引用本文： 高尚, 唐康来, 张吉强, 杨志金, 崔海峰, 李跑, 唐红, 周梅. 循环牵拉对大鼠跟腱来源肌腱干细胞c-fos基因表达的影响. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(1): 85-90. doi: 10.7507/1002-1892.201609014 复制
肌腱病是最常见的运动损伤性疾病，临床表现为疼痛和炎性反应，目前认为重复过度使用引起肌腱渐进性退变是导致该病的主要原因[1-2]。肌腱病的组织发生大量异位骨化和脂肪化，但发生机制尚不明确。2007 年 Bi 等[3]发现了存在于肌腱中的肌腱干细胞（tendon stem cells，TSCs），研究表明 TSCs 是肌腱细胞的重要前体细胞，具有多向分化潜能[4-5]，在适度牵拉条件下向成腱方向分化，而在过度牵拉条件下向成骨、成脂肪等非腱性方向分化[6]。肌腱病组织的异常表现可能与 TSCs 的异常分化有关，这为研究肌腱病的发病机制提供了新思路，也使得研究机械牵拉刺激对细胞基因表达的影响显得尤为重要。
立早基因是细胞经外部刺激后最先表达的一组基因，是联系细胞生化改变与细胞最终对刺激发生特异性反应的中介物，因此又被认为是第三信使[7]。其中 c-fos 基因是即刻早期基因家族成员之一，含 3.5 kb 碱基的 DNA 序列，由 4 个外显子和 3 个内含子组成，可转录为 2.2 kb 碱基的成熟 mRNA。在肌腱愈合过程中，c-fos 可能参与激活再生反应、刺激生成Ⅰ型胶原蛋白[8]。同时，c-fos 转录的上调已被证实是机械刺激转录反应中较早的环节，它可能在根本上导致了负荷相关的细胞基质重塑[9]。在心肌细胞[10]、肌细胞[11]、内皮细胞[12]、成骨细胞[13-14]和骨母细胞[15]等多种细胞中均存在机械刺激后 c-fos 基因的早期表达。然而，机械牵拉刺激对 TSCs 的c-fos 表达影响尚不清楚。为此，本实验采用自行设计的体外细胞单轴循环牵伸载荷模型[16]，对 TSCs 进行不同条件的牵伸刺激，探讨牵伸对 c-fos 基因表达的影响，以期为肌腱病发病机制研究及治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
8 周龄雄性 SD 大鼠 3 只，体质量 200～250 g，由第三军医大学实验动物中心提供。
DMEM 培养基、胰蛋白酶（HyClone公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；纤连蛋白、分散酶、Ⅰ型胶原酶、中性蛋白酶（Sigma 公司，美国）；RNAiso Plus 试剂盒、PrimeScript 逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅲ（Takara公司，日本）。iCycler 荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）。微沟槽硅树脂细胞培养皿由本科室自制。
细胞牵拉器由本科室自行研制[16]，包括机械部分和电子控制部分，通过电子控制部分控制机械部分驱动硅树脂细胞培养皿支架做往复运动，从而使贴附于培养皿表面的细胞获得体外机械牵拉。不同牵拉应变量以牵拉位移距离表示[1]。
1.2 TSCs的提取、培养和传代
大鼠跟腱来源 TSCs 分离及培养参照 Rui 等[17]和胡超等[18]的方法。取 3 只 SD 大鼠，CO2处死后取出双侧跟腱，剔除腱鞘及腱周结缔组织，只取中间部分的屈肌腱。将肌腱均匀剪碎成 1 mm×1 mm 大小，加入 2 mL 消化液（含 3 mg/mL Ⅰ型胶原酶和 4 mg/mL 中性蛋白酶），37℃ 孵箱消化 1.5 h。加入含 15%FBS 的DMEM 培养基 2 mL 中止消化后，以离心半径 10 cm、1 000 r/min 离心 8 min。用含 15%FBS 的 DMEM 培养基4 mL 悬浮，连同可能未消化完全的肌腱残留组织直接种于培养皿中，加入含10%FBS的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2温箱中孵育。4～5 d 后换液，培养 8～10 d，可观察到原代细胞长满。细胞扩增后，取第 3 代用于相关实验。TSCs的鉴定按本课题组胡超等[18]的方法进行。
1.3 实验方法
将表面光滑的硅树脂培养皿消毒后烘干备用。用纤连蛋白处理培养皿表面后，将 5×105 个第 3 代 TSCs 接种于硅树脂培养皿。接种 24 h 后，倒置相差显微镜观察 TSCs 贴壁生长情况，观察有无细胞脱落及漂浮。体外细胞牵拉器频率设置为 1 Hz，整个牵拉过程均在 37℃、5%CO2 孵箱中进行。
1.3.1 c-fos mRNA 相对表达量随牵拉时间的变化 分别用 4% 和 8% 牵拉强度牵拉细胞，并在牵拉 0、5、15、30、60、120 min 后收集细胞进行实时荧光定量 PCR 检测，观察 c-fos mRNA 相对表达量随牵拉时间的变化，并找到表达最高时间点（Tmax）。
1.3.2 c-fos mRNA 相对表达量随牵拉强度的变化 分别用 0、2%、4%、6%、8%和12% 的牵拉强度，在牵拉 Tmax 后收集细胞，观察 c-fos mRNA 相对表达量随牵拉强度的变化。
