shanshan, Hong Wei, Liao Jian

School of Stomatology/Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Key Laboratory of Molecular Biology, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-07-08 Accepted:2022-08-24 Online:2023-10-08 Published:2023-01-29
Contact: Liao Jian, MD, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Doctoral supervisor, School of Stomatology/Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Key Laboratory of Molecular Biology, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Song Na, Master candidate, School of Stomatology/Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Key Laboratory of Molecular Biology, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, Nos. 82060207 and 81660179 (both to LJ); Guizhou Provincial Health Commission Science and Technology Foundation, No. gzwkj2022-165 (to LJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

NLPR3/Caspase-1/IL-1β：NLRP3是NOD样受体家族成员之一，能与凋亡相关斑点样蛋白和Caspase-1前体组成 NLRP3 炎症小体复合物，促使Caspase-1活化，活化的Caspase-1将细胞内所产生的IL-1β前体加工成成熟的的IL-1β，并在炎症中发挥重要作用，造成骨量丢失。
成骨细胞：是骨形成的主要细胞，其功能是参与骨基质的合成、分泌和矿化，在牙槽骨改建过程中发挥重要作用。

背景：唑来膦酸主要作用于破骨细胞的形成，也能抑制成骨细胞的凋亡及成骨细胞增殖和分化，但唑来膦酸对去势大鼠牙槽骨促成骨作用及机制尚存在争议。
目的：基于牙槽骨 NLPR3/Caspase-1/IL-1β信号通路，探讨唑来膦酸对去势大鼠牙槽骨促成骨作用的机制。
方法：选取36只SD雌性大鼠，随机分为对照组、模型组、唑来膦酸组，每组12只，后两组采用双侧卵巢切除术建立骨质疏松大鼠模型，唑来膦酸组于造模术后12周一次性皮下注射20 μg/kg唑来膦酸，对照组及模型组注射同等剂量生理盐水。药物干预4周后麻醉大鼠，收集腹主动脉血清及取牙槽骨进行相关检测。ELISA检测大鼠血清中碱性磷酸酶、骨钙素及白细胞介素1β的表达水平；苏木精-伊红染色观察各组大鼠牙槽骨病理结构变化；TUNEL染色检测各组大鼠牙槽骨成骨细胞凋亡情况；钙黄绿素荧光标记检测牙槽骨骨形成情况；Western blot检测各组大鼠牙槽骨骨组织中NLPR3、Caspase-1、白细胞介素1β蛋白的表达水平及Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶和骨钙素蛋白的表达情况。

结果与结论：①与模型组相比，唑来膦酸组大鼠血清中碱性磷酸酶及白细胞介素1β表达水平显著降低 (P < 0.01)，骨钙素表达水平显著升高(P < 0.05)；②与模型组相比，唑来膦酸组牙槽骨病理结构有所改善；③唑来膦酸组TUNEL 阳性细胞数明显低于模型组(P < 0.001)；④唑来膦酸组骨小梁矿化沉积率和新骨形成率较模型组高(P < 0.05)；⑤Western blot结果显示，与对照组相比，模型组NLPR3、Caspase-1、白细胞介素1β蛋白表达均升高(P < 0.05)，Runt 相关转录因子 2、碱性磷酸酶、骨钙素蛋白表达均降低(P < 0.05)；而唑来膦酸组NLPR3、Caspase-1、白细胞介素1β蛋白表达水平均降低(P < 0.05)，Runt 相关转录因子 2、碱性磷酸酶、骨钙素蛋白表达水平均升高(P < 0.05)；⑥提示唑来膦酸可以影响血清中成骨相关因子及炎性因子的表达来改善骨代谢及炎性反应状态，增强成骨细胞分化功能，延缓骨质疏松形成；唑来膦酸可改善牙槽骨骨组织结构、减少牙槽骨成骨细胞凋亡及NLPR3、Caspase-1、白细胞介素1β蛋白表达，增加牙槽骨骨小梁矿化沉积率、新骨形成率及Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨钙素蛋白表达，其可能与抑制NLRP3/Casapse-1/IL-1β信号通路有关。

https://orcid.org/0000-0002-1486-8834(宋娜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 唑来膦酸, 去势大鼠, 牙槽骨, NLRP3炎性小体, 成骨细胞

