引用本文：
曹迪, 尹玉东, 沈鸿, 隗明, 冯胜虎, 陈曦, 杨春霞, 谷丽. MIZ1
社区获得性肺炎（CAP）是最常见的感染性疾病之一，也是重要的死亡原因之一[1]。其中，重症CAP的医院病死率可达到25%～50%[2]。因此，优化重症CAP患者的早期诊断方法、寻找药物研发的新思路具有重要意义。Myc相互作用的锌指蛋白1（MIZ1）是由zbtb17基因编码的蛋白，由N端的痘病毒和锌指（POZ）结构和在其C端的13个锌指蛋白结构组成。研究发现MIZ1在机体的炎症调控中发挥作用[3]，并且通过调节血清白细胞介素（IL）-6、α干扰素（IFN-α）、IFN-β等多种炎症因子的表达来起到调控炎症反应的作用[4-7]。针对淋巴瘤的研究发现MIZ1在淋巴细胞的发育以及淋巴系肿瘤的发生发展中起重要的调控作用[8-9]。但对外周血单个核细胞（PBMC）中的MIZ1是否参与CAP的全身炎症反应，目前尚无相关研究。本研究收集CAP患者的临床标本，检测患者PBMC中MIZ1 mRNA水平，探寻PBMC中MIZ1与CAP病情的严重程度的关系并探究其与炎症因子的关系，以期寻找重症CAP患者早期诊断的新指标并为重症CAP的防治及新药研发提供新的方向。
1 资料与方法
1.1 临床资料
纳入2018年4月至2019年6月在北京朝阳医院感染和临床微生物科和呼吸科住院治疗的CAP患者36例。CAP患者符合《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016版）》诊断标准[10]，并排除存在严重的非感染性肺部基础病，包括慢性阻塞性肺疾病、肺结核、肺部肿瘤、肺水肿、肺不张、肺栓塞等的患者。依照《ATS/IDSA成人社区获得性肺炎的诊断和治疗临床实践指南（2019版）》重症CAP判定标准[11]，将CAP患者分为重症CAP和非重症CAP两组，各18例。本研究得到北京朝阳医院伦理委员会的批准（2020-科-46）。所有参与者签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 临床资料收集
收集患者性别、年龄、合并症、转归及入院24 h内白细胞计数、C反应蛋白、降钙素原的检测结果。
1.2.2 样本处理
采用肝素抗凝管采集CAP患者入院24 h内3 mL外周静脉血，密度梯度离心法分离PBMC，同时采集CAP患者4 mL外周静脉血离心分离血清。分别冻存于–80 ℃冰箱。
1.2.3 逆转录–定量聚合酶链式反应
使用Trizol reagent 试剂盒（Life Technologies公司，美国）从PBMC中提取总RNA，使用RNeasy mini kit试剂盒（Qiagen公司，美国）进行纯化，使用SuperScript™II RT试剂（Thermo fisher公司，美国）进行RNA逆转录，使用FastSYBR®GreenMaster Mix试剂在LightCycler480 实时荧光定量PCR仪（Roche公司，瑞士）上进行逆转录–定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），以3-磷酸甘油醛脱氢酶为内参。MIZ1引物：上游5’-GGTTCCGCCCGACTCTAACA-3’，下游5’ CTCGTCCGGCTCATTACCTG-3’。引物由睿博兴科生物技术有限公司（北京）合成。RT- qPCR 数据分析采用相对定量法，MIZ1 mRNA表达水平以 2–ΔΔCt表示。
1.2.4 酶联免疫吸附试验
使用IL-6、IL-8、IL-10、IFN-α 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（达科为公司，中国）按照标准步骤进行检测。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件。符合正态分布的连续变量以均数±标准差（
±s）表示，不符合正态分布的连续变量以中位数（四分位数）［M（Q1，Q3）］表示。组间比较用t检验或非参数检验中的Mann-Whitney U检验。组间构成比的比较采用χ2检验。诊断试验评价采用受试者工作特征（ROC）曲线和曲线下面积（AUC）。相关分析采用Spearman秩相关系数。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CAP患者临床特征
36例CAP患者临床资料如表1所示。重症CAP组和非重症CAP组均以男性为主，重症CAP组男性比例更高（P<0.05）。基础疾病方面，两组的糖尿病例数、心脑血管疾病例数、慢性肾病例数和慢性肝病例数差异无统计学意义（P>0.05）。重症CAP组C反应蛋白及降钙素原水平显著高于非重症CAP组（P<0.05）。重症CAP组入住ICU例数显著高于非重症CAP组（P<0.05），死亡例数更多但差异无统计学意义（P>0.05）。
表1
入组CAP患者临床特征［（
