引用本文： 邱振东, 邓文宏, 洪育蒲, 李满, 余佳, 王卫星. ATP 柠檬酸裂解酶对结肠癌细胞脂质代谢及肿瘤生物学行为的作用. 中国普外基础与临床杂志, 2021, 28(1): 48-52. doi: 10.7507/1007-9424.202004133 复制
结肠癌是严重威胁人类健康的肿瘤疾病，其发病率和病死率居全球所有恶性肿瘤的第 3 位，于我国居第 2 位[1]。目前结肠癌的治疗手段仍是以手术为主，放化疗为辅，但由于结肠癌易转移与复发，治疗效果依旧有限。关于结肠癌的治疗，人们逐渐提出了肿瘤的代谢疗法并取得重大进展[2-3]，近年来更多的研究针对肿瘤的脂质代谢进行治疗[3]，并逐渐与免疫应答和临床营养相结合[4]。ATP 柠檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）是一种含有 1 101 个残基的多肽且具备多功能性的四聚体[5]。ACLY 催化依赖 ATP 和依赖辅酶 A 的柠檬酸转化为草酰乙酸酯和高能生物合成前体乙酰辅酶 A1，后者为关键的生化反应提供燃料，如合成脂肪酸、胆固醇和乙酰胆碱，以及组蛋白和蛋白的乙酰化[6]，且 ACLY 基因参与了肿瘤的脂质代谢。绝大多数正常的细胞主要通过摄取食物中的营养物质来利用外源性脂肪酸，因此与脂代谢相关的酶活性也比较低，而癌细胞内源性合成的脂肪酸却占 93%[7]。研究[8]证实，在不同类型肿瘤的早期阶段，参与脂肪酸合成的许多酶如ACLY、乙酰辅酶 A（acetyl coenzyme A，AC-CoA）羧化酶、脂肪酸合成酶等表达就已开始上调。一方面，瘤细胞的快速增殖需要大量的脂质供应，因磷脂和胆固醇构成生物膜的主要结构；另一方面，脂肪酸和甘油三酯提供了充足的能量底物；再者，脂质也被用作前体来合成一些激素和介导信号转导通路的第二信使。此外，研究还发现，脂肪酸的从头合成（de novo lipogenesis，DNL）对于血管生成至关重要[9]，这可能为肿瘤细胞的再生转移和表观遗传学的重编程提供了充分条件[10]，并有相关研究报道了 ACLY 能通过促进脂质相关蛋白的活性与核转位从而促进结肠癌转移[11]，这或许意味着肿瘤患者 ACLY 的低表达与良好预后相关[12]。不仅如此，癌细胞的 DNL 将相当数量的 NADPH 还原当量转化为 NADP+，从而通过作为电子受体促进细胞氧化还原平衡[13]。由于 ACLY 是细胞 DNL 的第一个关键酶，近年来的研究开始探讨其对肿瘤细胞生物学行为的影响，但目前关于 ACLY 在结肠癌中的脂质代谢作用研究较少。为进一步明确 ACLY 基因对结肠癌细胞脂质代谢的影响，本实验在敲减 ACLY 基因后，分析结肠癌细胞增殖、凋亡、迁移以及脂质代谢的变化，并对其机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和设备
胎牛血清购自美国 Gibco 公司，双抗购自澳洲 HyClone 公司，胰蛋白酶购自中国 Biosharp 公司，慢病毒相关试剂盒购自上海吉凯基因公司，CCK-8 试剂盒购自上海东仁化学科技有限公司，Annexin Ⅴ-PE/7-AAD 凋亡检测试剂盒购自美国 BD 公司，甘油三酯测试盒购自南京建成公司。本试验一抗均购自 Abcam 公司，荧光和化学发光二抗均购自武汉塞维尔公司。主要设备包括：倒置荧光显微镜（MicroPublisher 5.0 RTV，加拿大 QIMAGING 公司）和酶标仪（EnSight ，美国 Perkin Elmer 公司）。
1.2 细胞培养
结肠癌细胞株 HCT116 来源于中国科学院昆明细胞库，在 37 ℃、5% CO2、湿度为 95% 的培养箱内培养。完全培养基为含有 10% 胎牛血清及 1% 双抗的高糖 DMEM 培养基，每 2～3 天换液 1 次，待细胞生长密度达到 80% 时，以胰蛋白酶消化，根据实验需要进行传代培养，收集对数生长期细胞用于后续研究。
