引用本文： 杨香山, 程绍梅, 肖瑞雪, 张晶, 夏振, 王雪. Snail、N-cadherin在甲状腺乳头状癌中表达上调及其临床意义. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(2): 181-185. doi: 10.7507/1007-9424.20150050 复制
黏附分子N-钙黏蛋白（cadherin）参与细胞与细胞间或细胞与基质间结合，在正常组织中含量甚少，异常表达可引起癌变。锌指转录因子Snail可下调E-cadherin表达而上调N-cadherin的表达，进而参与上皮间质化的过程。本研究小组前期研究[1-2]表明，甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）和微小癌均可经淋巴结转移，然而转移机制目前未完全明了；同时Snail和N-cadherin在PTC中的表达以及诱导情况少见报道。故本研究通过检测Snail和N-cadherin在PTC组织和细胞株中的表达，进一步探讨二者的临床应用价值及意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集山东省医学科学院附属医院2010～2012年期间行PTC根治术的标本60例，其中男14例，女46例；年龄15～70岁，中位年龄40岁。无淋巴结转移15例，有淋巴结转移45例。同时取距离癌组织2～5 cm相应癌旁正常组织。全部标本均经病理检测证实为PTC；术前均无化疗、放疗及免疫治疗史。
1.2 主要试剂
小鼠抗人Snail、N-cadherin单克隆抗体，均购自Santa Cruz公司。SP试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗、多聚物辅助试剂与DAB，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。转化生长因子（TGF）-β1与DMEM培养基购自Sigma公司。PTC TPC-1细胞株购于中国科学院上海细胞库。BCA蛋白分析试剂盒及ECL试剂盒购自美国Pierce公司。
1.3 免疫组织化学SP法检测Snail和N-cadherin蛋白表达情况
采用免疫组织化学染色SP法，严格按试剂盒说明书进行操作。结果判断标准：以细胞膜或细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性表达。以染色强度和阳性细胞百分比的评分作为标准。染色强度评分：无染色计0分，淡黄色计1分，黄色计2分，棕黄色计3分；阳性细胞百分比评分：在低倍（×10）镜下随机选择10个视野，高倍（×40）镜下计数，每个视野计数100个癌细胞，并计算阳性细胞百分数，结果取10个视野的平均百分数，其中无阳性细胞计0分，阳性细胞< 25%计1分，阳性细胞25%～50%计2分，阳性细胞> 50%计3分。以染色强度与阳性细胞百分比评分的乘积表示Snail、N-cadherin的表达强度：0分为（-），1～3分为（+），4～6分为（++），7～9分为（+++）。总体评价< 4分者为Snail、N-cadherin阴性表达，≥4分者为Snail、N-cadherin阳性表达。
1.4 细胞培养
取TPC-1细胞株，用含15%胎牛血清、105 U/ L青霉素、100 g/L链霉素的DMEM培养基于37℃、95%湿度、5% CO2条件下进行培养，每3 d进行换液，用作实验。实验分组：①TGF-β1刺激组，TPC-1细胞（1×106个/mL）用含50 ng/mL TGF-β1的无血清培养基培养24 h后检测Snail、N-cadherin的表达水平；②无血清对照组，TPC-1细胞（1×106个/mL）用含与①等量的无血清培养基培养24 h后检测Snail、N-cadherin的表达水平。
1.5 Western blot法检测Snail和N-cadherin蛋白表达
按常规方法分别提取淋巴结转移和无淋巴结转移的PTC癌组织与TPC-1细胞总蛋白，BCA蛋白定量后，每道加入30μg蛋白，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉TBST溶液封闭后加入小鼠抗人Snail、N-cadherin单克隆抗体（均为1∶500），4℃过夜。BST溶液洗膜，β-actin作为内参，加入辣根过氧化物酶结合的二抗。ECL化学发光试剂盒检测。Quantity One分析蛋白条带灰度值。以目的条带灰度值与对应的β-actin灰度值之比作为蛋白表达水平的半定量结果。