Abstract: BACKGROUND: Zoledronic acid mainly acts on the formation of osteoclasts and also inhibits osteoblast apoptosis, proliferation, and differentiation. However, the effect and mechanism of zoledronic acid on alveolar bone formation in ovariectomized rats are still controversial.
OBJECTIVE: To explore the osteogenic effect of zoledronic acid on alveolar bone of ovariectomized rats via alveolar nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3)/cysteinyl-aspartate protease-1 (Caspase-1)/interleukin-1β pathway.
METHODS: Totally 36 female Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, model group, and zoledronic acid group, with 12 rats in each group. Bilateral oophorectomy was used to establish an animal model of osteoporosis in the latter two groups. The zoledronic acid group was subcutaneously given 20 μg/kg zoledronic acid at 12 weeks after modeling, while the control and model groups were injected with the same dose of normal saline. All animals were anesthetized after 4-week drug intervention to collect serum samples from the abdominal aorta and alveolar bone samples. Serum alkaline phosphatase, osteocalcin and interleukin-1β levels were detected by ELISA. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological changes of rat alveolar bone. TUNEL staining was used to detect the apoptosis of osteoblasts in rat alveolar bone. The formation of alveolar bone was detected by calcein fluorescent labeling. Western blot assay was used to detect the levels of NLPR3, Caspase-1 and interleukin-1β in alveolar bone tissue as well the protein expression of Runt related transcription factor 2, alkaline phosphatase, and osteocalcin.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the expression level of alkaline phosphatase in rat serum decreased in the zoledronic acid group (P < 0.01), while the expression level of osteocalcin increased significantly (P < 0.05). Compared with the model group, the pathological structure of alveolar bone in the zoledronic acid group was improved. The number of TUNEL positive cells in the zoledronic acid group was significantly lower than that in the model group (P < 0.001). The mineralization deposition rate and new bone formation rate of trabecular bone in the zoledronic acid group were higher than those in the model group (P < 0.05). (5) Western blot results showed that compared with the control group, NLRP3, Caspase-1, interleukin-1β proteins was highly expressed in the model group (P < 0.05), while the expressions of Runt related transcription factor 2, alkaline phosphatase, and osteocalcin proteins were decreased (P < 0.05). However, treatment with zoledronic acid decreased the protein expression of NLRP3, Caspase-1, and interleukin-1β (P < 0.05), but increased the protein expression of Runt related transcription factor 2, alkaline phosphatase, and osteocalcin (P < 0.05). The above results show that zoledronic acid can affect the expression of osteogenic related factors and inflammatory factors in serum to improve bone metabolism and inflammatory response, enhance the differentiation function of osteoblasts, and delay the formation of osteoporosis. Zoledronic acid can improve alveolar bone structure, reduce alveolar bone osteoblast apoptosis and the protein expression of NLRP3, Caspase-1, and interleukin-1β, increase the mineralization deposition rate and new bone formation rate of alveolar bone trabecula and the protein expression of Runt related transcription factor 2, alkaline phosphatase, and osteocalcin, which may be related to the inhibition of NLRP3/Caspase-1/interleukin-1β signaling pathway.

Key words: zoledronic acid, ovariectomized rat, alveolar bone, NLRP3 , inflammasome, osteoblast

中图分类号:

宋娜, 刘官娟, 程余婷, 熊玥, 罗珊珊, 洪伟, 廖健. 唑来膦酸促进去势大鼠牙槽骨的成骨作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4494-4501.

