Современное понимание микроскопии уже давно не ограничивается рамками традиционного представления об оптических приборах для получения увеличенных изображений, измерения объекта и изучения деталей его структуры. Вторая половина ХХ века ознаменована разработкой новых подходов и технологических решений, позволивших поднять методы визуализации объектов с помощью оптических микроскопов на качественно иной — субмикронный уровень. Однако имеющиеся возможности оптической световой микроскопии ограничиваются так называемым дифракционным пределом, который связан с невозможностью различить два объекта, разделенных расстоянием меньшим, чем половина длины волны света, и ограничивающим максимальную способность оптического микроскопа разрешением 0,2 мкм.
Развитие фундаментальной науки позволило преодолеть порог разрешающей способности микроскопов с помощью создания приборов (сканирующих электронных микроскопов), визуализирующих поверхность образца, используя его физико-химические свойства, к примеру, способность отражать или поглощать электроны. Дальнейшие исследования заложили основу для разработки новых методов с нанометровой и субнанометровой разрешающей способностью визуализации изучаемого объекта. В 1981 г. швейцарец G. Binnig и немец G. Rohrer разработали технологию зондовой сканирующей туннельной микроскопии (СТМ), открывшей дверь в мир атомов [1]. Позже, в 1986 г., этой же группой авторов предложен первый атомно-силовой микроскоп (АСМ) — продолжатель рода сканирующих зондовых микроскопов [2, 3]. Рождение указанных методов, впервые позволило «увидеть, прикоснувшись» мельчайшие объекты, наблюдение за которыми ранее считалось невозможным. Принцип зондовой микроскопии заключается в сканировании поверхности исследуемого образца сверхтонким зондом (кантилевером). СТМ и АСМ отличаются типом регистрируемого взаимодействия между зондом и поверхностью. При СТМ объект исследования (только проводящие образцы) и зонд замкнуты в общую электрическую цепь с источником тока. При этом регистрируемой величиной является туннельный ток, возникающий при сближении зонда и образца до расстояния (~1 нм), при котором наблюдается туннельный эффект. В процессе исследования туннельный ток поддерживается постоянным за счет изменения расстояния между зондом и поверхностью образца, в результате чего и регистрируется изображение. В случае АСМ измеряется сила Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий, т. е. регистрируется взаимное электростатическое притяжение или отталкивание атомов между зондом и исследуемым образцом. Изменение изгиба кантилевера при взаимодействии с исследуемым образцом чаще всего измеряется при помощи лазера, луч которого отражается от поверхности зонда, а затем улавливается фотодиодом. При этом максимальный перепад расстояний между зондом и объектом исследования может составлять несколько микронов. Колебательные движения, регистрируемые в результате сканирования, преобразуются в трехмерное изображение поверхности образца с получением 3D-репрезентации рельефа.
Основным преимуществом АСМ перед СТМ является возможность работы как с проводящими, так и с непроводящими образцами, в том числе — жидкостями, что расширяет диапазон для проведения исследований биологических объектов на субнанометровом уровне. При контактном режиме АСМ наконечник кантилевера и образец находятся в постоянном контакте друг с другом. Изучение мягких образцов ткани в этом случае может повреждать ткань. В связи с этим более щадящим является так называемый режим прерывистого (интермиттирующего) контакта АСМ. В этом режиме кантилевер колеблется с переменной резонансной частотой. Для поддержания постоянной амплитуды колебания кантилевера его позиция относительно образца беспрерывно корректируется. При приближении свободно колеблющегося наконечника кантилевера к поверхности образца амплитуда сокращений уменьшается, при удалении — увеличивается. На частоту и амплитуду колебательных движений влияют следующие факторы: наличие тончайшей прослойки воды, находящейся на поверхности при нормальных условиях, влияние силы сопротивления, электростатических и стерических взаимодействий, силы Ван-дер-Ваальса, возникающей между наконечником и водой. Несмотря на то что данная технология АСМ не дает такого же разрешения, как при контактном режиме, возникающие в момент сканирования силы бокового сдвига, способные повредить ткань, при режиме прерывистого контакта значительно слабее [4]. К существующим недостаткам АСМ можно отнести относительно низкую скорость исследования и небольшой размер поля сканирования (максимальная площадь сканирования — 150×150 мкм). При неточной ориентации зонда возможно наслоение артефактов на получаемое изображение. Однако метод АСМ на сегодняшний день позволяет решать не только прикладные задачи, но и способствует решению фундаментальных проблем, открывая возможность изучения биологических тканей с очень высоким разрешением.