1.3 方法
1.3.1 细胞转染
收集对数生长期的细胞接种于6 孔板中，根据预实验测出的最适感染复数（MOI，本研究 MOI=10）转染细胞。转染操作按试剂盒说明书进行。细胞转染 72 h 后，根据预实验测出的嘌呤霉素浓度筛选稳转细胞系，于倒置荧光显微镜下观察转染效率，最终转染效果通过 Western blot 法检测 ACLY 蛋白的表达来鉴定。以敲减 ACLY 基因的 HCT116 细胞作为 ACLY 敲减组，以空载体转染细胞作为阴性对照组，以未经处理的结肠癌 HCT116 细胞作为空白对照组。
1.3.2 Western blot 法检测相关蛋白表达
收集各组细胞，提取细胞中总蛋白，利用 Western blot 方法检测 3 组细胞中 ACLY 蛋白和 GAPDH 蛋白的表达情况，用 Image J 软件计算的条带灰度值进行半定量。重复检测 3 次。
1.3.3 CCK-8 检测细胞增殖试验
细胞以每孔5 000 个细胞的密度接种于 96 孔板中，用完全培养基（含 10% 胎牛血清）培养 24、48 和 120 h，在指定的时间加入 CCK-8，然后 37 ℃ 避光 1 h。最后，使用酶标仪在 450 nm 处测定每个样品的吸光度（A）值。通过与未经处理的对照组进行比较，估计活细胞的百分比。每组设计 3 个复孔，重复检测 3 次。
1.3.4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力
将约 5×105 个细胞接种到 6 孔板中。当样本刚刚接触和融合时，用 10 mL 吸管尖端在单层细胞上划笔直的痕迹。在 0、8 和 24 h 时以倒置显微镜拍照，并通过 Image J 软件计算划痕间距与长度的比值。每组设计 3 个复孔。
1.3.5 细胞凋亡检测
采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞在指定条件下培养后，收集至流式管，以 Annexin Ⅴ-PE/7-AAD 凋亡检测试剂盒染色。采用流式细胞术检测凋亡细胞百分率，其中 Annexin Ⅴ-PE 阳性染色为早期凋亡细胞，7-AAD 阳性染色为晚期凋亡细胞，每组每次收集 1.5×104 个细胞。实验重复 3 次。
1.3.6 细胞脂质检测
细胞内总甘油三酯含量使用甘油三酯检测试剂盒，根据产品说明书用酶标仪检测。甘油三酯含量= ［（样本 A 值–空白 A 值）/（校准 A 值–空白 A 值）］×校准品浓度/待测样本蛋白浓度，其中甘油三酯含量单位为 mmol/gprot，校准品浓度单位为 mmol/L，待测样本蛋白浓度单位为 gprot/L。每个样本设计 3 个复孔。
2 结果
2.1 细胞转染和 ACLY 基因敲减效果
倒置荧光显微镜观察细胞转染后的绿色荧光蛋白（GFP）表达结果见图 1a–1d，可见细胞转染后 48 h 开始出现微弱荧光，72 h 后荧光强度趋于稳定，经筛选后（图 1d）荧光强度更为集中。Western blot 结果可见，ACLY 敲减组细胞中 ACLY 蛋白的表达水平低于阴性对照组和空白对照组（图 1e、1f）。
图1
示 HCT116 细胞的转染效果以及 3 组 HCT116 细胞的实验结果
a–d：HCT116 细胞转染慢病毒后 0 h（a）、48 h（b）和 72 h（c）以及嘌呤霉素筛选后（d）的细胞 GFP 表达（倒置荧光显微镜 ×100）；e、f：空白对照组、阴性对照组和 ACLY 敲减组细胞中 ACLY 蛋白表达的电泳结果（e）和半定量结果（f）；g：3 组 HCT116 细胞的存活率结果；h：空白对照组、阴性对照组和 ACLY 敲减组分别在 0、8 和 24 h 的细胞划痕结果（倒置荧光显微镜 ×40）；i：8 h 时 3 组细胞的迁移率结果；j：24 h 时 3 组细胞的迁移率结果；k：3 组细胞的总凋亡率结果；l–n：空白对照组（l）、阴性对照组（m）和 ACLY 敲减组（n）的流式细胞仪凋亡检测结果；o：3 组细胞的总甘油三酯含量结果
