引用本文： 蔡俊, 孙钰, 戈应滨, 曹晓建. 他克莫司刺激星形胶质细胞分泌EGF促进神经细胞突起生长的研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(11): 1423-1428. doi: 10.7507/1002-1892.20150305 复制
脊髓损伤治疗一直是医学界难题，临床上缺少有效治疗方法。脊髓损伤修复的关键是提高神经元的存活和增殖，促进神经元轴突再生。既往研究证实他克莫司（FK506）能够促进脊髓损伤大鼠的神经功能恢复[1]，但具体作用机制不明确。Martinez等[2]报道星形胶质细胞在甲状腺激素（T3）诱导小脑神经细胞发育过程中发挥重要作用；同时，FK506能够影响星形胶质细胞多个信号通路和调节基因的表达[3]。由此我们设想，FK506促进神经功能恢复的作用有可能是通过胶质细胞来间接发挥作用。星形胶质细胞是中枢神经系统主要的胶质细胞，通过调节谷氨酸摄取和释放、清除自由基、产生细胞因子和一氧化氮等，对神经元提供营养和代谢支持、调节突触活动和神经元的可塑性、影响神经元的存活；胶质细胞的活化在脊髓损伤早期可改善神经元存活的内环境，促进脊髓损伤修复[4-6]。本实验用FK506刺激星形胶质细胞获取上清液培养神经细胞，观察神经细胞突起生长情况，同时采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）和EGF抗体中和实验验证上清液中EGF的分泌及神经营养作用，观察EGF促进神经细胞突起生长的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2日龄SD大鼠6只，雌雄不限；孕15 d SD大鼠2只；均由南京医科大学实验动物中心提供。
Neurobasal神经细胞培养液、DMEM、DMEM/F12、H-DMEM、胰蛋白酶、FBS、马血清（GIBCO公司，美国）；兔抗鼠Doublecortin、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）单克隆抗体、小鼠抗大鼠微管相关蛋白（microtubule-associated protein 2，MAP2）单克隆抗体、山羊抗小鼠荧光染料二抗（Alexa568）、山羊抗兔荧光染料二抗（Alexa488）（Santa Cruz公司，美国）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、FK506、Triton X-100（Sigma公司，美国）；DAPI荧光封片剂（Southern Biotech公司，美国）；EGF中和抗体（R&D公司，美国）；反转录试剂盒（Fermentas公司，美国）；RT-qPCR试剂盒（ABI公司，美国）；ELISA检测试剂盒（武汉优尔生商贸有限公司）。
3k超滤离心管（Millipore公司，美国）；Elx800型酶标仪（Bio-Tek公司，美国）；HF90型CO2细胞培养箱（Heal Force公司，美国）；TMS倒置相差显微镜（Nikon 公司，日本）；高速低温离心机（Beckman Coulter公司，美国）；Step One Plus型RT-qPCR仪（ABI公司，美国）；LSM710激光共聚焦显微镜、ZEN2009软件系统、Zeiss LSM Image Browser软件（Zeiss公司，德国）。
1.2 FK506促进脊髓星形胶质细胞合成分泌EGF
1.2.1 脊髓星形胶质细胞培养及鉴定
取2日龄SD大鼠，乙醇浸泡处死，取出脊髓，去除硬脊膜后剪成乳糜状，0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液后，用含10%FBS的H-DMEM培养液终止消化；收集细胞，以5×105个/mL密度接种至培养皿，48 h后更换培养液，以后每3天换液1次。原代培养8～10 d后待细胞长至致密单层时，0.25%胰蛋白酶消化传代扩增。倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。