1.6 统计学方法
应用SPSS 13.0统计软件分析，分类资料采用卡方检验，采用Spearman行相关性分析，检验水准α=0.01。
2 结果
2.1 Snail和N-cadherin在PTC组织中的表达情况
60例PTC癌旁正常组织中Snail和N-cadherin表达均为阴性（图 1）。Snail在51例PTC癌组织中阳性表达，主要表达于细胞核与细胞质中（图 2A）。其中（++）者21例，（+++）者30例，阳性率为85.0%，明显高于其在PTC相应癌旁正常组织中的表达（0，P < 0.01）。N-cadherin在47例PTC癌组织中阳性表达，主要表达于细胞质和细胞膜（图 2B）。其中（++）16例，（+++）31例，阳性率为78.3%，明显高于其在PTC相应癌旁正常组织中的表达（0，P < 0.01）。
图1
Snail和N-cadherin在PTC癌旁正常组织中的阴性表达（SP×200）。1A：Snail；1B：N-cadherin 图 2 Snail和N-cadherin在PTC癌组织中的表达（SP×400）。2A：Snail，呈阳性表达于细胞核与细胞质；2B：N-cadherin，呈阳性表达于细胞质与细胞膜
2.2 Western blot检测Snail和N-cadherin蛋白在PTC组织与相应癌旁正常组织中的表达
Western blot检测的定性结果见图 3A，半定量结果见图 3B。结果显示，Snail和N-cadherin蛋白在PTC癌组织中的蛋白表达水平均高于相应癌旁正常组织，差异有统计学意义（P < 0.001，P < 0.001）；Snail和N-cadherin蛋白在PTC有淋巴结转移癌组织中蛋白表达水平均明显高于无淋巴结转移组织中蛋白表达水平，差异亦有统计学意义（P < 0.001，P < 0.001）。
图3
Western blot法检测Snail和N-cadherin在PTC癌旁正常组织、无淋巴结转移癌组织及有淋巴结转移癌组织中的表达情况。3A：定性结果。3B：半定量结果。与癌旁正常组织比较，* P < 0.001；与无淋巴结转移癌组织比较，△P < 0.001
2.3 Snail和N-cadherin在PTC细胞株TPC-1中的表达与调节
Western blot结果显示，PTC细胞株TPC-1在无血清培养基DMEM中可正常组成性表达Snail与N-cadherin蛋白；然而，在TGF-β1（50 ng/mL）诱导后TPC-1中的Snail与N-cadherin蛋白表达量相对于无血清对照组分别升高2.6倍、2.1倍，差异均有统计学意义（P < 0.001，P < 0.001）。见图 4A、4B。
图4
Western blot法检测Snail和N-cadherin在PTC细胞株TPC-1无血清对照组与TGF-β1刺激组中蛋白的表达情况。4A：定性结果。4B：半定量结果。与无血清对照组比较，* P < 0.001
2.4 Snail和N-cadherin蛋白阳性表达与PTC患者临床病理特征的关系
Snail和N-cadherin在PTC癌组织中的表达与患者的性别、年龄及肿瘤大小均无关（P > 0.01）。Snail和N-cadherin在淋巴结有转移的PTC癌组织中的表达阳性率均明显高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表 1。
表1
Snail和N-cadherin在PTC癌组织中的表达与PTC患者临床病理特征的关系（例）
2.5 Snail和N-cadherin在PTC癌组织中表达的相关性分析结果
Spearman相关性分析发现，Snail和N-cadherin在PTC癌组织中的表达呈正相关性（rs=0.721，P < 0.001），见表 2。
表2
Snail和N-cadherin在PTC癌组织中表达的相关性分析结果（例）
3 讨论
转录因子Snail属于Snail家族中的一员，其他成员主要包括ZEB1、Slug、SIP1g等[3]。Snail家族成员的分子结构极为相似但结构较为特殊，其-COOH末端表现为高度保守，而-NH2末端则结构多变。有研究[4]发现，Snail基因在胰腺癌组织中的表达与癌细胞的形态学变化有关，提示Snail在上皮间质化转变中有一定的作用。本研究结果发现，Snail在PTC癌组织中的表达阳性率为85.0%，明显高于癌周正常组织（0），并且Snail在PTC癌组织中的蛋白表达与PTC的淋巴结转移有关，结果提示Snail在PTC转移中起一定作用。