1.3.3 c-fos mRNA 相对表达量经短时刺激后的变化 分别用 2%、4%、6%、8% 和 12% 的牵拉强度，对 TSCs 分别经 0、5、15 min 短时间牵拉后静置至 Tmax，观察 c-fos mRNA 相对表达量经短时刺激后的变化情况。
1.3.4 TSCs 分化标志基因相对表达量随牵拉强度和牵拉时间的变化 分别用 4% 和 8% 牵拉强度牵拉细胞，并在牵拉 0、Tmax、120 min 后收集细胞，检测细胞分化标志基因的相对表达量。
1.3.5 实时荧光定量 PCR 检测方法 使用 RNaiso Plus 试剂盒提取细胞总 RNA，并逆转录为 cDNA。检测 c-fos，成肌腱分化标志基因Ⅰ型胶原、腱调蛋白（tenomodulin，TNMD），成骨分化标志基因 Runx2、远端缺失基因 5（distal-less homeobox 5，Dlx5），成脂肪分化标志基因脂肪酸结合蛋白 4（fatty acid binding protein 4，FABP4）等基于表达，以 GAPDH 作为内参。各基因引物序列：c-fos 上游 5'-CTACTACCATTCCCCAGCCG-3'，下游 5'-CTCCCGCTCTGGCGTAAG-3'；Ⅰ型胶原上游 5'-TGGTGAGACGTGGAAACCTG-3'，下游 5'-CTTGGGTCCCTCGACTCCTA-3'；TNMD 上游 5'-GCGACAATGTGACTATGTAC-3'，下游 5'-GTCTTCTCCACCTTCACTTG-3'；Runx2 上游 5'-GAACTCAGCACCAAGTCCTTT-3'，下游 5'-TGGCATCTACGGCACTCTA-3'；Dlx5 上游 5'-CTTATGCGGACTACGGCTACG-3'，下游 5'-CCTGGGTTTACGAACTTTCTTTG-3'；FABP4 上游5'-CGAGATTTCCTTCAAACTGGG-3'，下游 5'-TCTTGTAGAAGTCACGCCTTTC-3'；GAPDH 上游5'-TGACTTCAACAGCAACTC-3'，下游 5'-TGTAGCCATATTCATTGTCA-3'。PCR 反应条件：95℃ 预变性 8 min；95℃ 变性 10 s、60℃ 退火 20 s、72℃ 延伸 25 s，40 个循环。溶解曲线分析为 55～95℃，0.5℃/15 s。采用 2-ΔΔCt法分析目的基因相对表达量，所有实验均重复 3 次。
1.4 统计学方法
采用 GraphPad Prism 6.01 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用多因素方差分析，两两比较采用 Tukey 法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 c-fos mRNA相对表达量随牵拉时间的变化
与 0 min 相比，在 4% 和 8% 牵拉强度下，c-fos mRNA 相对表达量均在牵拉 15 min 时显著升高，牵拉 30 min 时达峰值，差异均有统计学意义（P<0.05）；牵拉至 60 min时c-fos mRNA 相对表达量恢复至起始水平，与 0 min 比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1。因此Tmax 为 30 min。
2.2 c-fos mRNA相对表达量随牵拉强度的变化
牵拉 30 min 条件下，与牵拉强度 0 比较，2%、4%、6%、8% 和 12% 牵拉强度下 c-fos mRNA 相对表达量均显著升高，且 6%、8% 和 12% 牵拉强度较 2%、4% 牵拉强度进一步升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；2%、4% 间及6%、8%、12% 间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
2.3 c-fos mRNA相对表达量经短时刺激后的变化
各牵拉强度下仅牵拉 5 min c-fos mRNA 相对表达量即有明显升高，与 0 min 比较差异均有统计学意义（P<0.05）；继续牵拉至 15 min和静置至 30 min，c-fos mRNA 相对表达量进一步升高，与牵拉 5 min 时比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
2.4 TSCs分化标志基因相对表达量随牵拉强度和牵拉时间的变化
与 0 min 相比，4% 牵拉强度下，在牵拉 30 min 和 120 min 时，各分化标志基因相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。而 8% 牵拉强度下，在牵拉 30 min 时，Runx2 基因相对表达量显著升高，在牵拉 120 min 时，Ⅰ型胶原、TNMD、Dlx5、Runx2 基因相对表达量均升高，差异均有统计学意义（P>0.05）；FABP4 基因相对表达量在牵拉 30 min 和 120 min 时，与0 min比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 4。
图1
不同牵拉强度下牵拉不同时间c-fos mRNA相对表达量
Figure1.