Song Na, Liu Guanjuan, Cheng Yuting, Xiong Yue, Luo Shanshan, Hong Wei, Liao Jian. Zoledronic acid promotes alveolar bone formation in ovariectomized rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(28): 4494-4501.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析纳入实验动物数量36只，随机分为3组，每组12只，实验过程中无脱失。
2.2 唑来膦酸对骨质疏松大鼠血清中成骨细胞分化因子及炎性因子的影响与对照组比较，模型组大鼠血清中成骨分化相关因子碱性磷酸酶活性显著升高(P < 0.01)、骨钙素质量浓度显著降低(P < 0.05)，炎性因子IL-1β水平显著升高(P < 0.01)；与模型组比较，唑来磷酸组大鼠血清中碱性磷酸酶活性显著降低(P < 0.05)、骨钙素质量浓度显著升高(P < 0.05)，炎性因子IL-1β水平显著降低(P < 0.05)；与对照组比较，唑来膦酸组大鼠血清中碱性磷酸酶、骨钙素、IL-1β表达无明显差异，见图1。

2.3 唑来膦酸对去势大鼠下颌牙槽骨骨组织形态的影响苏木精-伊红染色观察结果显示，模型组下颌牙槽骨根分叉区域松质骨骨小梁较对照组明显变细变窄，骨髓腔变大，破骨细胞数量增多，出现大量骨吸收陷窝，骨量明显减少；与模型组相比，唑来膦酸组下颌牙槽骨根分叉区域松质骨骨小梁较粗大，呈片状且致密，骨髓腔间隙减少，骨量增多，见图2。

2.4 唑来膦酸对去势大鼠下颌牙槽骨成骨细胞凋亡的影响 TUNEL凋亡的检测结果表明，对照组中TUNEL阳性细胞较少，与其他两组比较，模型组的TUNEL阳性细胞数量显著增多(P < 0.001)；而唑来膦酸组TUENL阳性细胞数量减少(P < 0.001)(图3)，表明唑来磷酸能抑制模型组牙槽骨成骨细胞的凋亡。

2.5 唑来膦酸对去势大鼠下颌牙槽骨新骨形成和骨矿化的影响通过对大鼠下颌牙槽骨骨小梁中钙黄绿素荧光双标进行分析，其中荧光双线之间的距离为7 d内新形成骨组织，其分析结果表明，与对照组相比，模型组中新骨形成量明显降低，荧光强度减弱，经药物干预后，荧光双标间的距离明显增加，且荧光强度增强且密集(图4)，表明唑来膦酸可促进骨的形成，防止因雌激素缺乏导致牙槽骨骨量丢失。

2.6 唑来膦酸对骨质疏松大鼠牙槽骨骨组织蛋白中成骨细胞分化相关因子及NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达的影响与对照组相比，模型组牙槽骨骨组织Runt 相关转录因子 2、碱性磷酸酶、骨钙素蛋白相对表达量显著降低(P < 0.05)，NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，唑来膦酸组牙槽骨骨组织Runt 相关转录因子 2、碱性磷酸酶、骨钙素蛋白相对表达量显著升高(P < 0.05)，NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量显著降低(P < 0.05)，而对照组与唑来膦酸组相比差异无显著性意义，见图5。