В офтальмологии с помощью метода АСМ в исследовательских целях можно получать изображения с высоким разрешением, изучая морфологию различных структур глазного яблока: роговицы [5—9], склеры [6, 10—13], хрусталика [14—16], хориоидеи [17], сетчатки [18—20] в норме и при различных патологических состояниях. Кроме того, метод АСМ позволяет исследовать микроструктуру материалов, контактирующих с глазными тканями, например интраокулярных линз (ИОЛ) [21, 22] и контактных линз [23—26].
Исследование фиброзной оболочки методом АСМ не ограничивается возможностью изучения ее поверхности и структурной организации коллагеновых волокон (порядок и периодичность расположения фибрилл, их диаметр и особенности соединения) [5, 10, 11]. Метод АСМ позволяет также исследовать морфологию Боуменовой и десцеметовой мембран [6], играющих ключевую роль в метаболизме эпителиальных и эндотелиальных клеток роговицы. Возможность визуализации на субмикронном уровне структурных изменений роговой оболочки в зоне лазерной абляции после проведения различных фоторефракционных операций (ФРК и LASIK) делает метод АСМ незаменимым для сравнительной оценки результатов хирургических вмешательств [5, 8, 9].
Результаты исследования микроструктуры склеры наглядно демонстрируют возможность использования АСМ в качестве метода оценки эффективности антиглаукомных операций. Так, проведение АСМ образцов аутопсийной склеры после лазерного воздействия позволяет выявлять формирование новых пористых структур, доказывающих возможность лазериндуцированного снижения уровня внутриглазного давления при глаукоме за счет значительного повышения гидропроницаемости склеральной оболочки [10].
Сравнительное исследование упругости решетчатой пластинки склеры в норме и при глаукоме с помощью метода АСМ позволяет зафиксировать снижение механических свойств lamina cribrosa и установить связь данного фактора с прогрессирующими патологическими изменениями в головке зрительного нерва у пациентов с глаукомной нейрооптикопатией [27].
Проблема катаракты диктует необходимость поиска новых методов для исследования хрусталика. В этой связи метод АСМ дает возможность для проведения таких исследований, позволяя изучать ультраструктуру мутного хрусталика. Высокое разрешение АСМ-изображений хрусталика без наличия признаков помутнения позволяет дифференцировать в его структуре хорошо организованные и очень тонкие волокна. В противоположность этому при катаракте такая организованность волокон отсутствует. В этом случае увеличение толщины волокон и их хаотичное расположение, по мнению авторов, является причиной снижения прозрачности хрусталика [15, 16]. Известно, что после хирургии катаракты в послеоперационном периоде развивается помутнение задней капсулы хрусталика, именуемое вторичной катарактой. В этой связи проведение АСМ в контактном режиме дает возможность изучить способность распространения пролиферативных клеточных компонентов по внутренней поверхности задней капсулы хрусталика в зависимости от рельефа ИОЛ. Результаты таких исследований позволили сделать заключение о том, что гладкая поверхность ИОЛ уменьшает способность эпителиоцитов к миграции и клеточной адгезии и, как следствие, снижает вероятность формирования вторичной катаракты [21, 22].
В последнее время стали появляться работы, посвященные применению метода АСМ при исследовании морфологии сетчатки и ее упругих свойств (эластичности). Немногочисленность таких работ, на наш взгляд, связана с недостаточно широким распространением метода и сложностью интерпретации получаемых результатов.