The relative expressions of c-fos mRNA at different time points under different stretch intensities
图2
不同牵拉强度牵拉30 min c-fos mRNA相对表达量
Figure2.
The relative expressions of c-fos mRNA under different stretch intensities at 30 minutes
图3
不同牵拉强度经0、5、15 min短时间牵拉后静置至30 min c-fos mRNA相对表达量
Figure3.
The relative expressions of c-fos mRNA under different stretch intensities for 0, 5, and 15 minutes and followed by incubation at relax status up to 30 minutes
图4
不同牵拉强度下经0、30、120 min牵拉后TSCs分化标志基因相对表达量 a.Ⅰ型胶原；b. TNMD；c. Dlx5；d. Runx2；e. FABP4
Figure4.
The relative expressions of differentiation related genes mRNA under different stretch intensities at 0, 30, or 120 minutes a. Collagen type I; b. TNMD; c. Dlx5; d. Runx2; e. FABP4
3 讨论
肌腱在运动过程中经过反复牵拉，使TSCs在轴向上发生形变。在过度反复牵拉过程中，可能由于损伤与修复的失衡而导致肌腱微损伤进行性加重，从而导致肌腱病，严重时甚至出现肌腱断裂，这在运动员中很常见。由此可见，牵拉作用于肌腱后，在一定条件下具有损害效应。然而，对于已产生肌腱病的运动员或肌腱手术后的患者，采取肌腱牵拉运动却能改善预后，加快肌腱恢复速度[19]。这说明牵拉应力对于肌腱的影响取决于牵拉方式，以及牵拉强度、时间等一系列因素。
已有多项研究证实，许多种类的细胞在经过机械牵拉刺激后，其立早基因（如 c-fos、c-jun、Egr-1、c-myc 等）能够快速表达，其中 c-fos 表达的研究较为广泛[20]。然而，对于同样经受牵拉应力的 TSCs，c-fos 的表达情况尚未见报道。因此，本实验通过自制体外细胞单轴循环牵拉载荷模型对 TSCs 的牵拉，观察 c-fos 的早期表达，对进一步研究机械信号-基因信号耦联机制具有重要意义。
Zhang 等[6]的研究表明，4% 和8% 体外细胞牵拉强度对 TSCs 的分化分别具有腱向分化和非腱向分化作用。因此，我们首先利用 4% 和 8% 的牵拉强度对 TSCs 进行多时间点牵拉观察。结果发现在机械牵拉 15 min 后 c-fos mRNA 相对表达量显著上升，在 30 min 时达峰值。继续牵拉后 c-fos mRNA 相对表达量骤降，于 60 min 后回到最初水平。c-fos mRNA 相对表达量在牵拉过程中骤降可能与 mRNA 分子的多聚 A 尾被酶降解有关[20]。
通过以上实验发现，在牵拉 30 min 时c-fos mRNA 相对表达量达最大。因此，我们通过 2%~12% 的牵拉强度牵拉30 min，研究牵拉强度与 c-fos 表达的关系。之所以选择此牵拉强度范围是由于肌腱根据应力-应变曲线，2% 牵拉强度时肌腱纤维开始伸直，至 12% 时已对肌腱纤维产生明显损伤作用[21]。实验结果显示，2% 的牵拉强度即可使 c-fos mRNA 相对表达量升高，并且与 4% 牵拉强度无明显差异；而 6% 牵拉强度时其表达量进一步升高，并且与 8%、12% 牵拉强度无明显差异。这表明 c-fos mRNA 的表达具有一定牵伸强度依赖性。