2.2 ACLY 基因敲减抑制肿瘤细胞的晚期增殖
CCK-8 检测 3 组 HCT116 细胞的存活率结果见图 1g，可见 24 h 和 48 h 时，ACLY 敲减组的细胞存活率稍下降，但与空白对照组和阴性对照组比较差异不大。但当细胞培养至 120 h 时，ACLY 敲减组的细胞存活率下降，较空白对照组和阴性对照组低。
2.3 ACLY 基因敲减抑制细胞的迁移能力
细胞划痕实验检测的 3 组 HCT116 细胞的迁移能力结果见图 1h。用 Image J 软件计算出每张划痕细胞间距与长度的比值后，以 0 h 为基准，分别计算8 h 和 24 h 时 3 组的 HCT116 细胞迁移率。结果显示，ACLY 敲减组细胞 8 h 时的迁移率无明显下降，与空白对照组和阴性对照组比较差异不大，见图 1i；在 24 h 时ACLY 敲减组的迁移率较空白对照组和阴性对照组低，见图 1j。
2.4 ACLY 基因敲减使细胞凋亡增加
流式细胞仪检测 3 组 HCT116 细胞的凋亡结果见图 1k–1n，可见 ACLY 敲减组 HCT116 细胞的总凋亡率明显升高，高于空白对照组和阴性对照组。
2.5 ACLY 基因敲减抑制细胞甘油三酯生成
ACLY 敲减组的 HCT116 细胞内甘油三酯含量低于空白对照组和阴性对照组，见图 1o。
3 讨论
在动物的正常细胞中，脂质合成的目标是将从营养物质中提取的碳转化为脂肪酸、胆固醇、磷酸甘油酯、二十烷类和鞘脂；脂质的获得主要是通过生长因子信号传导，然后直接摄取养分，刺激细胞内的脂质感应激酶，建立信号级联，将脂质从分解代谢途径转向合成代谢途径[4]。脂质组成的复杂性、多功能性等是决定生物膜甚至细胞本身特性的重要因素。线粒体、高尔基体、内质网等细胞器有着丰富的生物膜。因此，改变脂质性质会极大地影响生物膜的拓扑结构、空间组织甚至是整个细胞的生长增殖机制。除此之外，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的平衡对细胞的生理起着重要作用，过量饱和脂肪酸的积累会引起内质网应激[3]。细胞代谢需要的脂肪酸主要有两个来源，外源性脂肪酸通过膳食摄取的脂肪酸延长获得；内源性脂肪酸通过 DNL 获得。AC-CoA 是 DNL 所必需的原料，并且只能是糖代谢产生的 AC-CoA。线粒体柠檬酸转运蛋白在线粒体内与三羧酸循环中的 AC-CoA 结合为柠檬酸后，转移到胞质中，ACLY 蛋白再将胞质的柠檬酸分解为草酰乙酸和 AC-CoA，从而实现对葡萄糖产生的 AC-CoA 的利用[14]。
肿瘤细胞快速的增殖能力与其旺盛的脂质代谢密切相关。肿瘤细胞内丰富的脂质构成细胞膜及胞内细胞器的生物质膜，从而促进肿瘤细胞的增殖。其次，脂质也可以是信号传递的信使物质，为细胞代谢活动的通路网提供诸多可能。此外，肿瘤细胞中的脂质大多不能像正常细胞一样储存下来，而是分解供能[15]。
肿瘤患者恶病质的原因之一为肿瘤细胞的瓦博格效应，即肿瘤细胞即便在有氧环境下仍进行无氧酵解[16]，这种代谢方式消耗大量葡萄糖却生成极少的能量，其间生成的大量中间产物乳酸便通过乳酸反应途径生成葡萄糖，从而形成循环，或者生成谷氨酰胺间接为脂肪酸合成提供原料[17]。此外，临床研究[18]表明，结肠癌患者肠道来源的脂质原料摄取并不会减少，然而在肿瘤细胞中，即便外源性脂质的摄入也要通过一定的方式重新进入 DNL 途径才能被肿瘤细胞自身利用。