Между тем сетчатка — внутренняя оболочка глаза, являясь сложно организованной многослойной структурой, вызывает наибольший интерес у исследователей, что связано со значительным числом и вариабельностью заболеваний, наиболее часто приводящих к необратимой потере зрения [13].
Как известно, барьерные функции сетчатки обеспечиваются мембраной Бруха (МБ), которая вместе с клетками пигментного эпителия сетчатки и хориокапиллярным слоем образует своеобразную структурно-функциональную единицу. С возрастом МБ утрачивает свою эластичность и постепенно разрушается, запуская механизм структурных изменений в сетчатке, ассоциированных с возрастной макулярной дегенерацией. Результаты пилотного исследования с изучением МБ методом АСМ впервые представлены в 2005 г. [17]. С этой целью использовали образец сетчатки свиньи. Результаты показали, что МБ обладает более выраженной жесткостью, чем клетки пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и ткань хориоидеи, что объясняется различием их структуры. Отмечено, что так называемый центральный слой эластичных волокон МБ намного мягче, чем прилегающие к нему внутренний и внешний коллагеновые слои. Помимо этого, результаты АСМ показали статистически значимые различия в жесткости между высушенной и гидратированной тканью хориоидеи. Аналогичные результаты АСМ при изучении МБ приводятся и другими авторами [28, 29].
Известно, что ПЭС способствует поддержанию структурной и функциональной целостности фоторецепторного аппарата глаза. Состоящий из одного слоя гексагональных клеток ПЭС содержит в себе большое количество меланосом, в свою очередь содержащих пигмент меланин. Дисфункция пигментного слоя нередко сопровождается формированием необратимых дегенеративных изменений, поэтому неудивительно, что ПЭС является одним из основных объектов для научных исследований при изучении сетчатки. В работе M. Sarna и соавторов изучено влияние степени насыщенности пигментом гранул меланина на жесткость меланосом в здоровых клетках ПЭС. В качестве объекта исследования изучались образцы сетчатки свиньи. Последние разделены, в зависимости от степени содержания пигмента в ПЭС, на пигментированные и слабо пигментированные образцы. Методом АСМ проводили визуализацию и оценку эластических свойств пигментсодержащих клеток. Результаты показали, что слабо пигментированные клетки ПЭС имели крайне мягкую консистенцию и легко деформировались во время исследования под действием вибрирующего кантилевера, в то время как пигментированные клетки имели большую жесткость и упругость. Обращала на себя внимание стабильность поверхности более пигментированных клеток на всем протяжении АСМ. Клетки с высоким содержанием пигмента имели больший размер и округлые очертания по сравнению со слабо пигментированными клетками. Последние казались плоскими и имели менее правильные очертания. Результаты измерения модуля Юнга в пигментированных образцах ПЭС отдельно взятых меланосом позволили сделать вывод о том, что гранулы меланина вносят более существенный вклад в сохранение жесткости и стабильности клетки, чем ее цитоскелет [30].
В работе S. Guo и соавторов исследованы меланосомы клеток ПЭС человека в аутопсийных образцах доноров 14 и 76 лет. Целью сравнительного исследования являлось изучение механических свойств меланосом в ПЭС в разных возрастных группах. Результаты показали, что поверхность меланосом в образцах сетчатки молодых доноров более гладкая, чем в образцах сетчатки возрастной группы. В образцах ПЭС возрастных доноров обнаружено повышенное количество зон адгезии на поверхности меланосомы, что может быть объяснено наличием повышенного содержания липофусцина (внутрилизосомного продукта окисления клеточных липидов и остатков белков), являющегося биомаркером старения [31].