）/例］
2.2 PBMC中MIZ1 mRNA的表达水平与CAP严重程度的关系
RT- qPCR检测结果显示，相比非重症CAP患者，重症CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA的表达水平显著降低（P=0.033）。结果见图1。根据CAP为重症或非重症绘制PBMC中MIZ1 mRNA的表达水平的ROC曲线，AUC=0.731，P=0.018（图2）。结果显示，对于CAP患者，MIZ1可以良好区分重症和非重症。
图1
非重症CAP患者和重症CAP患者MIZ1 mRNA的表达水平的比较（n=18）
散点图，横线显示均数和标准差。
图2
MIZ1诊断重症CAP的ROC曲线
AUC=0.731，
2.3 重症CAP患者MIZ1 mRNA与血清炎症因子的关系
ELISA检测结果显示，血清炎症因子水平中的IL-6、IL-10、IFN-α检测结果不符合正态分布，IL-8检测结果符合正态分布，具体结果见表2。相比非重症CAP患者，重症CAP患者的IL-6、IL-10显示出增高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。
表2
非重症和重症CAP患者的炎症因子水平［pg/mL，M（Q1，Q3）/（
）］
对重症CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA水平与血清IL-6、IL-8、IL-10和IFN-α水平分别进行相关分析，发现重症CAP患者MIZ1 mRNA水平与IL-10水平呈负相关（图3），Spearman相关系数为–0.620，P=0.042。MIZ1 mRNA水平与IL-6、IL-8、IFN-α水平无显著相关性。
图3
重症CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA与血清IL-10的相关性（n=11）
散点图。MIZ1 mRNA与IL-10呈负相关，Spearman相关系数为–0.620，
3 讨论
本研究发现，重症CAP和非重症CAP患者PBMC中的MIZ1在转录水平上呈现出显著差异。既往国内外研究在不同组织或细胞系、感染或非感染性炎症中均发现MIZ1的表达和功能常与炎症活动的程度负相关。敲除小鼠肺上皮细胞MIZ1蛋白的POZ结构使MIZ1转录功能缺失后，再用内毒素诱导小鼠炎症，小鼠出现了过度炎症、肺损伤加重和病死率升高[4]。另一项研究显示敲除小鼠肺上皮细胞MIZ1蛋白的POZ结构会增强流感病毒感染后的肺部炎症反应[6]。在大鼠上进行急性坏死性胰腺炎建模后，发现在胰腺和肺中MIZ1的mRNA和蛋白的水平与胰腺和肺组织的损伤程度负相关[7]。MIZ1还可限制肝细胞驱动的炎症[12]，敲除小鼠肝细胞中的MIZ1让肿瘤浸润巨噬细胞的极化倾向于促进促炎表型。本研究在外周血中发现MIZ1与炎症活动的相关性，发现重症CAP患者PBMC中的MIZ1 mRNA表达水平比非重症CAP患者低，该结果与既往研究相符。并且，ROC曲线显示PBMC中的MIZ1水平可以良好区分出重症和非重症CAP，提示PBMC中的MIZ1水平有作为重症CAP的标志物的潜力。
结合文献资料，细胞不同部位的MIZ1参与不同的调控作用，从两个方面参与炎症活动：（1）位于细胞质中的MIZ1负向调节肿瘤坏死因子-α（TNF-α）激活c-Jun氨基末端激酶信号通路的过程，抑制TNF-α的后续作用[4-6]；（2）位于细胞核内的MIZ1可抑制核因子κB信号通路的增强因子CCAAT增强子结合蛋白δ的转录活性，从而负向调节细菌及内毒素诱导的过度的炎症反应[6]。
本研究发现重症CAP患者PBMC中的MIZ1与血清IL-10的水平呈负相关。既往研究发现，甲型流感病毒感染后MIZ1基因缺陷细胞中的IL-6表达水平高于野生型细胞[6]。该项研究还发现MIZ1可以抑制IFN-α/β的表达，敲除或敲降MIZ1可以使感染流感病毒的小鼠肺上皮细胞中的IFN-α/β升高[6]。既往无MIZ1与IL-10相关性的报道。有文献报道，与健康个体相比CAP患者血清中IL-10水平显著增加，且重症CAP患者血清IL-10水平明显高于非重症患者和健康个体[13]。本研究中不同组IL-10水平的变化趋势与既往报道相符。同时我们发现，重症CAP患者PBMC中的MIZ1与血清IL-10的水平呈负相关，该结果提示MIZ1可能影响IL-10的表达，可针对两者之间是否存在上下游关系展开后续研究，进一步探索MIZ1参与的炎症调控过程。
本研究为重症CAP患者的诊断提供了新思路，加深了对重症CAP的发生发展机制的认识，为重症CAP的防治及新药研发提供了新方向。同时，本研究存在着局限性：本研究纳入病例偏少，且缺乏对于MIZ1与IL-10相互作用的关系和机制的探索，需要后续的细胞实验及动物实验加以阐释。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