鉴定：取第2代培养细胞，以5×105个/mL密度接种于盖玻片，贴壁生长后，PBS清洗5 min×3次；4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗5 min×3 次；0.2%Triton X-100透膜30 min，PBS洗涤5 min×3次；5%BSA封闭30 min；用1∶200稀释的GFAP一抗4℃孵育过夜；PBS清洗5 min×3次；将1∶500稀释的荧光二抗室温下避光孵育1 h后，PBS清洗5 min×3次。DAPI 染色5 min，封片；荧光显微镜下观察。
1.2.2 条件培养液的制备
星形胶质细胞达80%融合时，用含1%FBS的DMEM培养液培养12 h；更换无血清DMEM培养液3 mL，实验组加入5 μL FK506浓缩储存液（FK506原料药5 mg溶于500 μL无菌DMSO，分装，避光冻存于-20℃冰箱），使培养液中FK506浓度为20 μmol/L；对照组加入5 μL DMSO。24 h后收集两组细胞上清，以800×g离心10 min；取上清于3k超滤离心管中，以7 500×g离心20 min；收集浓缩液，加入Neurobasal神经细胞培养液，调整体积与浓缩前体积相同，-20℃保存。
1.2.3 ELISA检测上清EGF
取两组条件培养液上清后，按ELISA试剂盒说明书方法检测两组EGF浓度。
1.2.4 RT-qPCR检测EGF
mRNA表达收集两组细胞，加入Trizol，吹打后离心管中静置5 min；加入三氯甲烷，震荡15 s；于4℃、12 000×g离心15 min；取上层水相，加入等体积异丙醇，震荡后静置10 min；于4℃、12 000×g离心10 min；弃上清，沉淀中加入1 mL 75%乙醇（DEPC水现配），洗涤沉淀；4℃、7 500×g离心5 min；弃上清，加入RNase-free水，充分溶解。紫外分光光度计检测RNA浓度。取RNA 1.5 μg、Random primer 1 μL，加入Nuclease-free水补齐至12 μL；混匀，65℃、5 min；加5×反应缓冲液4 μL、dNTP 2 μL、反转录酶1 μL、RNA酶抑制剂1 μL，混匀，25℃、5 min，42℃、60 min，70℃、5 min；所得cDNA溶液-20℃保存。反应条件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，40个循环。引物由南京金斯瑞公司合成，EGF上游引物：5'-CTTAGGGATGTGGGGGACTT-3'，下游引物: 5'-TTGGGCTGTTGGTGTTCCTC-3'；对照基因GAPDH上游引物： 5'-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，下游引物: 5'-TACTCAGCACCAGCATCACC-3'。以Ct值比值方法计算两组EGF基因相对表达量。
1.3 FK506处理后的星形胶质细胞上清促进神经细胞突起生长
1.3.1 脊髓神经元细胞分离培养及鉴定
脱颈椎处死孕15 d SD大鼠，取出胚胎乙醇消毒，经背部剪开皮肤，分离取出脊髓，剥除脊膜及血管组织，将脊髓剪成1 mm3大小；0.05%胰蛋白酶37℃消化15 min；加入1 mL FBS终止消化，分3次吹打并吸取上层液体[7]。梯度离心后，收取梯度面和上面培养液分界面间的神经元细胞层[8]；再次200×g离心6 min后，用含15%FBS的DMEM/F12重悬下层细胞沉淀，调整细胞密度为1×106个/mL，接种至预涂多聚赖氨酸的盖玻片；37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育。培养3 h后首次换液，清洗去除细胞碎片，倒置相差显微镜观察原代神经细胞形态学变化。
鉴定：待细胞贴壁牢靠后，取出盖玻片，用冰PBS漂洗3 min×2次，4%多聚甲醛固定30 min；PBS漂洗3 min×3次，0.05%Triton X-100孵育5 min；PBS漂洗3 min×3次，5%BSA室温封闭30 min；MAP2和Doublecortin单克隆一抗（1∶200）孵育4℃过夜，阴性对照用一抗稀释液不加一抗抗体；PBS漂洗5 min×3次，Alexa488、Alexa568标记二抗室温孵育1 h；PBS漂洗3 min×5次，DAPI荧光封片剂封片[9]，荧光显微镜下观察。