为了检测短时间牵拉后 c-fos 基因的表达，我们将细胞分别在各牵拉强度下牵拉 5、15 min，然后静置孵育至 30 min。结果发现仅牵伸 5 min，c-fos 即可得到表达。这与既往研究报道的持续牵拉心肌细胞[22]或子宫平滑肌细胞[20]1 min 即可引起 c-fos mRNA 的表达相似。表明 TSCs 对刺激的反应非常敏感，极短时间的牵拉刺激即可引起 c-fos 表达，从而引发其下游的链式反应。同时，我们也发现 c-fos 的转录完成需要数分钟时间，因为在 4% 和 8% 牵拉强度下，牵拉 5 min 时立即检测，c-fos mRNA 相对表达量与 0 min时无统计学差异；但牵拉 5 min，静置孵育至 30 min时，c-fos mRNA 相对表达量较 0 min 显著增加。
最后我们检测了 4% 和 8% 牵拉强度下 TSCs 分化标志基因的转录情况。结果发现 8% 牵拉强度下，经过 120 min 刺激后，大部分标志基因的表达量明显升高，而 4% 牵拉强度在 120 min 牵拉下各指标与 0 min 相比无统计学差异。进一步表明了不同牵拉强度不仅在长时间作用后对 TSCs 的分化产生不同影响，还可能在牵拉早期已对不同基因的表达产生了不同作用。
综上述，不同牵拉强度对 TSCs 分化方向具有不同影响，并且起着非常重要的作用。通过对 TSCs 立早基因 c-fos 表达的研究表明，在牵拉初期，牵拉强度、时间已对细胞产生了不同影响，可能进一步影响了 TSCs 的分化方向。本研究仅研究了短时间牵拉效果，考虑到不同蛋白组装的时间差异，检测仅在基因层面进行，在排除其他干扰条件后 c-fos 对下游各分化基因的影响还有待进一步研究。
肌腱病是最常见的运动损伤性疾病，临床表现为疼痛和炎性反应，目前认为重复过度使用引起肌腱渐进性退变是导致该病的主要原因[1-2]。肌腱病的组织发生大量异位骨化和脂肪化，但发生机制尚不明确。2007 年 Bi 等[3]发现了存在于肌腱中的肌腱干细胞（tendon stem cells，TSCs），研究表明 TSCs 是肌腱细胞的重要前体细胞，具有多向分化潜能[4-5]，在适度牵拉条件下向成腱方向分化，而在过度牵拉条件下向成骨、成脂肪等非腱性方向分化[6]。肌腱病组织的异常表现可能与 TSCs 的异常分化有关，这为研究肌腱病的发病机制提供了新思路，也使得研究机械牵拉刺激对细胞基因表达的影响显得尤为重要。
立早基因是细胞经外部刺激后最先表达的一组基因，是联系细胞生化改变与细胞最终对刺激发生特异性反应的中介物，因此又被认为是第三信使[7]。其中 c-fos 基因是即刻早期基因家族成员之一，含 3.5 kb 碱基的 DNA 序列，由 4 个外显子和 3 个内含子组成，可转录为 2.2 kb 碱基的成熟 mRNA。在肌腱愈合过程中，c-fos 可能参与激活再生反应、刺激生成Ⅰ型胶原蛋白[8]。同时，c-fos 转录的上调已被证实是机械刺激转录反应中较早的环节，它可能在根本上导致了负荷相关的细胞基质重塑[9]。在心肌细胞[10]、肌细胞[11]、内皮细胞[12]、成骨细胞[13-14]和骨母细胞[15]等多种细胞中均存在机械刺激后 c-fos 基因的早期表达。然而，机械牵拉刺激对 TSCs 的c-fos 表达影响尚不清楚。为此，本实验采用自行设计的体外细胞单轴循环牵伸载荷模型[16]，对 TSCs 进行不同条件的牵伸刺激，探讨牵伸对 c-fos 基因表达的影响，以期为肌腱病发病机制研究及治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
8 周龄雄性 SD 大鼠 3 只，体质量 200～250 g，由第三军医大学实验动物中心提供。
DMEM 培养基、胰蛋白酶（HyClone公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；纤连蛋白、分散酶、Ⅰ型胶原酶、中性蛋白酶（Sigma 公司，美国）；RNAiso Plus 试剂盒、PrimeScript 逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅲ（Takara公司，日本）。iCycler 荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）。微沟槽硅树脂细胞培养皿由本科室自制。
细胞牵拉器由本科室自行研制[16]，包括机械部分和电子控制部分，通过电子控制部分控制机械部分驱动硅树脂细胞培养皿支架做往复运动，从而使贴附于培养皿表面的细胞获得体外机械牵拉。不同牵拉应变量以牵拉位移距离表示[1]。
1.2 TSCs的提取、培养和传代