大多研究认为，肿瘤脂质合成的主要原料来源于糖代谢，但近年来研究[19-20]表明，胶质瘤、结肠癌等多种肿瘤细胞的主要碳来源是谷氨酰胺。在消耗 ATP 的基础上，ACLY 蛋白催化柠檬酸生成AC-CoA 和草酰乙酸，而 AC-CoA 可以参与脂肪酸和胆固醇合成，以及组蛋白乙酰化过程[21-22]。三羧酸循环产生的柠檬酸可以通过线粒体和核膜，作为细胞质和核内 ACLY 蛋白催化产生 AC-CoA 的底物[23-24]。细胞的脂肪酸来源分为外源性脂肪酸合成和内源性 DNL，而在肿瘤细胞中 DNL 源性的脂肪酸超过 90%[13]，因此 ACLY 蛋白作为 DNL 第一步反应的关键酶有重大的研究价值。既往研究[3, 7]中，大量数据证明，ACLY 基因在结肠癌组织和结肠癌细胞系细胞中的表达高于结肠癌癌旁组织和正常结肠细胞系。本研究应用慢病毒敲减了 HCT116 结肠癌细胞的 ACLY 基因，发现 HCT116 细胞在 ACLY 基因敲减后，胞内甘油三酯含量显著下降，迁移能力和晚期增殖能力下降，凋亡细胞比例显著增加。其中，细胞增殖能力在敲减后 24 h 和 48 h 变化不大，直到 120 h 才显著降低，意味着在肿瘤的早期，ACLY 基因并不是肿瘤细胞增殖的关键因素。在划痕实验中，细胞的迁移能力在 24 h 明显下降，表明 ACLY 基因在 HCT116 结肠癌细胞的迁移方面起着重要作用。此外，其胞内的甘油三酯含量下降意味着 ACLY 基因在调控结肠癌细胞生物学行为的同时还影响了其脂质代谢，甚至是通过调控结肠癌细胞的脂质代谢从而影响其生物学行为，这意味着 ACLY 基因是调控结肠癌细胞发生发展与代谢网络的重要基因。
综上所述，ACLY 基因通过调节结肠癌细胞的脂质合成从而影响着肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移等生物学行为，两者有望作为结肠癌个体化治疗的双重靶点，在基因、免疫、营养代谢治疗等方面均拥有重大前景，但其中的详细机制仍待进一步研究。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们无相互竞争的利益。
作者贡献声明：邱振东、邓文宏、洪育蒲和李满负责具体的实验设计、细胞实验的实施和论文撰写工作；余佳协助数据整理与论文修改；王卫星教授提出实验的研究思路并在论文撰写、修改过程中提出建议。
结肠癌是严重威胁人类健康的肿瘤疾病，其发病率和病死率居全球所有恶性肿瘤的第 3 位，于我国居第 2 位[1]。目前结肠癌的治疗手段仍是以手术为主，放化疗为辅，但由于结肠癌易转移与复发，治疗效果依旧有限。关于结肠癌的治疗，人们逐渐提出了肿瘤的代谢疗法并取得重大进展[2-3]，近年来更多的研究针对肿瘤的脂质代谢进行治疗[3]，并逐渐与免疫应答和临床营养相结合[4]。ATP 柠檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）是一种含有 1 101 个残基的多肽且具备多功能性的四聚体[5]。ACLY 催化依赖 ATP 和依赖辅酶 A 的柠檬酸转化为草酰乙酸酯和高能生物合成前体乙酰辅酶 A1，后者为关键的生化反应提供燃料，如合成脂肪酸、胆固醇和乙酰胆碱，以及组蛋白和蛋白的乙酰化[6]，且 ACLY 基因参与了肿瘤的脂质代谢。绝大多数正常的细胞主要通过摄取食物中的营养物质来利用外源性脂肪酸，因此与脂代谢相关的酶活性也比较低，而癌细胞内源性合成的脂肪酸却占 93%[7]。研究[8]证实，在不同类型肿瘤的早期阶段，参与脂肪酸合成的许多酶如ACLY、乙酰辅酶 A（acetyl coenzyme A，AC-CoA）羧化酶、脂肪酸合成酶等表达就已开始上调。一方面，瘤细胞的快速增殖需要大量的脂质供应，因磷脂和胆固醇构成生物膜的主要结构；另一方面，脂肪酸和甘油三酯提供了充足的能量底物；再者，脂质也被用作前体来合成一些激素和介导信号转导通路的第二信使。此外，研究还发现，脂肪酸的从头合成（de novo lipogenesis，DNL）对于血管生成至关重要[9]，这可能为肿瘤细胞的再生转移和表观遗传学的重编程提供了充分条件[10]，并有相关研究报道了 ACLY 能通过促进脂质相关蛋白的活性与核转位从而促进结肠癌转移[11]，这或许意味着肿瘤患者 ACLY 的低表达与良好预后相关[12]。