1.3.2 实验分组
为观察FK506处理后的星形胶质细胞上清对脊髓神经元细胞突起生长的促进作用，分别采用1.2.2中获得的实验组和对照组条件培养液培养脊髓神经元细胞（分别为A、B组）；为进一步确认星形胶质细胞分泌的EGF在FK506促进神经细胞突起生长中的作用，将对照组和实验组条件培养液预先用2 μg/ mL EGF中和抗体处理后再培养脊髓神经元细胞（分别为C、D组）。
1.3.3 神经突长度测量
培养3 d后取出各组细胞爬片，MAP2单克隆一抗（1∶200）孵育4℃过夜；PBS漂洗，Alexa568标记二抗室温孵育；激光共聚焦显微镜下每组标本取40个视野，用ZEN2009软件系统拍照，每组至少随机选择60个独立神经元，分别用Zeiss LSM Image Browser软件对单个神经细胞突起长度进行测量，结果用神经突总长度（单个神经细胞从胞体到所有神经突起末端的长度总和）[10]和最长神经突长度两个指标来衡量神经突起生长情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 FK506促进脊髓星形胶质细胞合成分泌EGF
2.1.1 脊髓星形胶质细胞形态学观察及免疫荧光染色鉴定
倒置相差显微镜观察示，脊髓星形胶质细胞呈三角形和多角形贴壁生长，突起短、分支多，表面粗糙，随着细胞增殖可融合成片；传代后细胞形态无明显改变。见图 1。第2代细胞经GFAP免疫荧光染色可见绿色荧光（星形胶质细胞特异性标记），细胞核染为蓝色；染色阳性率达95%以上。见图 2。
图1
脊髓星形胶质细胞形态学观察（倒置相差显微镜×40） ⓐ 原代细胞 ⓑ 第1代细胞 2.1.2 ELISA检测和RT-qPCR检测
ELISA检测示，实验组EGF含量为0.241±0.044，显著高于对照组的0.166±0.014，比较差异有统计学意义（t=3.93，P=0.01）。RT-qPCR检测得到了相同结果，实验组EGF基因相对表达量为1.12±0.25，显著高于对照组的0.46±0.11，比较差异有统计学意义（t=5.78，P=0.00）。
2.2 FK506处理后的星形胶质细胞上清促进神经细胞突起生长
2.2.1 脊髓神经元细胞形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜观察示，大鼠神经元胞体呈圆形，体积小，透亮；贴壁后逐渐变扁平，呈椭圆形或类圆形，周围有光晕，从胞体生长出细长突起，逐渐相互交织成网状。见图 3。培养细胞经MAP2和Doublecortin免疫荧光双重染色鉴定示，90%以上细胞呈MAP2和Doublecortin染色阳性，其中MAP2染色呈红色，神经突起清晰；Doublecortin染色呈绿色。见图 4。
2.2.2 神经突长度测量
C、D组神经突总长度和最长神经突长度均显著小于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组神经细胞突总长度和最长神经突长度均明显大于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 5、表 1。
表1
各组神经突总长度和最长神经突长度比较（n=60，μm，3 讨论
FK506是一种强力免疫抑制剂，通过与FK506结合蛋白和钙依赖磷酸酶结合形成复合体，能够抑制淋巴细胞增殖。有研究[11-12]发现FK506具有促进脊髓损伤后神经恢复的作用。但FK506的神经保护作用机制还不清楚。Szydlowska 等[13]研究表明FK506能阻断谷氨酸中毒导致的星形胶质细胞凋亡和脑外伤时的星形胶质细胞死亡过程中ERK1/2信号通路的激活，达到神经系统保护作用。也有相关研究证实FK506治疗后，能够抑制钙调磷酸酶的活化，可减少脊髓损伤后星形胶质细胞和少突胶质细胞等白质区域细胞的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性[14]。我们既往的实验结果[1]表明，FK506可促进脊髓损伤后大鼠运动功能恢复，但在体外实验中未能观察到FK506明显促进神经细胞突起的生长。因此我们考虑FK506的神经保护作用需要通过中介细胞来实现。我们前期实验采用FK506刺激胶质细胞后进行基因谱分析，发现EGF的表达明显增加。