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引言

种植义齿因有不损伤天然牙、舒适美观、稳定固位好和咀嚼功能好等诸多优点，目前已成为口腔临床中缺失牙患者修复治疗的首选方式。宿主骨的状况决定种植义齿修复骨结合成功的关键。研究表明，种植体周围的骨质量和数量是种植体与骨界面之间紧密结合的基础且易获得初期稳定性[1]。
在骨结合过程中，成骨细胞介导的骨形成能够促进种植体周围骨组织重建[2-3]。绝经后骨质疏松症是因雌激素缺乏导致过度骨吸收、新骨形成不足、骨量减少、骨强度降低、骨微结构退变及骨脆性增加为主要特征的一种骨代谢性疾病[4-5]。研究发现，骨质疏松患者行种植体植入初期稳定性下降，骨愈合时间延长及种植体周围骨再生能力减弱，影响种植成功率[6-7]。根据目前研究表明，大约有10.9%的种植失败率是因骨质疏松患者牙槽骨骨结构不良、骨量不佳所导致[8]。因此，使用抗骨质疏松药物治疗来提高种植体周围骨结合率和初期稳定性是至关重要的。
唑来膦酸属于第3代双膦酸盐类药物，为临床治疗骨代谢异常疾病的主要用药，其因有特殊的分子式结构，能与骨组织表面直接结合进入破骨细胞来抑制骨吸收，同时激活受抑制的成骨细胞，以纠正骨代谢平衡[9]。虽然唑来膦酸主要靶向于破骨细胞的形成和诱导成熟破骨细胞凋亡，但也有研究证明唑来膦酸能抑制成骨细胞的凋亡，且能刺激成骨细胞的增殖和分化[10-12]。目前，唑来膦酸已广泛用于临床，但有文献报道大量长期使用会引起发烧、疼痛、流感样症状以及低钙血症、肾功能损害、非典型股骨骨折等许多不良作用，也可能出现双膦酸盐相关性颌骨坏死，此病发病率低，主要发生在下颌骨[13-15]，但具体的潜在机制至今仍不清楚，因此，临床应用中尚未确定唑来膦酸的具体用药方案。有学者研究发现，低浓度唑来膦酸可促进成骨细胞的增殖、分化，增加成骨相关基因的表达[16-17]。相反，高浓度唑来膦酸对成骨细胞具有毒性作用，可降低骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，并增加成骨细胞凋亡[18-19]。因此，为了避免因唑来膦酸导致双膦酸盐相关性颌骨坏死等并发症的发生，作者所在课题组前期经体内研究发现给予单次低剂量唑来膦酸能显著增加牙槽骨新骨形成[20]，并减少成骨细胞凋亡及破骨细胞活性，从而抑制牙槽骨的吸收[21-22]；而体外实验也表明，低浓度唑来膦酸能有效抑制核因子κB受体活化因子配体激动剂介导的破骨细胞形成和激活，且没有发现任何细胞毒性作用，说明唑来膦酸可显著抑制成熟破骨细胞的形成及骨吸收功能，且对破坏性骨骼疾病有一定治疗作用[23-24]。但唑来膦酸对成骨细胞的作用及机制尚存在争议[16，25]。
核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小体可通过影响成骨细胞和破骨细胞的分化在骨质疏松的发病机制中发挥重要作用[26]。因雌激素缺乏诱导的骨质疏松，炎性细胞因子产生增加，其通过抑制成骨细胞的分化和活性来减少骨形成[27-28]。当机体受到病原相关分子模式和损伤相关分子模式刺激后可诱导NLRP3炎性小体复合物形成，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteinyl-aspartate protease-1，Caspase-1)，调节炎性细胞因子白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18的成熟和分泌，从而参与机体炎症反应和抑制成骨细胞分化[26，29]。
作者所在课题组前期研究已发现，在骨质疏松大鼠体内NLRP3、Caspase-1、IL-1β显著表达，而使用唑来磷酸药物治疗后其表达显著减低，减少了破骨细胞的数量，从而抑制牙槽骨吸收[20]。基于前期实验，作者将继续探讨唑来磷酸通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路对去势大鼠牙槽骨促成骨作用的影响，为唑来膦酸在口腔种植体早期骨结合方面提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，采用单因素方差分析法(One-way ANOVA)进行各组间比较。
1.2 时间及地点实验于2021年 8-12月在贵州医科大学动物中心进行动物饲养及标本取材，2022年 1-6月在贵州医科大学分子生物学重点实验室完成相关形态学及蛋白检测。
1.3 材料
1.3.1 实验动物及分组 12周龄成年雌性 SPF 级SD大鼠36只，体质量 250-300 g，由贵州医科大学动物中心提供。按随机数字表法随机分为对照组、模型组及唑来膦酸组，每组12只。此次实验在贵州医科大学动物实验伦理委员会审核通过下进行，批准号：2000887。
1.3.2 动物饲养条件所有动物饲养于贵州医科大学实验动物中心，大鼠饲养条件为：恒温(24±2) ℃，恒湿55%-60%，24 h循环光照，每笼五六只，自由摄食及饮水。大鼠适应环境1周后进行实验。
1.3.3 主要试剂及仪器唑来膦酸(瑞士，Novartis PharmaSteinAG)，钙黄绿素(美国，Sigma)，碱性磷酸酶试剂盒和骨钙素试剂盒、苏木精-伊红染色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、10%或12%SDS-PAGE，兔源多克隆 NLRP3抗体(Novus，批号：NBP2-12446)，兔单克隆半胱天冬氨酸蛋白酶 1抗体 (Abcam，批号：Ab179515)，兔源多克隆IL-1β抗体 (Abcam，批号：Ab9787)，兔单克隆Runt 相关转录因子 2抗体(Abcam，批号：ab236639)，兔源多克隆骨钙素抗体 (Affinity)，兔源多克隆碱性磷酸酶抗体(Bioss，批号：bs-6292R)，羊抗兔二抗(biopm，批号：PMK-014-090s)，兔源多克隆β-actin抗体(absin，批号：abs132001)。
1.4 方法