不仅如此，癌细胞的 DNL 将相当数量的 NADPH 还原当量转化为 NADP+，从而通过作为电子受体促进细胞氧化还原平衡[13]。由于 ACLY 是细胞 DNL 的第一个关键酶，近年来的研究开始探讨其对肿瘤细胞生物学行为的影响，但目前关于 ACLY 在结肠癌中的脂质代谢作用研究较少。为进一步明确 ACLY 基因对结肠癌细胞脂质代谢的影响，本实验在敲减 ACLY 基因后，分析结肠癌细胞增殖、凋亡、迁移以及脂质代谢的变化，并对其机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和设备
胎牛血清购自美国 Gibco 公司，双抗购自澳洲 HyClone 公司，胰蛋白酶购自中国 Biosharp 公司，慢病毒相关试剂盒购自上海吉凯基因公司，CCK-8 试剂盒购自上海东仁化学科技有限公司，Annexin Ⅴ-PE/7-AAD 凋亡检测试剂盒购自美国 BD 公司，甘油三酯测试盒购自南京建成公司。本试验一抗均购自 Abcam 公司，荧光和化学发光二抗均购自武汉塞维尔公司。主要设备包括：倒置荧光显微镜（MicroPublisher 5.0 RTV，加拿大 QIMAGING 公司）和酶标仪（EnSight ，美国 Perkin Elmer 公司）。
1.2 细胞培养
结肠癌细胞株 HCT116 来源于中国科学院昆明细胞库，在 37 ℃、5% CO2、湿度为 95% 的培养箱内培养。完全培养基为含有 10% 胎牛血清及 1% 双抗的高糖 DMEM 培养基，每 2～3 天换液 1 次，待细胞生长密度达到 80% 时，以胰蛋白酶消化，根据实验需要进行传代培养，收集对数生长期细胞用于后续研究。
1.3 方法
1.3.1 细胞转染
收集对数生长期的细胞接种于6 孔板中，根据预实验测出的最适感染复数（MOI，本研究 MOI=10）转染细胞。转染操作按试剂盒说明书进行。细胞转染 72 h 后，根据预实验测出的嘌呤霉素浓度筛选稳转细胞系，于倒置荧光显微镜下观察转染效率，最终转染效果通过 Western blot 法检测 ACLY 蛋白的表达来鉴定。以敲减 ACLY 基因的 HCT116 细胞作为 ACLY 敲减组，以空载体转染细胞作为阴性对照组，以未经处理的结肠癌 HCT116 细胞作为空白对照组。
1.3.2 Western blot 法检测相关蛋白表达
收集各组细胞，提取细胞中总蛋白，利用 Western blot 方法检测 3 组细胞中 ACLY 蛋白和 GAPDH 蛋白的表达情况，用 Image J 软件计算的条带灰度值进行半定量。重复检测 3 次。
1.3.3 CCK-8 检测细胞增殖试验
细胞以每孔5 000 个细胞的密度接种于 96 孔板中，用完全培养基（含 10% 胎牛血清）培养 24、48 和 120 h，在指定的时间加入 CCK-8，然后 37 ℃ 避光 1 h。最后，使用酶标仪在 450 nm 处测定每个样品的吸光度（A）值。通过与未经处理的对照组进行比较，估计活细胞的百分比。每组设计 3 个复孔，重复检测 3 次。
1.3.4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力
将约 5×105 个细胞接种到 6 孔板中。当样本刚刚接触和融合时，用 10 mL 吸管尖端在单层细胞上划笔直的痕迹。在 0、8 和 24 h 时以倒置显微镜拍照，并通过 Image J 软件计算划痕间距与长度的比值。每组设计 3 个复孔。
1.3.5 细胞凋亡检测
采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞在指定条件下培养后，收集至流式管，以 Annexin Ⅴ-PE/7-AAD 凋亡检测试剂盒染色。采用流式细胞术检测凋亡细胞百分率，其中 Annexin Ⅴ-PE 阳性染色为早期凋亡细胞，7-AAD 阳性染色为晚期凋亡细胞，每组每次收集 1.5×104 个细胞。实验重复 3 次。