星形胶质细胞是神经胶质瘢痕增生的主要细胞成分，曾被认为在阻碍中枢神经系统轴突再生过程中起重要作用[15]。近年Rolls等[16]提出在中枢神经损伤中，胶质瘢痕组织形成既能抑制轴突生长，同时也参加内源性局部免疫调节和修复过程，发挥有利于神经功能恢复的双重作用。Norenberg[17]发现活化增生的胶质瘢痕是脊髓对外界损伤的一个反应性修复过程，是星形胶质细胞增殖、胞体和细胞核过度肥大的过程。如果脊髓损伤后去除增生的星形胶质细胞，可导致神经元变性和运动功能障碍增加[18]。因此，损伤部位的星形胶质细胞反应可能起到保护损伤神经细胞和促进功能恢复的作用。Zawadzka等[3]研究表明FK506能够影响星形胶质细胞多个信号通路和调节基因的表达，星形胶质细胞的神经营养因子表达调节是亲免素配体的潜在神经保护机制。我们假设FK506可能通过调节星形细胞的活性提供神经保护作用。本研究中，我们用FK506处理后的星形胶质细胞上清液培养脊髓神经元细胞，发现神经突长度明显增加，表明FK506可能刺激星形胶质细胞分泌某种细胞因子来促进神经细胞突起的生长。
此外，有文献[2]指出EGF/磷脂酰肌醇3-激酶途径在甲状腺激素处理的星形胶质细胞促进神经细胞轴突生长过程中发挥重要作用。EGF对于哺乳动物细胞是一强力的有丝分裂因子[19]，可促进中枢神经系统神经元祖细胞、神经元以及神经胶质细胞增殖和分化[20-21]；EGF也是一个重要的神经营养因子，能刺激神经突生长[22]；此外，EGF可通过刺激甲状腺激素和多功能蛋白聚糖G3片段来促进神经突生长[2, 23]。本研究通过RT-qPCR和ELISA检测，结果表明FK506处理后的星形胶质细胞上清液中EGF含量明显增高，用此条件培养液培养神经细胞能够明显促进神经细胞突起生长。然后在两组星形胶质细胞上清条件培养液中加入兔抗大鼠EGF单克隆抗体，与条件培养液中的EGF产生特异性结合来中和其中的EGF，从而阻断EGF对神经细胞的作用，结果表明两组条件培养液培养的神经细胞突起长度无显著性差异。进一步印证了FK506对脊髓损伤的神经保护作用是由星形胶质细胞分泌的EGF来实现的，与既往研究结果中胶质细胞的神经营养作用一致[24-26]。
脊髓损伤治疗一直是医学界难题，临床上缺少有效治疗方法。脊髓损伤修复的关键是提高神经元的存活和增殖，促进神经元轴突再生。既往研究证实他克莫司（FK506）能够促进脊髓损伤大鼠的神经功能恢复[1]，但具体作用机制不明确。Martinez等[2]报道星形胶质细胞在甲状腺激素（T3）诱导小脑神经细胞发育过程中发挥重要作用；同时，FK506能够影响星形胶质细胞多个信号通路和调节基因的表达[3]。由此我们设想，FK506促进神经功能恢复的作用有可能是通过胶质细胞来间接发挥作用。星形胶质细胞是中枢神经系统主要的胶质细胞，通过调节谷氨酸摄取和释放、清除自由基、产生细胞因子和一氧化氮等，对神经元提供营养和代谢支持、调节突触活动和神经元的可塑性、影响神经元的存活；胶质细胞的活化在脊髓损伤早期可改善神经元存活的内环境，促进脊髓损伤修复[4-6]。本实验用FK506刺激星形胶质细胞获取上清液培养神经细胞，观察神经细胞突起生长情况，同时采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）和EGF抗体中和实验验证上清液中EGF的分泌及神经营养作用，观察EGF促进神经细胞突起生长的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2日龄SD大鼠6只，雌雄不限；孕15 d SD大鼠2只；均由南京医科大学实验动物中心提供。