1.4.1 骨质疏松动物模型的构建术前大鼠禁食禁饮12 h，整个手术过程在无菌条件下进行，参考作者所在课题组前期实验及文献制备大鼠骨质疏松模型[21，30]。采用 3%戊巴比妥钠 (35 mg/kg)进行全身麻醉，大鼠取俯卧位，手术部位备毛(范围约4 cm×7 cm)，常规消毒，在脊柱两侧约2 cm处作一纵行切口(1.5 cm)，逐层剪开皮肤、筋膜及肌肉，找到白色脂肪团，将其拉出找到形状呈桑葚状的卵巢，丝线结扎，可顺带把脂肪内的小血管结扎(防止剪下卵巢时出血)，其中模型组和唑来磷酸组摘除双侧卵巢，构建骨质疏松动物模型；对照组仅去除卵巢周围等质量的脂肪组织，严密缝合肌肉并撒青霉素粉，最后严密缝合皮肤，并碘伏消毒以预防创口感染，6 h后给予饮食饮水。术后3个月，唑来膦酸组单次低剂量皮下注射唑来膦酸 20 μg/kg，对照组和模型组皮下注射相同剂量的生理盐水。药物干预后4周进行标本采集。

1.4.2 标本采集各组大鼠分别在处死前9 d和前2 d，皮下注射钙黄绿素(20 mg/kg)，对骨组织进行荧光标记[31]。标记结束后采用 3%戊巴比妥钠 (35 mg/kg)麻醉动物，收集大鼠腹主动脉血液(取血时间最好为早晨8-10点)，然后取出牙槽骨骨组织，采用生理盐水纱布小心分离颌骨上的软组织，然后分为3部分：一部分用40 g/L多聚甲醛固定48 h，10%乙二胺四乙酸脱钙液脱钙，每3-5 d更换一次脱钙液，一两个月用针尖检测牙槽骨组织，直到针尖能插入组织内为止，常规石蜡切片进行苏木精-伊红染色；第二部分用体积分数10%甲醛固定48 h，流动水冲洗后，不进行骨组织脱钙，于硬组织磨片观察第一磨牙根分叉内牙槽骨中钙黄绿素标记情况；将剩余牙槽骨骨组织立即使用无酶水反复冲洗，然后将牙槽骨骨组织置于-80 ℃冰箱保存备用，用于Western blot检测。
1.4.3 ELISA法检测血清碱性磷酸酶、骨钙素、IL-1β水平将收集的SD大鼠血清，置于离心管中，3 000 r/min离心15 min，吸取上层血清，置于-80 ℃保存。按照碱性磷酸酶、骨钙素和IL-1β血清试剂盒说明书进行操作，用酶联仪在450 nm波长依序测定各孔的吸光度(A)值，根据吸光度A值所绘制的标准曲线计算血清中碱性磷酸酶、骨钙素和IL-1β的表达水平。
1.4.4 病理学苏木精-伊红染色将各组已脱钙好的大鼠牙槽骨石蜡切片脱蜡至水，二甲胺Ⅰ、Ⅱ脱蜡、逐级乙醇脱苯各10 min。将切片置于苏木精染液染3-5 min，流动水冲洗，分化液分化后流动水冲洗。再置于梯度乙醇脱水各5 min，然后置于伊红染液中染色5 min。之后将切片置于梯度乙醇中脱水，各5 min，再放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明各5 min，中性树胶封固。显微镜下观察牙槽骨骨结构结变化。
1.4.5 TUNEL染色检测牙槽骨成骨细胞凋亡检测各组大鼠下颌骨细胞的凋亡情况，按照TUNEL试剂盒说明书步骤对下颌骨石蜡切片进行染色，然后通过光学显微镜和Image J 8.0软件统计分析下颌第一磨牙根分叉区域的TUNEL阳性细胞数。