黏附素cadherin家族的主要成分为单链跨膜糖蛋白，成员间的结构和功能亦具有共同点。根据组织来源，cadherin被分为3类：上皮（E）、神经（N）及胎盘（P）[5]。已有文献[6]报道，E-cadherin可与β-catenin相互作用，结合为cadherin/catenin复合物，以此维持上皮细胞的结构与功能；同时，E-cadherin的下调则参与上皮间质转化、肿瘤细胞浸润转移[7]；然而N-cadherin上调可能与肿瘤转移关系最密切。在病理情况下，N-cadherin的上调可影响纤维生长因子受体的内化进而维持生长因子的信号传导[8]，导致细胞黏附性减小并易发生淋巴道转移[9-11]。提示N-cadherin影响了PTC细胞间或与基质间的黏附作用，促使癌细胞组织浸润和淋巴结转移。本研究对N-cadherin的研究结果发现，N-cadherin蛋白在PTC癌组织中的表达阳性率为78.3%，明显高于其在癌周正常组织中的表达（0），并且有淋巴转移的患者中N-cadherin蛋白表达阳性率明显高于无淋巴结转移者（P < 0.01），结果提示，N-cadherin与PTC的淋巴结转移有密切的关系。也有研究认为，PTC细胞增殖较快而压迫腺体周围血管导致乏氧[12-14]，乏氧可增强间质化相关因子（N-cadherin、Snail、TGF）的表达[15]。
在其他肿瘤的研究中证明，Snail可通过直接抑制E-cadherin的转录进而减弱癌细胞间黏附特性[16]，从而导致乳腺癌的浸润转移[17]。有关机制研究[18-19]表明，Snail分子的锌指结构域与E-cadherin基因中的CANNTG序列直接结合，继而阻止E-cadherin的转录，同时Snail亦调节了N-cadherin的转录。另外，我们进一步从细胞蛋白水平验证Snail与N-cadherin可在PTC组织与细胞株TPC-1中表达且与淋巴结转移相关，同时在细胞株TPC-1中，Snail与N-cadherin可被TGF-β1诱导上调。以上研究结果提示，Snail与N-cadherin在上皮间质化中起重要作用以及在肿瘤发生与转移中的重要意义[20-21]。
综上所述，在PTC的发生、发展中，Snail和N-cadherin表达上调促进了PTC浸润和转移，二者的结合对于诊断PTC的早期转移及开发更具特异性的治疗药物可能具有重要意义。
黏附分子N-钙黏蛋白（cadherin）参与细胞与细胞间或细胞与基质间结合，在正常组织中含量甚少，异常表达可引起癌变。锌指转录因子Snail可下调E-cadherin表达而上调N-cadherin的表达，进而参与上皮间质化的过程。本研究小组前期研究[1-2]表明，甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）和微小癌均可经淋巴结转移，然而转移机制目前未完全明了；同时Snail和N-cadherin在PTC中的表达以及诱导情况少见报道。故本研究通过检测Snail和N-cadherin在PTC组织和细胞株中的表达，进一步探讨二者的临床应用价值及意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集山东省医学科学院附属医院2010～2012年期间行PTC根治术的标本60例，其中男14例，女46例；年龄15～70岁，中位年龄40岁。无淋巴结转移15例，有淋巴结转移45例。同时取距离癌组织2～5 cm相应癌旁正常组织。全部标本均经病理检测证实为PTC；术前均无化疗、放疗及免疫治疗史。
1.2 主要试剂
小鼠抗人Snail、N-cadherin单克隆抗体，均购自Santa Cruz公司。SP试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗、多聚物辅助试剂与DAB，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。转化生长因子（TGF）-β1与DMEM培养基购自Sigma公司。PTC TPC-1细胞株购于中国科学院上海细胞库。BCA蛋白分析试剂盒及ECL试剂盒购自美国Pierce公司。
1.3 免疫组织化学SP法检测Snail和N-cadherin蛋白表达情况