Neurobasal神经细胞培养液、DMEM、DMEM/F12、H-DMEM、胰蛋白酶、FBS、马血清（GIBCO公司，美国）；兔抗鼠Doublecortin、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）单克隆抗体、小鼠抗大鼠微管相关蛋白（microtubule-associated protein 2，MAP2）单克隆抗体、山羊抗小鼠荧光染料二抗（Alexa568）、山羊抗兔荧光染料二抗（Alexa488）（Santa Cruz公司，美国）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、FK506、Triton X-100（Sigma公司，美国）；DAPI荧光封片剂（Southern Biotech公司，美国）；EGF中和抗体（R&D公司，美国）；反转录试剂盒（Fermentas公司，美国）；RT-qPCR试剂盒（ABI公司，美国）；ELISA检测试剂盒（武汉优尔生商贸有限公司）。
3k超滤离心管（Millipore公司，美国）；Elx800型酶标仪（Bio-Tek公司，美国）；HF90型CO2细胞培养箱（Heal Force公司，美国）；TMS倒置相差显微镜（Nikon 公司，日本）；高速低温离心机（Beckman Coulter公司，美国）；Step One Plus型RT-qPCR仪（ABI公司，美国）；LSM710激光共聚焦显微镜、ZEN2009软件系统、Zeiss LSM Image Browser软件（Zeiss公司，德国）。
1.2 FK506促进脊髓星形胶质细胞合成分泌EGF
1.2.1 脊髓星形胶质细胞培养及鉴定
取2日龄SD大鼠，乙醇浸泡处死，取出脊髓，去除硬脊膜后剪成乳糜状，0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液后，用含10%FBS的H-DMEM培养液终止消化；收集细胞，以5×105个/mL密度接种至培养皿，48 h后更换培养液，以后每3天换液1次。原代培养8～10 d后待细胞长至致密单层时，0.25%胰蛋白酶消化传代扩增。倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。
鉴定：取第2代培养细胞，以5×105个/mL密度接种于盖玻片，贴壁生长后，PBS清洗5 min×3次；4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗5 min×3 次；0.2%Triton X-100透膜30 min，PBS洗涤5 min×3次；5%BSA封闭30 min；用1∶200稀释的GFAP一抗4℃孵育过夜；PBS清洗5 min×3次；将1∶500稀释的荧光二抗室温下避光孵育1 h后，PBS清洗5 min×3次。DAPI 染色5 min，封片；荧光显微镜下观察。
1.2.2 条件培养液的制备
星形胶质细胞达80%融合时，用含1%FBS的DMEM培养液培养12 h；更换无血清DMEM培养液3 mL，实验组加入5 μL FK506浓缩储存液（FK506原料药5 mg溶于500 μL无菌DMSO，分装，避光冻存于-20℃冰箱），使培养液中FK506浓度为20 μmol/L；对照组加入5 μL DMSO。24 h后收集两组细胞上清，以800×g离心10 min；取上清于3k超滤离心管中，以7 500×g离心20 min；收集浓缩液，加入Neurobasal神经细胞培养液，调整体积与浓缩前体积相同，-20℃保存。
1.2.3 ELISA检测上清EGF
取两组条件培养液上清后，按ELISA试剂盒说明书方法检测两组EGF浓度。
1.2.4 RT-qPCR检测EGF
mRNA表达收集两组细胞，加入Trizol，吹打后离心管中静置5 min；加入三氯甲烷，震荡15 s；于4℃、12 000×g离心15 min；取上层水相，加入等体积异丙醇，震荡后静置10 min；于4℃、12 000×g离心10 min；弃上清，沉淀中加入1 mL 75%乙醇（DEPC水现配），洗涤沉淀；4℃、7 500×g离心5 min；弃上清，加入RNase-free水，充分溶解。紫外分光光度计检测RNA浓度。取RNA 1.5 μg、Random primer 1 μL，加入Nuclease-free水补齐至12 μL；混匀，65℃、5 min；加5×反应缓冲液4 μL、dNTP 2 μL、反转录酶1 μL、RNA酶抑制剂1 μL，混匀，25℃、5 min，42℃、60 min，70℃、5 min；所得cDNA溶液-20℃保存。反应条件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，40个循环。引物由南京金斯瑞公司合成，EGF上游引物：5'-CTTAGGGATGTGGGGGACTT-3'，下游引物: 5'-TTGGGCTGTTGGTGTTCCTC-3'；对照基因GAPDH上游引物： 5'-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，下游引物: 5'-TACTCAGCACCAGCATCACC-3'。以Ct值比值方法计算两组EGF基因相对表达量。