1.4.6 钙黄绿素荧光标记将各组大鼠的牙槽骨标本经体积分数10%甲醛液固定48 h，流动水冲洗后，用梯度乙醇(70%-95%)进行脱水，之后放入无水乙醇+Technovit 7200树脂液(3∶7)浸液浸泡2 d，再放入无水乙醇+Technovit 7200树脂液(1∶1)浸液浸泡2 d，然后放入Technovit 7200树脂液Ⅰ、Ⅱ浸泡，分别为7 d及3 d，于光固化机中包埋聚合。取出下颌牙槽骨骨组织块，用德国EXAKT300CP硬组织切片机将骨组织切取200 μm切片，以320目、800目、1 200目砂纸将切片磨至20 μm，最后以4 000目砂纸抛光。通过OsteoMeasure分析软件测量和计算下颌牙槽骨骨矿物质沉积率和骨形成率。
1.4.7 Western blot检测液氮研磨牙槽骨组织(50-100 mg)，放入1.5 mL EP管中，迅速加入200 μL RIPA裂解液+PMSF抑制剂混合液，冰上裂解 40 min，4 ℃ 12 000 r/min离心 25 min，取上清。用 BCA法测定总蛋白浓度。加入Loading buffer恒温金属浴100 ℃变性10 min；SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭 2 h，一抗有：NLRP3(1∶500)、Caspase-1(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、碱性磷酸酶(1∶1 000)、Runt 相关转录因子 2(1∶1 000)、骨钙素(1∶1 000)、β-actin(1∶10 000)4 ℃孵育过夜，羊抗兔二抗(比例：1∶15 000)室温孵育2 h，ECL显影，采用Image J分析软件分析条带灰度值，并计算蛋白相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①ELISA法检测血清碱性磷酸酶、骨钙素和IL-1β水平；②苏木精-伊红染色观察牙槽骨病理结构改变；③TUNEL染色检测下颌牙槽骨成骨细胞凋亡情况；④钙黄绿素荧光标记下颌牙槽骨骨矿物质沉积率和骨形成率；⑤Western blot检测牙槽骨组织中NLRP3相关通路蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β和成骨分化相关蛋白Runt 相关转录因子 2、碱性磷酸酶、骨钙素的表达水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 25.0软件对各项数据进行统计分析，应用 GraphPad Prism 8.0绘制统计图，计量数据均采用x±s表示。正态分布多组间的比较采用单因素方差分析(one-Way ANOVA)，而非正态分布多组间的比较采用非参数检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经贵州医科大学统计学专家审核。