1.3.6 细胞脂质检测
细胞内总甘油三酯含量使用甘油三酯检测试剂盒，根据产品说明书用酶标仪检测。甘油三酯含量= ［（样本 A 值–空白 A 值）/（校准 A 值–空白 A 值）］×校准品浓度/待测样本蛋白浓度，其中甘油三酯含量单位为 mmol/gprot，校准品浓度单位为 mmol/L，待测样本蛋白浓度单位为 gprot/L。每个样本设计 3 个复孔。
2 结果
2.1 细胞转染和 ACLY 基因敲减效果
倒置荧光显微镜观察细胞转染后的绿色荧光蛋白（GFP）表达结果见图 1a–1d，可见细胞转染后 48 h 开始出现微弱荧光，72 h 后荧光强度趋于稳定，经筛选后（图 1d）荧光强度更为集中。Western blot 结果可见，ACLY 敲减组细胞中 ACLY 蛋白的表达水平低于阴性对照组和空白对照组（图 1e、1f）。
图1
示 HCT116 细胞的转染效果以及 3 组 HCT116 细胞的实验结果
a–d：HCT116 细胞转染慢病毒后 0 h（a）、48 h（b）和 72 h（c）以及嘌呤霉素筛选后（d）的细胞 GFP 表达（倒置荧光显微镜 ×100）；e、f：空白对照组、阴性对照组和 ACLY 敲减组细胞中 ACLY 蛋白表达的电泳结果（e）和半定量结果（f）；g：3 组 HCT116 细胞的存活率结果；h：空白对照组、阴性对照组和 ACLY 敲减组分别在 0、8 和 24 h 的细胞划痕结果（倒置荧光显微镜 ×40）；i：8 h 时 3 组细胞的迁移率结果；j：24 h 时 3 组细胞的迁移率结果；k：3 组细胞的总凋亡率结果；l–n：空白对照组（l）、阴性对照组（m）和 ACLY 敲减组（n）的流式细胞仪凋亡检测结果；o：3 组细胞的总甘油三酯含量结果
2.2 ACLY 基因敲减抑制肿瘤细胞的晚期增殖
CCK-8 检测 3 组 HCT116 细胞的存活率结果见图 1g，可见 24 h 和 48 h 时，ACLY 敲减组的细胞存活率稍下降，但与空白对照组和阴性对照组比较差异不大。但当细胞培养至 120 h 时，ACLY 敲减组的细胞存活率下降，较空白对照组和阴性对照组低。
2.3 ACLY 基因敲减抑制细胞的迁移能力
细胞划痕实验检测的 3 组 HCT116 细胞的迁移能力结果见图 1h。用 Image J 软件计算出每张划痕细胞间距与长度的比值后，以 0 h 为基准，分别计算8 h 和 24 h 时 3 组的 HCT116 细胞迁移率。结果显示，ACLY 敲减组细胞 8 h 时的迁移率无明显下降，与空白对照组和阴性对照组比较差异不大，见图 1i；在 24 h 时ACLY 敲减组的迁移率较空白对照组和阴性对照组低，见图 1j。
2.4 ACLY 基因敲减使细胞凋亡增加
流式细胞仪检测 3 组 HCT116 细胞的凋亡结果见图 1k–1n，可见 ACLY 敲减组 HCT116 细胞的总凋亡率明显升高，高于空白对照组和阴性对照组。
2.5 ACLY 基因敲减抑制细胞甘油三酯生成
ACLY 敲减组的 HCT116 细胞内甘油三酯含量低于空白对照组和阴性对照组，见图 1o。
3 讨论