社区获得性肺炎（CAP）是最常见的感染性疾病之一，也是重要的死亡原因之一[1]。其中，重症CAP的医院病死率可达到25%～50%[2]。因此，优化重症CAP患者的早期诊断方法、寻找药物研发的新思路具有重要意义。Myc相互作用的锌指蛋白1（MIZ1）是由zbtb17基因编码的蛋白，由N端的痘病毒和锌指（POZ）结构和在其C端的13个锌指蛋白结构组成。研究发现MIZ1在机体的炎症调控中发挥作用[3]，并且通过调节血清白细胞介素（IL）-6、α干扰素（IFN-α）、IFN-β等多种炎症因子的表达来起到调控炎症反应的作用[4-7]。针对淋巴瘤的研究发现MIZ1在淋巴细胞的发育以及淋巴系肿瘤的发生发展中起重要的调控作用[8-9]。但对外周血单个核细胞（PBMC）中的MIZ1是否参与CAP的全身炎症反应，目前尚无相关研究。本研究收集CAP患者的临床标本，检测患者PBMC中MIZ1 mRNA水平，探寻PBMC中MIZ1与CAP病情的严重程度的关系并探究其与炎症因子的关系，以期寻找重症CAP患者早期诊断的新指标并为重症CAP的防治及新药研发提供新的方向。
1 资料与方法
1.1 临床资料
纳入2018年4月至2019年6月在北京朝阳医院感染和临床微生物科和呼吸科住院治疗的CAP患者36例。CAP患者符合《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016版）》诊断标准[10]，并排除存在严重的非感染性肺部基础病，包括慢性阻塞性肺疾病、肺结核、肺部肿瘤、肺水肿、肺不张、肺栓塞等的患者。依照《ATS/IDSA成人社区获得性肺炎的诊断和治疗临床实践指南（2019版）》重症CAP判定标准[11]，将CAP患者分为重症CAP和非重症CAP两组，各18例。本研究得到北京朝阳医院伦理委员会的批准（2020-科-46）。所有参与者签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 临床资料收集
收集患者性别、年龄、合并症、转归及入院24 h内白细胞计数、C反应蛋白、降钙素原的检测结果。
1.2.2 样本处理
采用肝素抗凝管采集CAP患者入院24 h内3 mL外周静脉血，密度梯度离心法分离PBMC，同时采集CAP患者4 mL外周静脉血离心分离血清。分别冻存于–80 ℃冰箱。
1.2.3 逆转录–定量聚合酶链式反应
使用Trizol reagent 试剂盒（Life Technologies公司，美国）从PBMC中提取总RNA，使用RNeasy mini kit试剂盒（Qiagen公司，美国）进行纯化，使用SuperScript™II RT试剂（Thermo fisher公司，美国）进行RNA逆转录，使用FastSYBR®GreenMaster Mix试剂在LightCycler480 实时荧光定量PCR仪（Roche公司，瑞士）上进行逆转录–定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），以3-磷酸甘油醛脱氢酶为内参。MIZ1引物：上游5’-GGTTCCGCCCGACTCTAACA-3’，下游5’ CTCGTCCGGCTCATTACCTG-3’。引物由睿博兴科生物技术有限公司（北京）合成。RT- qPCR 数据分析采用相对定量法，MIZ1 mRNA表达水平以 2–ΔΔCt表示。
1.2.4 酶联免疫吸附试验
使用IL-6、IL-8、IL-10、IFN-α 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（达科为公司，中国）按照标准步骤进行检测。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件。符合正态分布的连续变量以均数±标准差（±s）表示，不符合正态分布的连续变量以中位数（四分位数）［M（Q1，Q3）］表示。组间比较用t检验或非参数检验中的Mann-Whitney U检验。组间构成比的比较采用χ2检验。诊断试验评价采用受试者工作特征（ROC）曲线和曲线下面积（AUC）。相关分析采用Spearman秩相关系数。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CAP患者临床特征
36例CAP患者临床资料如表1所示。重症CAP组和非重症CAP组均以男性为主，重症CAP组男性比例更高（P<0.05）。基础疾病方面，两组的糖尿病例数、心脑血管疾病例数、慢性肾病例数和慢性肝病例数差异无统计学意义（P>0.05）。重症CAP组C反应蛋白及降钙素原水平显著高于非重症CAP组（P<0.05）。重症CAP组入住ICU例数显著高于非重症CAP组（P<0.05），死亡例数更多但差异无统计学意义（P>0.05）。
表1
入组CAP患者临床特征［（）/例］