采用免疫组织化学染色SP法，严格按试剂盒说明书进行操作。结果判断标准：以细胞膜或细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性表达。以染色强度和阳性细胞百分比的评分作为标准。染色强度评分：无染色计0分，淡黄色计1分，黄色计2分，棕黄色计3分；阳性细胞百分比评分：在低倍（×10）镜下随机选择10个视野，高倍（×40）镜下计数，每个视野计数100个癌细胞，并计算阳性细胞百分数，结果取10个视野的平均百分数，其中无阳性细胞计0分，阳性细胞< 25%计1分，阳性细胞25%～50%计2分，阳性细胞> 50%计3分。以染色强度与阳性细胞百分比评分的乘积表示Snail、N-cadherin的表达强度：0分为（-），1～3分为（+），4～6分为（++），7～9分为（+++）。总体评价< 4分者为Snail、N-cadherin阴性表达，≥4分者为Snail、N-cadherin阳性表达。
1.4 细胞培养
取TPC-1细胞株，用含15%胎牛血清、105 U/ L青霉素、100 g/L链霉素的DMEM培养基于37℃、95%湿度、5% CO2条件下进行培养，每3 d进行换液，用作实验。实验分组：①TGF-β1刺激组，TPC-1细胞（1×106个/mL）用含50 ng/mL TGF-β1的无血清培养基培养24 h后检测Snail、N-cadherin的表达水平；②无血清对照组，TPC-1细胞（1×106个/mL）用含与①等量的无血清培养基培养24 h后检测Snail、N-cadherin的表达水平。
1.5 Western blot法检测Snail和N-cadherin蛋白表达
按常规方法分别提取淋巴结转移和无淋巴结转移的PTC癌组织与TPC-1细胞总蛋白，BCA蛋白定量后，每道加入30μg蛋白，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉TBST溶液封闭后加入小鼠抗人Snail、N-cadherin单克隆抗体（均为1∶500），4℃过夜。BST溶液洗膜，β-actin作为内参，加入辣根过氧化物酶结合的二抗。ECL化学发光试剂盒检测。Quantity One分析蛋白条带灰度值。以目的条带灰度值与对应的β-actin灰度值之比作为蛋白表达水平的半定量结果。
1.6 统计学方法
应用SPSS 13.0统计软件分析，分类资料采用卡方检验，采用Spearman行相关性分析，检验水准α=0.01。
2 结果
2.1 Snail和N-cadherin在PTC组织中的表达情况
60例PTC癌旁正常组织中Snail和N-cadherin表达均为阴性（图 1）。Snail在51例PTC癌组织中阳性表达，主要表达于细胞核与细胞质中（图 2A）。其中（++）者21例，（+++）者30例，阳性率为85.0%，明显高于其在PTC相应癌旁正常组织中的表达（0，P < 0.01）。N-cadherin在47例PTC癌组织中阳性表达，主要表达于细胞质和细胞膜（图 2B）。其中（++）16例，（+++）31例，阳性率为78.3%，明显高于其在PTC相应癌旁正常组织中的表达（0，P < 0.01）。
图1
Snail和N-cadherin在PTC癌旁正常组织中的阴性表达（SP×200）。1A：Snail；1B：N-cadherin 图 2 Snail和N-cadherin在PTC癌组织中的表达（SP×400）。2A：Snail，呈阳性表达于细胞核与细胞质；2B：N-cadherin，呈阳性表达于细胞质与细胞膜
2.2 Western blot检测Snail和N-cadherin蛋白在PTC组织与相应癌旁正常组织中的表达
Western blot检测的定性结果见图 3A，半定量结果见图 3B。结果显示，Snail和N-cadherin蛋白在PTC癌组织中的蛋白表达水平均高于相应癌旁正常组织，差异有统计学意义（P < 0.001，P < 0.001）；Snail和N-cadherin蛋白在PTC有淋巴结转移癌组织中蛋白表达水平均明显高于无淋巴结转移组织中蛋白表达水平，差异亦有统计学意义（P < 0.001，P < 0.001）。
图3
Western blot法检测Snail和N-cadherin在PTC癌旁正常组织、无淋巴结转移癌组织及有淋巴结转移癌组织中的表达情况。3A：定性结果。3B：半定量结果。与癌旁正常组织比较，* P < 0.001；与无淋巴结转移癌组织比较，△P < 0.001
2.3 Snail和N-cadherin在PTC细胞株TPC-1中的表达与调节