在动物的正常细胞中，脂质合成的目标是将从营养物质中提取的碳转化为脂肪酸、胆固醇、磷酸甘油酯、二十烷类和鞘脂；脂质的获得主要是通过生长因子信号传导，然后直接摄取养分，刺激细胞内的脂质感应激酶，建立信号级联，将脂质从分解代谢途径转向合成代谢途径[4]。脂质组成的复杂性、多功能性等是决定生物膜甚至细胞本身特性的重要因素。线粒体、高尔基体、内质网等细胞器有着丰富的生物膜。因此，改变脂质性质会极大地影响生物膜的拓扑结构、空间组织甚至是整个细胞的生长增殖机制。除此之外，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的平衡对细胞的生理起着重要作用，过量饱和脂肪酸的积累会引起内质网应激[3]。细胞代谢需要的脂肪酸主要有两个来源，外源性脂肪酸通过膳食摄取的脂肪酸延长获得；内源性脂肪酸通过 DNL 获得。AC-CoA 是 DNL 所必需的原料，并且只能是糖代谢产生的 AC-CoA。线粒体柠檬酸转运蛋白在线粒体内与三羧酸循环中的 AC-CoA 结合为柠檬酸后，转移到胞质中，ACLY 蛋白再将胞质的柠檬酸分解为草酰乙酸和 AC-CoA，从而实现对葡萄糖产生的 AC-CoA 的利用[14]。
肿瘤细胞快速的增殖能力与其旺盛的脂质代谢密切相关。肿瘤细胞内丰富的脂质构成细胞膜及胞内细胞器的生物质膜，从而促进肿瘤细胞的增殖。其次，脂质也可以是信号传递的信使物质，为细胞代谢活动的通路网提供诸多可能。此外，肿瘤细胞中的脂质大多不能像正常细胞一样储存下来，而是分解供能[15]。
肿瘤患者恶病质的原因之一为肿瘤细胞的瓦博格效应，即肿瘤细胞即便在有氧环境下仍进行无氧酵解[16]，这种代谢方式消耗大量葡萄糖却生成极少的能量，其间生成的大量中间产物乳酸便通过乳酸反应途径生成葡萄糖，从而形成循环，或者生成谷氨酰胺间接为脂肪酸合成提供原料[17]。此外，临床研究[18]表明，结肠癌患者肠道来源的脂质原料摄取并不会减少，然而在肿瘤细胞中，即便外源性脂质的摄入也要通过一定的方式重新进入 DNL 途径才能被肿瘤细胞自身利用。
大多研究认为，肿瘤脂质合成的主要原料来源于糖代谢，但近年来研究[19-20]表明，胶质瘤、结肠癌等多种肿瘤细胞的主要碳来源是谷氨酰胺。在消耗 ATP 的基础上，ACLY 蛋白催化柠檬酸生成AC-CoA 和草酰乙酸，而 AC-CoA 可以参与脂肪酸和胆固醇合成，以及组蛋白乙酰化过程[21-22]。三羧酸循环产生的柠檬酸可以通过线粒体和核膜，作为细胞质和核内 ACLY 蛋白催化产生 AC-CoA 的底物[23-24]。细胞的脂肪酸来源分为外源性脂肪酸合成和内源性 DNL，而在肿瘤细胞中 DNL 源性的脂肪酸超过 90%[13]，因此 ACLY 蛋白作为 DNL 第一步反应的关键酶有重大的研究价值。既往研究[3, 7]中，大量数据证明，ACLY 基因在结肠癌组织和结肠癌细胞系细胞中的表达高于结肠癌癌旁组织和正常结肠细胞系。本研究应用慢病毒敲减了 HCT116 结肠癌细胞的 ACLY 基因，发现 HCT116 细胞在 ACLY 基因敲减后，胞内甘油三酯含量显著下降，迁移能力和晚期增殖能力下降，凋亡细胞比例显著增加。其中，细胞增殖能力在敲减后 24 h 和 48 h 变化不大，直到 120 h 才显著降低，意味着在肿瘤的早期，ACLY 基因并不是肿瘤细胞增殖的关键因素。在划痕实验中，细胞的迁移能力在 24 h 明显下降，表明 ACLY 基因在 HCT116 结肠癌细胞的迁移方面起着重要作用。此外，其胞内的甘油三酯含量下降意味着 ACLY 基因在调控结肠癌细胞生物学行为的同时还影响了其脂质代谢，甚至是通过调控结肠癌细胞的脂质代谢从而影响其生物学行为，这意味着 ACLY 基因是调控结肠癌细胞发生发展与代谢网络的重要基因。
综上所述，ACLY 基因通过调节结肠癌细胞的脂质合成从而影响着肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移等生物学行为，两者有望作为结肠癌个体化治疗的双重靶点，在基因、免疫、营养代谢治疗等方面均拥有重大前景，但其中的详细机制仍待进一步研究。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们无相互竞争的利益。
作者贡献声明：邱振东、邓文宏、洪育蒲和李满负责具体的实验设计、细胞实验的实施和论文撰写工作；余佳协助数据整理与论文修改；王卫星教授提出实验的研究思路并在论文撰写、修改过程中提出建议。