1.3 FK506处理后的星形胶质细胞上清促进神经细胞突起生长
1.3.1 脊髓神经元细胞分离培养及鉴定
脱颈椎处死孕15 d SD大鼠，取出胚胎乙醇消毒，经背部剪开皮肤，分离取出脊髓，剥除脊膜及血管组织，将脊髓剪成1 mm3大小；0.05%胰蛋白酶37℃消化15 min；加入1 mL FBS终止消化，分3次吹打并吸取上层液体[7]。梯度离心后，收取梯度面和上面培养液分界面间的神经元细胞层[8]；再次200×g离心6 min后，用含15%FBS的DMEM/F12重悬下层细胞沉淀，调整细胞密度为1×106个/mL，接种至预涂多聚赖氨酸的盖玻片；37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育。培养3 h后首次换液，清洗去除细胞碎片，倒置相差显微镜观察原代神经细胞形态学变化。
鉴定：待细胞贴壁牢靠后，取出盖玻片，用冰PBS漂洗3 min×2次，4%多聚甲醛固定30 min；PBS漂洗3 min×3次，0.05%Triton X-100孵育5 min；PBS漂洗3 min×3次，5%BSA室温封闭30 min；MAP2和Doublecortin单克隆一抗（1∶200）孵育4℃过夜，阴性对照用一抗稀释液不加一抗抗体；PBS漂洗5 min×3次，Alexa488、Alexa568标记二抗室温孵育1 h；PBS漂洗3 min×5次，DAPI荧光封片剂封片[9]，荧光显微镜下观察。
1.3.2 实验分组
为观察FK506处理后的星形胶质细胞上清对脊髓神经元细胞突起生长的促进作用，分别采用1.2.2中获得的实验组和对照组条件培养液培养脊髓神经元细胞（分别为A、B组）；为进一步确认星形胶质细胞分泌的EGF在FK506促进神经细胞突起生长中的作用，将对照组和实验组条件培养液预先用2 μg/ mL EGF中和抗体处理后再培养脊髓神经元细胞（分别为C、D组）。
1.3.3 神经突长度测量
培养3 d后取出各组细胞爬片，MAP2单克隆一抗（1∶200）孵育4℃过夜；PBS漂洗，Alexa568标记二抗室温孵育；激光共聚焦显微镜下每组标本取40个视野，用ZEN2009软件系统拍照，每组至少随机选择60个独立神经元，分别用Zeiss LSM Image Browser软件对单个神经细胞突起长度进行测量，结果用神经突总长度（单个神经细胞从胞体到所有神经突起末端的长度总和）[10]和最长神经突长度两个指标来衡量神经突起生长情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 FK506促进脊髓星形胶质细胞合成分泌EGF
2.1.1 脊髓星形胶质细胞形态学观察及免疫荧光染色鉴定
倒置相差显微镜观察示，脊髓星形胶质细胞呈三角形和多角形贴壁生长，突起短、分支多，表面粗糙，随着细胞增殖可融合成片；传代后细胞形态无明显改变。见图 1。第2代细胞经GFAP免疫荧光染色可见绿色荧光（星形胶质细胞特异性标记），细胞核染为蓝色；染色阳性率达95%以上。见图 2。
图1
脊髓星形胶质细胞形态学观察（倒置相差显微镜×40） ⓐ 原代细胞 ⓑ 第1代细胞 2.1.2 ELISA检测和RT-qPCR检测
ELISA检测示，实验组EGF含量为0.241±0.044，显著高于对照组的0.166±0.014，比较差异有统计学意义（t=3.93，P=0.01）。RT-qPCR检测得到了相同结果，实验组EGF基因相对表达量为1.12±0.25，显著高于对照组的0.46±0.11，比较差异有统计学意义（t=5.78，P=0.00）。
2.2 FK506处理后的星形胶质细胞上清促进神经细胞突起生长