Нарушение функции ПЭС в условиях окислительного стресса сопровождается появлением в стекловидном теле так называемых фосфорилированных сигнальных белков, содержащихся в экзосомах (внеклеточных везикулах). К такому выводу пришли авторы, изучая структуру и состав экзосом в пунктате стекловидного тела методом АСМ. Полученные результаты позволили предположить, что наличие сигнальных белков в стекловидном теле может указывать на риск развития возрастной макулярной дегенерации [32].
Многочисленные работы, имеющие отношение к АСМ, посвящены изучению механических свойств внутренней пограничной мембраны (ВПМ) и прилегающих к ней слоев сетчатки. Так, в сравнительном исследовании M. To и соавторов изучена толщина ВПМ в образцах здоровых глаз и глаз с длительным течением сахарного диабета методами АСМ и трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Сравнение толщины ВПМ в здоровых глазах показало, что толщина ВПМ при исследовании АСМ в 2 раза больше, чем при исследовании ТЭМ. Это факт объясняется авторами проведением дегидратации ткани перед исследованием методом ТЭМ. Однако результаты сравнения толщины ВПМ в глазах больных сахарным диабетом показали отсутствие статистически значимой разницы в толщине мембран при сравнении двух методов. Последнее объясняется изначально меньшим содержанием влаги в ВПМ глаз больных сахарным диабетом [18].
В другой работе, измеряя модуль Юнга с помощью метода АСМ, оценивали прочностные свойства ВПМ. Результаты исследования подтвердили предположение о том, что ВПМ, образованная отростками нейроглиальных клеток Мюллера (КМ), имеет большое значение в поддержании механической стабильности сетчатки [17], обеспечивая ее целостность и защиту, в первую очередь, ганглиозных клеток внутренней оболочки глаза [33]. S. Park и соавторы c помощью АСМ исследовали механические свойства различных сегментов отдельно взятых КМ в изолированных образцах сетчатки крыс. Установлено, что КМ, обеспечивающие стабильность архитектоники сетчатки, обладают большей механической прочностью в направлении, перпендикулярном оси клеток, и наоборот — менее выраженными механическими свойствами в продольном их направлении. При этом тело КМ является более податливым по сравнению с отростками (рис. 1) [34]. В работе, представленной R. MacDonald и соавторами, экспериментально подтверждена каркасная функция глиальных КМ в сетчатке. Для исследования авторы использовали эмбриональную ткань сетчатки рыб данио. На завершающем этапе ретиногенеза, в период формирования глиальной ткани сетчатки, авторы воздействовали на механизмы дифференцировки клеток путем подавления сигнала к делению (notch signaling pathway). В результате развивалась сетчатка в отсутствие глиальных клеток. В ходе эксперимента изучалась прочность условно неизмененной сетчатки и ее образцов, не содержащих КМ. С этой целью выполнялось дозированное растяжение сетчатки в передне-заднем направлении с одновременным изучением степени деформации образцов с помощью метода АСМ. В результате исследования авторы пришли к выводу, что сетчатка без глиальных КМ подвержена значительной деформации по сравнению с неизмененной сетчаткой в контрольной группе [35].
Рис. 1. Механические свойства отдельно взятой клетки Мюллера.
Тело клетки Мюллера обладает меньшей прочностью по сравнению с отростками (описание в тексте) [34].
В исследовании X. Yang и соавторов изучалось in vitro влияние повышенной активности лизилоксидазы (фермента, участвующего в синтезе растворимого коллагена — тропоколлагена) на увеличение жесткости базальной мембраны сосудов сетчатки, обусловленной повышенным содержанием глюкозы. В работе с помощью метода АСМ изучены децеллюляризованные (очищенные) культуры эндотелиальных клеток, выращенных в условиях нормального и высокого содержания глюкозы. Результаты исследования показали, что индуцированное глюкозой увеличение жесткости базальной мембраны связано с двукратным увеличением содержания коллагена и повышенной экспрессией молекул межклеточной адгезии ICAM-1 на эндотелиальных клетках сосудов сетчатки. Отмечено, что миграция лейкоцитов к пораженному участку способствует выработке провоспалительных факторов, способствующих повышению сосудистой проницаемости и развитию отека сетчатки. В результате исследования удалось показать, что субэндотелиальный матрикс из культуры клеток, выращенной в условиях повышенного содержания глюкозы, в 2 раза жестче, чем в культуре клеток, выращенной в условиях нормального содержания глюкозы [36].