讨论

骨质疏松因骨质结构改变导致骨重建过程中骨吸收与骨形成比例失衡，造成全身性骨代谢性疾病发生。在骨重建过程中新骨形成不仅是骨组织愈合的先决条件，同时也是种植体骨结合的首要条件[32]。经大量研究发现，拔牙后骨组织愈合和种植体骨结合时间延长与骨质疏松之间存在显著正相关[33-36]。骨形成不足是绝经后骨质疏松中的重要发病机制之一[37]。此次实验结果发现，唑来膦酸可以改善去势大鼠诱导的骨质疏松症，并促进成骨细胞分化；来自荧光标记的数据表明，唑来膦酸可以防止因破骨细胞的过度产生引起骨小梁退化，并加快牙槽骨新骨形成的速度。此外，此次实验数据还表明，骨的形成可能与NLRP3/Capspase-1/IL-1β信号通路的抑制及Runt 相关转录因子 2、碱性磷酸酶、骨钙素的上调表达有关。
唑来膦酸是目前应用最广泛且是治疗抗骨质疏松最有效的第3代双膦酸盐类药物。唑来膦酸主要作用于破骨细胞且具有抗破骨细胞活性的功能，但也有研究表明唑来膦酸发挥抗骨吸收的功能可能与成骨细胞的间接作用有关[15，38]。OCHIAI等[39]研究发现，唑来膦酸能够促进大鼠成骨细胞增殖以及分泌促生长因子类胰岛素增长因子1来促进骨合成代谢。但随着唑来膦酸剂量增加及治疗时间延长，药物相关性颌骨坏死发展的风险因素也增加[40-41]。因此，有学者研究发现，低剂量唑来膦酸能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，增加成骨相关基因Ⅰ型胶原酶、Runt 相关转录因子 2及碱性磷酸酶的表达[17]。此外，动物研究发现，单次低剂量唑来膦酸对植入骨质疏松大鼠胫骨的钛种植体的接触面积及新骨形成具有促进作用[42]。同样有研究者在一项随机对照试验中发现，低剂量或低频次给予唑来膦酸可延长抗破骨细胞活性、降低骨折风险，且可维持骨骼的轴向骨密度长达10年之久[43]。作者所在课题组前期已证明，采用短期单次低剂量唑来膦酸有能效促进去势大鼠牙槽骨骨形成，减少破骨细胞数量及抑制成骨细胞凋亡，且未发现双膦酸盐相关性颌骨坏死的组织学迹象[20-21]。此外，课题组前期体外实验也表明，低浓度唑来膦酸能有效抑制成熟破骨细胞的形成及骨吸收功能，且未发现任何细胞毒性作用[23-24]。基于课题组前期探讨出的唑来膦酸剂量能有效促进去势大鼠牙槽骨新骨形成，抑制破骨细胞活性，减少牙槽骨吸收，说明唑来膦酸对破坏性骨骼疾病有一定治疗作用。因而，此次实验同样采用短期低剂量唑来膦酸作用于去势大鼠牙槽骨骨组织结构改善及对成骨细胞的作用与影响，并认为其机制可能与NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路有关。其实验结果显示，唑来膦酸药物干预后，下颌牙槽骨根分叉区域松质骨骨小梁较粗大，呈片状且致密，骨髓腔间隙减少，骨量增多；成骨细胞凋亡数量显著减少、骨矿物质沉积率及新骨形成率显著升高，说明唑来膦酸可改善牙槽骨病理结构状态，促进去势大鼠的成骨能力及抑制成骨细胞凋亡。
在成骨分化过程中，成骨分化相关因子Runt 相关转录因子 2及碱性磷酸酶的表达、Ⅰ型胶原酶、骨钙素、骨桥蛋白发挥重要作用[44]。其中，由成骨细胞合成的碱性磷酸酶、骨钙素是骨形成和骨转换的特异性标志物，可反映成骨细胞的活性和成骨细胞分化的过程[45]。碱性磷酸酶在成骨过程中具有降解磷酸酶的作用及分解无机磷酸盐，促进骨矿化物质的沉积，有利于骨形成[46-47]。骨钙素是一种调节骨钙代谢的维生素 K 依赖性蛋白，与成骨细胞活性密切相关，在骨钙代谢中具有至关重要的作用[48]。Runt 相关转录因子 2是成骨细胞分化过程中的特异性转录因子，其缺失可导致成骨细胞分化受到抑制[49-50]。研究发现，抑制Runt 相关转录因子 2、骨钙素的表达与骨形成减少密切相关[51-52]。此次实验研究结果显示，模型组大鼠血清中成骨分化相关指标碱性磷酸酶活性显著升高、骨钙素表达水平显著降低，而经唑来膦酸干预后，碱性磷酸酶活性显著降低、骨钙素表达显著升高；而在牙槽骨组织中Runt 相关转录因子 2、碱性磷酸酶、骨钙素蛋白表达水平显著降低，经药物干预后其表达显著升高。其可能是因为卵巢切除后雌激素水平急剧下降，骨钙流失加重，骨代谢进程加快，成骨细胞难以转化为骨细胞，以至于碱性磷酸酶在血清中的水平升高、骨钙素水平降低，其结果与文献[53]结果一致；而碱性磷酸酶和骨钙素在骨组织中的表达水平与血清不一致，可能是因为其来源不同。经唑来膦酸干预后成骨相关因子有所逆转，说明唑来膦酸能改善去势大鼠牙槽骨骨重建过程，且对骨质疏松有治疗作用。