2.2 PBMC中MIZ1 mRNA的表达水平与CAP严重程度的关系
RT- qPCR检测结果显示，相比非重症CAP患者，重症CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA的表达水平显著降低（P=0.033）。结果见图1。根据CAP为重症或非重症绘制PBMC中MIZ1 mRNA的表达水平的ROC曲线，AUC=0.731，P=0.018（图2）。结果显示，对于CAP患者，MIZ1可以良好区分重症和非重症。
图1
非重症CAP患者和重症CAP患者MIZ1 mRNA的表达水平的比较（n=18）
散点图，横线显示均数和标准差。
图2
MIZ1诊断重症CAP的ROC曲线
AUC=0.731，
2.3 重症CAP患者MIZ1 mRNA与血清炎症因子的关系
ELISA检测结果显示，血清炎症因子水平中的IL-6、IL-10、IFN-α检测结果不符合正态分布，IL-8检测结果符合正态分布，具体结果见表2。相比非重症CAP患者，重症CAP患者的IL-6、IL-10显示出增高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。
表2
非重症和重症CAP患者的炎症因子水平［pg/mL，M（Q1，Q3）/（）］
对重症CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA水平与血清IL-6、IL-8、IL-10和IFN-α水平分别进行相关分析，发现重症CAP患者MIZ1 mRNA水平与IL-10水平呈负相关（图3），Spearman相关系数为–0.620，P=0.042。MIZ1 mRNA水平与IL-6、IL-8、IFN-α水平无显著相关性。
图3
重症CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA与血清IL-10的相关性（n=11）
散点图。MIZ1 mRNA与IL-10呈负相关，Spearman相关系数为–0.620，
3 讨论
本研究发现，重症CAP和非重症CAP患者PBMC中的MIZ1在转录水平上呈现出显著差异。既往国内外研究在不同组织或细胞系、感染或非感染性炎症中均发现MIZ1的表达和功能常与炎症活动的程度负相关。敲除小鼠肺上皮细胞MIZ1蛋白的POZ结构使MIZ1转录功能缺失后，再用内毒素诱导小鼠炎症，小鼠出现了过度炎症、肺损伤加重和病死率升高[4]。另一项研究显示敲除小鼠肺上皮细胞MIZ1蛋白的POZ结构会增强流感病毒感染后的肺部炎症反应[6]。在大鼠上进行急性坏死性胰腺炎建模后，发现在胰腺和肺中MIZ1的mRNA和蛋白的水平与胰腺和肺组织的损伤程度负相关[7]。MIZ1还可限制肝细胞驱动的炎症[12]，敲除小鼠肝细胞中的MIZ1让肿瘤浸润巨噬细胞的极化倾向于促进促炎表型。本研究在外周血中发现MIZ1与炎症活动的相关性，发现重症CAP患者PBMC中的MIZ1 mRNA表达水平比非重症CAP患者低，该结果与既往研究相符。并且，ROC曲线显示PBMC中的MIZ1水平可以良好区分出重症和非重症CAP，提示PBMC中的MIZ1水平有作为重症CAP的标志物的潜力。
结合文献资料，细胞不同部位的MIZ1参与不同的调控作用，从两个方面参与炎症活动：（1）位于细胞质中的MIZ1负向调节肿瘤坏死因子-α（TNF-α）激活c-Jun氨基末端激酶信号通路的过程，抑制TNF-α的后续作用[4-6]；（2）位于细胞核内的MIZ1可抑制核因子κB信号通路的增强因子CCAAT增强子结合蛋白δ的转录活性，从而负向调节细菌及内毒素诱导的过度的炎症反应[6]。
本研究发现重症CAP患者PBMC中的MIZ1与血清IL-10的水平呈负相关。既往研究发现，甲型流感病毒感染后MIZ1基因缺陷细胞中的IL-6表达水平高于野生型细胞[6]。该项研究还发现MIZ1可以抑制IFN-α/β的表达，敲除或敲降MIZ1可以使感染流感病毒的小鼠肺上皮细胞中的IFN-α/β升高[6]。既往无MIZ1与IL-10相关性的报道。有文献报道，与健康个体相比CAP患者血清中IL-10水平显著增加，且重症CAP患者血清IL-10水平明显高于非重症患者和健康个体[13]。本研究中不同组IL-10水平的变化趋势与既往报道相符。同时我们发现，重症CAP患者PBMC中的MIZ1与血清IL-10的水平呈负相关，该结果提示MIZ1可能影响IL-10的表达，可针对两者之间是否存在上下游关系展开后续研究，进一步探索MIZ1参与的炎症调控过程。
本研究为重症CAP患者的诊断提供了新思路，加深了对重症CAP的发生发展机制的认识，为重症CAP的防治及新药研发提供了新方向。同时，本研究存在着局限性：本研究纳入病例偏少，且缺乏对于MIZ1与IL-10相互作用的关系和机制的探索，需要后续的细胞实验及动物实验加以阐释。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