Возможность изучения с помощью АСМ биологических тканей на субмикронном уровне позволила исследовать зрительный пигмент родопсин, содержащийся в фоторецепторах сетчатки — палочках. С этой целью изучены образцы изолированной сетчатки мышей. В частности, определено место расположения пигмента, а именно — в мембранных дисках палочек, показана димерная организация родопсина [37]. Результаты дальнейших экспериментальных исследований нашли отражение в работах D. Fotiadis и соавторов. В ходе исследования изучалась устойчивость молекулы родопсина под воздействием внешних факторов. С этой целью кантилевер атомного микроскопа «приклеивали» к N-концевому участку (свободной аминогруппе) отдельно взятой молекулы родопсина, после чего наконечник кантилевера отодвигали от молекулы, последовательно «расплетая» ее и одновременно измеряя силу, с которой отдельные сегменты отделяются друг от друга (рис. 2). Анализ силовых кривых позволил определить силу и локализацию взаимодействий внутри молекулы родопсина во время разделения ее на отдельные структурные сегменты. Доказано, что степень прочности связанных друг с другом отдельных сегментов определяет стабильность молекулы родопсина [38, 39].
Рис. 2. Вторичная структура родопсина.
а — цифрами и стрелками обозначены начало и конец последовательно разделенных сегментов молекулы родопсина; б — каждый сегмент локализован по пикам силовых кривых [38].
Комплексное экспериментальное исследование на модели нейросетчатки in vitro с использованием, в том числе, метода АСМ позволило оценить возможность функциональной интеграции культивированных клеток в поврежденную сетчатку глаза. Кроме того, в ходе исследования выполнялась трансплантация клеток, обладающих высокой способностью к дифференцировке, а также потенциальной возможностью структурного и биохимического преобразования не только в нейроны, но и в терминально дифференцированные формы фоторецепторов. С этой целью использовались стволовые/прогениторные клетки нервной ткани и стромы костного мозга. Результаты исследования показали, что трансплантация культивированных in vitro клеток в поврежденную сетчатку, особенно в условиях дополнительной стимуляции путем введения трофических факторов (BDNF, PEDF, эритропоэтина, ангиопоэтина), сопровождается усилением процессов миграции клеток, ускорением их дифференцировки, увеличением жизнеспособности нейрональных клеток и самоорганизацией выселившихся нейронов в примитивные нервные сети. АСМ исследование в динамике показало, что при трансплантации клеток стромы костного мозга их подавляющая часть не претерпевает полную функциональную трансдифференцировку, приобретая лишь нейроноподобную морфологию. Тем не менее результаты исследования продемонстрировали принципиальную возможность проведения заместительной интеграции трансплантированных клеток в областях сетчатки, имеющих повреждения [40].
Изучение структуры исследуемых объектов и определение их упругих свойств являются ключевыми функциями АСМ, о чем уже говорилось выше. Кроме того, представляется важной возможность проведения с помощью АСМ наномеханического картографирования. Данный метод позволяет определить значение силового воздействия в каждой измеренной точке, преобразующееся в трехмерную карту твердости всей поверхности исследуемого образца с пространственным распределением участков, различных по жесткости. Картографирование облегчает понимание основных свойств изучаемых тканей, в частности сетчатки [41].
Заключение
Метод атомно-силовой микроскопии является перспективным высокоточным методом с субнанометровым разрешением, позволяющим одновременно исследовать поверхность, особенности структуры и упругие свойства биологических объектов, в том числе глазных тканей, и способствует решению многих фундаментальных и практических задач, связанных с изучением глазной патологии.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.