大鼠跟腱来源 TSCs 分离及培养参照 Rui 等[17]和胡超等[18]的方法。取 3 只 SD 大鼠，CO2处死后取出双侧跟腱，剔除腱鞘及腱周结缔组织，只取中间部分的屈肌腱。将肌腱均匀剪碎成 1 mm×1 mm 大小，加入 2 mL 消化液（含 3 mg/mL Ⅰ型胶原酶和 4 mg/mL 中性蛋白酶），37℃ 孵箱消化 1.5 h。加入含 15%FBS 的DMEM 培养基 2 mL 中止消化后，以离心半径 10 cm、1 000 r/min 离心 8 min。用含 15%FBS 的 DMEM 培养基4 mL 悬浮，连同可能未消化完全的肌腱残留组织直接种于培养皿中，加入含10%FBS的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2温箱中孵育。4～5 d 后换液，培养 8～10 d，可观察到原代细胞长满。细胞扩增后，取第 3 代用于相关实验。TSCs的鉴定按本课题组胡超等[18]的方法进行。
1.3 实验方法
将表面光滑的硅树脂培养皿消毒后烘干备用。用纤连蛋白处理培养皿表面后，将 5×105 个第 3 代 TSCs 接种于硅树脂培养皿。接种 24 h 后，倒置相差显微镜观察 TSCs 贴壁生长情况，观察有无细胞脱落及漂浮。体外细胞牵拉器频率设置为 1 Hz，整个牵拉过程均在 37℃、5%CO2 孵箱中进行。
1.3.1 c-fos mRNA 相对表达量随牵拉时间的变化 分别用 4% 和 8% 牵拉强度牵拉细胞，并在牵拉 0、5、15、30、60、120 min 后收集细胞进行实时荧光定量 PCR 检测，观察 c-fos mRNA 相对表达量随牵拉时间的变化，并找到表达最高时间点（Tmax）。
1.3.2 c-fos mRNA 相对表达量随牵拉强度的变化 分别用 0、2%、4%、6%、8%和12% 的牵拉强度，在牵拉 Tmax 后收集细胞，观察 c-fos mRNA 相对表达量随牵拉强度的变化。
1.3.3 c-fos mRNA 相对表达量经短时刺激后的变化 分别用 2%、4%、6%、8% 和 12% 的牵拉强度，对 TSCs 分别经 0、5、15 min 短时间牵拉后静置至 Tmax，观察 c-fos mRNA 相对表达量经短时刺激后的变化情况。
1.3.4 TSCs 分化标志基因相对表达量随牵拉强度和牵拉时间的变化 分别用 4% 和 8% 牵拉强度牵拉细胞，并在牵拉 0、Tmax、120 min 后收集细胞，检测细胞分化标志基因的相对表达量。
1.3.5 实时荧光定量 PCR 检测方法 使用 RNaiso Plus 试剂盒提取细胞总 RNA，并逆转录为 cDNA。检测 c-fos，成肌腱分化标志基因Ⅰ型胶原、腱调蛋白（tenomodulin，TNMD），成骨分化标志基因 Runx2、远端缺失基因 5（distal-less homeobox 5，Dlx5），成脂肪分化标志基因脂肪酸结合蛋白 4（fatty acid binding protein 4，FABP4）等基于表达，以 GAPDH 作为内参。各基因引物序列：c-fos 上游 5'-CTACTACCATTCCCCAGCCG-3'，下游 5'-CTCCCGCTCTGGCGTAAG-3'；Ⅰ型胶原上游 5'-TGGTGAGACGTGGAAACCTG-3'，下游 5'-CTTGGGTCCCTCGACTCCTA-3'；TNMD 上游 5'-GCGACAATGTGACTATGTAC-3'，下游 5'-GTCTTCTCCACCTTCACTTG-3'；Runx2 上游 5'-GAACTCAGCACCAAGTCCTTT-3'，下游 5'-TGGCATCTACGGCACTCTA-3'；Dlx5 上游 5'-CTTATGCGGACTACGGCTACG-3'，下游 5'-CCTGGGTTTACGAACTTTCTTTG-3'；FABP4 上游5'-CGAGATTTCCTTCAAACTGGG-3'，下游 5'-TCTTGTAGAAGTCACGCCTTTC-3'；GAPDH 上游5'-TGACTTCAACAGCAACTC-3'，下游 5'-TGTAGCCATATTCATTGTCA-3'。PCR 反应条件：95℃ 预变性 8 min；95℃ 变性 10 s、60℃ 退火 20 s、72℃ 延伸 25 s，40 个循环。溶解曲线分析为 55～95℃，0.5℃/15 s。采用 2-ΔΔCt法分析目的基因相对表达量，所有实验均重复 3 次。