Western blot结果显示，PTC细胞株TPC-1在无血清培养基DMEM中可正常组成性表达Snail与N-cadherin蛋白；然而，在TGF-β1（50 ng/mL）诱导后TPC-1中的Snail与N-cadherin蛋白表达量相对于无血清对照组分别升高2.6倍、2.1倍，差异均有统计学意义（P < 0.001，P < 0.001）。见图 4A、4B。
图4
Western blot法检测Snail和N-cadherin在PTC细胞株TPC-1无血清对照组与TGF-β1刺激组中蛋白的表达情况。4A：定性结果。4B：半定量结果。与无血清对照组比较，* P < 0.001
2.4 Snail和N-cadherin蛋白阳性表达与PTC患者临床病理特征的关系
Snail和N-cadherin在PTC癌组织中的表达与患者的性别、年龄及肿瘤大小均无关（P > 0.01）。Snail和N-cadherin在淋巴结有转移的PTC癌组织中的表达阳性率均明显高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表 1。
表1
Snail和N-cadherin在PTC癌组织中的表达与PTC患者临床病理特征的关系（例）
2.5 Snail和N-cadherin在PTC癌组织中表达的相关性分析结果
Spearman相关性分析发现，Snail和N-cadherin在PTC癌组织中的表达呈正相关性（rs=0.721，P < 0.001），见表 2。
表2
Snail和N-cadherin在PTC癌组织中表达的相关性分析结果（例）
3 讨论
转录因子Snail属于Snail家族中的一员，其他成员主要包括ZEB1、Slug、SIP1g等[3]。Snail家族成员的分子结构极为相似但结构较为特殊，其-COOH末端表现为高度保守，而-NH2末端则结构多变。有研究[4]发现，Snail基因在胰腺癌组织中的表达与癌细胞的形态学变化有关，提示Snail在上皮间质化转变中有一定的作用。本研究结果发现，Snail在PTC癌组织中的表达阳性率为85.0%，明显高于癌周正常组织（0），并且Snail在PTC癌组织中的蛋白表达与PTC的淋巴结转移有关，结果提示Snail在PTC转移中起一定作用。
黏附素cadherin家族的主要成分为单链跨膜糖蛋白，成员间的结构和功能亦具有共同点。根据组织来源，cadherin被分为3类：上皮（E）、神经（N）及胎盘（P）[5]。已有文献[6]报道，E-cadherin可与β-catenin相互作用，结合为cadherin/catenin复合物，以此维持上皮细胞的结构与功能；同时，E-cadherin的下调则参与上皮间质转化、肿瘤细胞浸润转移[7]；然而N-cadherin上调可能与肿瘤转移关系最密切。在病理情况下，N-cadherin的上调可影响纤维生长因子受体的内化进而维持生长因子的信号传导[8]，导致细胞黏附性减小并易发生淋巴道转移[9-11]。提示N-cadherin影响了PTC细胞间或与基质间的黏附作用，促使癌细胞组织浸润和淋巴结转移。本研究对N-cadherin的研究结果发现，N-cadherin蛋白在PTC癌组织中的表达阳性率为78.3%，明显高于其在癌周正常组织中的表达（0），并且有淋巴转移的患者中N-cadherin蛋白表达阳性率明显高于无淋巴结转移者（P < 0.01），结果提示，N-cadherin与PTC的淋巴结转移有密切的关系。也有研究认为，PTC细胞增殖较快而压迫腺体周围血管导致乏氧[12-14]，乏氧可增强间质化相关因子（N-cadherin、Snail、TGF）的表达[15]。
在其他肿瘤的研究中证明，Snail可通过直接抑制E-cadherin的转录进而减弱癌细胞间黏附特性[16]，从而导致乳腺癌的浸润转移[17]。有关机制研究[18-19]表明，Snail分子的锌指结构域与E-cadherin基因中的CANNTG序列直接结合，继而阻止E-cadherin的转录，同时Snail亦调节了N-cadherin的转录。另外，我们进一步从细胞蛋白水平验证Snail与N-cadherin可在PTC组织与细胞株TPC-1中表达且与淋巴结转移相关，同时在细胞株TPC-1中，Snail与N-cadherin可被TGF-β1诱导上调。以上研究结果提示，Snail与N-cadherin在上皮间质化中起重要作用以及在肿瘤发生与转移中的重要意义[20-21]。
综上所述，在PTC的发生、发展中，Snail和N-cadherin表达上调促进了PTC浸润和转移，二者的结合对于诊断PTC的早期转移及开发更具特异性的治疗药物可能具有重要意义。