2.2.1 脊髓神经元细胞形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜观察示，大鼠神经元胞体呈圆形，体积小，透亮；贴壁后逐渐变扁平，呈椭圆形或类圆形，周围有光晕，从胞体生长出细长突起，逐渐相互交织成网状。见图 3。培养细胞经MAP2和Doublecortin免疫荧光双重染色鉴定示，90%以上细胞呈MAP2和Doublecortin染色阳性，其中MAP2染色呈红色，神经突起清晰；Doublecortin染色呈绿色。见图 4。
2.2.2 神经突长度测量
C、D组神经突总长度和最长神经突长度均显著小于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组神经细胞突总长度和最长神经突长度均明显大于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 5、表 1。
表1
各组神经突总长度和最长神经突长度比较（n=60，μm，3 讨论
FK506是一种强力免疫抑制剂，通过与FK506结合蛋白和钙依赖磷酸酶结合形成复合体，能够抑制淋巴细胞增殖。有研究[11-12]发现FK506具有促进脊髓损伤后神经恢复的作用。但FK506的神经保护作用机制还不清楚。Szydlowska 等[13]研究表明FK506能阻断谷氨酸中毒导致的星形胶质细胞凋亡和脑外伤时的星形胶质细胞死亡过程中ERK1/2信号通路的激活，达到神经系统保护作用。也有相关研究证实FK506治疗后，能够抑制钙调磷酸酶的活化，可减少脊髓损伤后星形胶质细胞和少突胶质细胞等白质区域细胞的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性[14]。我们既往的实验结果[1]表明，FK506可促进脊髓损伤后大鼠运动功能恢复，但在体外实验中未能观察到FK506明显促进神经细胞突起的生长。因此我们考虑FK506的神经保护作用需要通过中介细胞来实现。我们前期实验采用FK506刺激胶质细胞后进行基因谱分析，发现EGF的表达明显增加。
星形胶质细胞是神经胶质瘢痕增生的主要细胞成分，曾被认为在阻碍中枢神经系统轴突再生过程中起重要作用[15]。近年Rolls等[16]提出在中枢神经损伤中，胶质瘢痕组织形成既能抑制轴突生长，同时也参加内源性局部免疫调节和修复过程，发挥有利于神经功能恢复的双重作用。Norenberg[17]发现活化增生的胶质瘢痕是脊髓对外界损伤的一个反应性修复过程，是星形胶质细胞增殖、胞体和细胞核过度肥大的过程。如果脊髓损伤后去除增生的星形胶质细胞，可导致神经元变性和运动功能障碍增加[18]。因此，损伤部位的星形胶质细胞反应可能起到保护损伤神经细胞和促进功能恢复的作用。Zawadzka等[3]研究表明FK506能够影响星形胶质细胞多个信号通路和调节基因的表达，星形胶质细胞的神经营养因子表达调节是亲免素配体的潜在神经保护机制。我们假设FK506可能通过调节星形细胞的活性提供神经保护作用。本研究中，我们用FK506处理后的星形胶质细胞上清液培养脊髓神经元细胞，发现神经突长度明显增加，表明FK506可能刺激星形胶质细胞分泌某种细胞因子来促进神经细胞突起的生长。
此外，有文献[2]指出EGF/磷脂酰肌醇3-激酶途径在甲状腺激素处理的星形胶质细胞促进神经细胞轴突生长过程中发挥重要作用。EGF对于哺乳动物细胞是一强力的有丝分裂因子[19]，可促进中枢神经系统神经元祖细胞、神经元以及神经胶质细胞增殖和分化[20-21]；EGF也是一个重要的神经营养因子，能刺激神经突生长[22]；此外，EGF可通过刺激甲状腺激素和多功能蛋白聚糖G3片段来促进神经突生长[2, 23]。本研究通过RT-qPCR和ELISA检测，结果表明FK506处理后的星形胶质细胞上清液中EGF含量明显增高，用此条件培养液培养神经细胞能够明显促进神经细胞突起生长。然后在两组星形胶质细胞上清条件培养液中加入兔抗大鼠EGF单克隆抗体，与条件培养液中的EGF产生特异性结合来中和其中的EGF，从而阻断EGF对神经细胞的作用，结果表明两组条件培养液培养的神经细胞突起长度无显著性差异。进一步印证了FK506对脊髓损伤的神经保护作用是由星形胶质细胞分泌的EGF来实现的，与既往研究结果中胶质细胞的神经营养作用一致[24-26]。