1.4 统计学方法
采用 GraphPad Prism 6.01 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用多因素方差分析，两两比较采用 Tukey 法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 c-fos mRNA相对表达量随牵拉时间的变化
与 0 min 相比，在 4% 和 8% 牵拉强度下，c-fos mRNA 相对表达量均在牵拉 15 min 时显著升高，牵拉 30 min 时达峰值，差异均有统计学意义（P<0.05）；牵拉至 60 min时c-fos mRNA 相对表达量恢复至起始水平，与 0 min 比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1。因此Tmax 为 30 min。
2.2 c-fos mRNA相对表达量随牵拉强度的变化
牵拉 30 min 条件下，与牵拉强度 0 比较，2%、4%、6%、8% 和 12% 牵拉强度下 c-fos mRNA 相对表达量均显著升高，且 6%、8% 和 12% 牵拉强度较 2%、4% 牵拉强度进一步升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；2%、4% 间及6%、8%、12% 间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
2.3 c-fos mRNA相对表达量经短时刺激后的变化
各牵拉强度下仅牵拉 5 min c-fos mRNA 相对表达量即有明显升高，与 0 min 比较差异均有统计学意义（P<0.05）；继续牵拉至 15 min和静置至 30 min，c-fos mRNA 相对表达量进一步升高，与牵拉 5 min 时比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
2.4 TSCs分化标志基因相对表达量随牵拉强度和牵拉时间的变化
与 0 min 相比，4% 牵拉强度下，在牵拉 30 min 和 120 min 时，各分化标志基因相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。而 8% 牵拉强度下，在牵拉 30 min 时，Runx2 基因相对表达量显著升高，在牵拉 120 min 时，Ⅰ型胶原、TNMD、Dlx5、Runx2 基因相对表达量均升高，差异均有统计学意义（P>0.05）；FABP4 基因相对表达量在牵拉 30 min 和 120 min 时，与0 min比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 4。
图1
不同牵拉强度下牵拉不同时间c-fos mRNA相对表达量
Figure1.
The relative expressions of c-fos mRNA at different time points under different stretch intensities
图2
不同牵拉强度牵拉30 min c-fos mRNA相对表达量
Figure2.
The relative expressions of c-fos mRNA under different stretch intensities at 30 minutes
图3
不同牵拉强度经0、5、15 min短时间牵拉后静置至30 min c-fos mRNA相对表达量
Figure3.
The relative expressions of c-fos mRNA under different stretch intensities for 0, 5, and 15 minutes and followed by incubation at relax status up to 30 minutes
图4
不同牵拉强度下经0、30、120 min牵拉后TSCs分化标志基因相对表达量 a.Ⅰ型胶原；b. TNMD；c. Dlx5；d. Runx2；e. FABP4
Figure4.