NLRP3 是NOD样受体(Nucleotide-binding oligomerization domain-likereceptors，NLRs)家族成员之一，能与凋亡相关斑点样蛋白和Caspase-1前体组成 NLRP3 炎症小体复合物[54]。当NLRP3炎性小体激活时，活化的Caspase-1将细胞内所产生IL-1β前体和IL-18前体加工为成熟的IL-1β和IL-18，从而导致骨形成减少[55]。雌激素缺乏诱导的骨质疏松，促炎细胞因子产生增加，破骨细胞活性增加，从而导致骨质流失[56]。此外，促炎细胞因子还可以通过抑制成骨细胞的分化及活性使骨形成减少[57]。研究发现，去卵巢诱导的骨质疏松症，可激活NLRP3炎性小体，从而抑制成骨细胞分化[58]。而抑制NLRP3炎性小体，破骨细胞形成受到抑制，成骨细胞分化增强，防止去卵巢小鼠骨质流失[59]。因此，NLRP3炎性小体在骨质疏松中发挥重要作用[60]。IL-1β的过度产生使成骨细胞的增殖和矿化骨基质的形成受到抑制，破坏了骨代谢平衡[61]。在此次实验结果中发现，模型组大鼠血清中IL-1β表达水平升高，唑来膦酸治疗后，其表达水平显著降低；在模型组大鼠牙槽骨中骨组织蛋白 NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白水平表达显著上升，而在牙槽骨中的成骨分化相关因子Runt 相关转录因子 2、碱性磷酸酶、骨钙素蛋白水平表达显著降低，经药物干预后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白水平表达均下降，Runt 相关转录因子 2、碱性磷酸酶、骨钙素蛋白水平表达均上升。说明唑来膦酸在大鼠去势后诱导的骨质疏松中促进成骨细胞的分化可能与抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路有关。
此次实验的局限性：单从动物层面看各方案对骨形成的影响，唑来膦酸有促成骨作用，其机制可能与NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路有关，此通路活化可抑制成骨和矿化，还需通过细胞实验再次验证各方案的疗效差异；其次，此次实验是基于前期实验皮下给药，来验证牙槽骨局部骨质情况，因此，是否局部药物作用改善局部骨质效果会更佳，也更贴近此次研究口腔种植骨结合的内容，仍需进一步实验加以验证；最后，唑来膦酸是否直接抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路来促进成骨作用，还需阻断实验加以验证。
综上所述，短期且低剂量应用唑来膦酸可以显著改善去势大鼠牙槽骨的骨组织结构，减少骨量丢失，对牙槽骨骨形成具有一定促进作用，同时唑来膦酸可能下调牙槽骨组织中的NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达水平，也能上调牙槽骨组织中的Runt 相关转录因子 2、碱性磷酸酶、骨钙素蛋白表达水平。此次实验通过探讨唑来膦酸可能抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路来改善去势大鼠牙槽骨骨组织结构及成骨分化的功能，为临床上骨质疏松患者在口腔种植领域促进种植体周围骨组织再生、缩短治疗时间提供便利及理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

唑来膦酸促进去势大鼠牙槽骨的成骨作用

Zoledronic acid promotes alveolar bone formation in ovariectomized rats

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