The relative expressions of differentiation related genes mRNA under different stretch intensities at 0, 30, or 120 minutes a. Collagen type I; b. TNMD; c. Dlx5; d. Runx2; e. FABP4
3 讨论
肌腱在运动过程中经过反复牵拉，使TSCs在轴向上发生形变。在过度反复牵拉过程中，可能由于损伤与修复的失衡而导致肌腱微损伤进行性加重，从而导致肌腱病，严重时甚至出现肌腱断裂，这在运动员中很常见。由此可见，牵拉作用于肌腱后，在一定条件下具有损害效应。然而，对于已产生肌腱病的运动员或肌腱手术后的患者，采取肌腱牵拉运动却能改善预后，加快肌腱恢复速度[19]。这说明牵拉应力对于肌腱的影响取决于牵拉方式，以及牵拉强度、时间等一系列因素。
已有多项研究证实，许多种类的细胞在经过机械牵拉刺激后，其立早基因（如 c-fos、c-jun、Egr-1、c-myc 等）能够快速表达，其中 c-fos 表达的研究较为广泛[20]。然而，对于同样经受牵拉应力的 TSCs，c-fos 的表达情况尚未见报道。因此，本实验通过自制体外细胞单轴循环牵拉载荷模型对 TSCs 的牵拉，观察 c-fos 的早期表达，对进一步研究机械信号-基因信号耦联机制具有重要意义。
Zhang 等[6]的研究表明，4% 和8% 体外细胞牵拉强度对 TSCs 的分化分别具有腱向分化和非腱向分化作用。因此，我们首先利用 4% 和 8% 的牵拉强度对 TSCs 进行多时间点牵拉观察。结果发现在机械牵拉 15 min 后 c-fos mRNA 相对表达量显著上升，在 30 min 时达峰值。继续牵拉后 c-fos mRNA 相对表达量骤降，于 60 min 后回到最初水平。c-fos mRNA 相对表达量在牵拉过程中骤降可能与 mRNA 分子的多聚 A 尾被酶降解有关[20]。
通过以上实验发现，在牵拉 30 min 时c-fos mRNA 相对表达量达最大。因此，我们通过 2%~12% 的牵拉强度牵拉30 min，研究牵拉强度与 c-fos 表达的关系。之所以选择此牵拉强度范围是由于肌腱根据应力-应变曲线，2% 牵拉强度时肌腱纤维开始伸直，至 12% 时已对肌腱纤维产生明显损伤作用[21]。实验结果显示，2% 的牵拉强度即可使 c-fos mRNA 相对表达量升高，并且与 4% 牵拉强度无明显差异；而 6% 牵拉强度时其表达量进一步升高，并且与 8%、12% 牵拉强度无明显差异。这表明 c-fos mRNA 的表达具有一定牵伸强度依赖性。
为了检测短时间牵拉后 c-fos 基因的表达，我们将细胞分别在各牵拉强度下牵拉 5、15 min，然后静置孵育至 30 min。结果发现仅牵伸 5 min，c-fos 即可得到表达。这与既往研究报道的持续牵拉心肌细胞[22]或子宫平滑肌细胞[20]1 min 即可引起 c-fos mRNA 的表达相似。表明 TSCs 对刺激的反应非常敏感，极短时间的牵拉刺激即可引起 c-fos 表达，从而引发其下游的链式反应。同时，我们也发现 c-fos 的转录完成需要数分钟时间，因为在 4% 和 8% 牵拉强度下，牵拉 5 min 时立即检测，c-fos mRNA 相对表达量与 0 min时无统计学差异；但牵拉 5 min，静置孵育至 30 min时，c-fos mRNA 相对表达量较 0 min 显著增加。
最后我们检测了 4% 和 8% 牵拉强度下 TSCs 分化标志基因的转录情况。结果发现 8% 牵拉强度下，经过 120 min 刺激后，大部分标志基因的表达量明显升高，而 4% 牵拉强度在 120 min 牵拉下各指标与 0 min 相比无统计学差异。进一步表明了不同牵拉强度不仅在长时间作用后对 TSCs 的分化产生不同影响，还可能在牵拉早期已对不同基因的表达产生了不同作用。
综上述，不同牵拉强度对 TSCs 分化方向具有不同影响，并且起着非常重要的作用。通过对 TSCs 立早基因 c-fos 表达的研究表明，在牵拉初期，牵拉强度、时间已对细胞产生了不同影响，可能进一步影响了 TSCs 的分化方向。本研究仅研究了短时间牵拉效果，考虑到不同蛋白组装的时间差异，检测仅在基因层面进行，在排除其他干扰条件后 c-fos 对下游各分化基因的影响还有待进一步研究。
