软骨细胞作为一种力学效应细胞，在体内多轴载荷的刺激下，能够产生多种物理化学信号，从而影响自身的生长、发育和凋亡。为此，模拟体内力学环境成为体外培养软骨细胞的一大研究热点。虽然大量报道已充分证明不同机械刺激能够调控软骨细胞代谢，但对其加载方案尚未达成一致。本篇综述将从不同机械形式出发，探讨不同机械刺激调控软骨细胞代谢的差异性，从而寻找促进软骨细胞生长增殖的优势方案，以制定更为稳定、有效和可靠的实验策略。
引用本文： 杨光露, 郭杨, 涂鹏程, 吴承杰, 潘娅岚, 马勇. 不同机械刺激调控软骨细胞代谢的研究进展. 生物医学工程学杂志, 2020, 37(6): 1101-1108. doi: 10.7507/1001-5515.202001044 复制
引言
关节软骨（articular cartilage，AC）内在修复能力有限，因此一旦损伤就难以恢复。虽然临床用于治疗关节软骨损伤的方法有很多，包括软骨下骨钻孔术、全关节置换术以及微骨折术等多种方式，但仍存在诸多缺点。近年来，随着软骨组织工程（cartilage tissue engineering，CTE）的发展，自体软骨移植术得到了广泛应用，但体外培养的软骨细胞（chondrocyte，CC），其生物力学特性与天然软骨存在较大差异。天然软骨在关节运动过程中会与关节腔内的液体产生多种机械刺激，这些机械刺激可以通过细胞外基质（extracellular matrix，ECM）周围的机械传感器传递机械信号，从而直接或间接调控 CC 的活性和行为[1]。
由于体内机械环境的复杂性和 CC 对机械刺激的高度敏感性，如何模拟体内的机械环境使之达到对 CC 代谢的积极效应，成为目前体外培养 CC 的一大难点[2]。因此，为了进一步研究机械刺激对 CC 代谢的影响，本综述将从不同机械形式出发，阐述牵张力、静水压力、流体剪切力、压缩力、低强度脉冲超声、微重力、电磁场对 CC 分化代谢的作用，从而寻求并优化培养组织工程 CC 的潜在策略。
1 主要机械刺激
1.1 牵张力
牵张力（tensile strain，TS）是体内最为常见的内力，是近年来研究的热点[3]。有报道表明低强度（0～1%）应变、1 Hz 的 TS 能够促进骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）向 CC 分化，且软骨形成标志物的表达随时间的延长而上调[4]。也有研究发现加载中强度（2%～10%）应变、0.16～0.5 Hz 的 TS 可以促进 CC 合成[5-7]。一些学者认为这可能是通过激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）和抑制核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）-p65 的核转运来减轻软骨损伤[8]。但 Zhong 等[9]对兔 CC 进行 10% 应变的 TS 后，却发现 CC 表型被破坏，这可能与 TS 激活粘附斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）-丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号，从而上调炎症因子的表达有关[10]。Liu 等[7]表明在中度 TS 加载下，浅层 CC 更能维持细胞表型，延缓细胞衰老。而高强度（> 10%）应变、0.5 Hz 的 TS 常常会抑制 CC 表型的形成，引起基质的降解[6, 11-12]。但 Lohberger 等[13]发现交替加载低、高强度的 TS 反而能够显著减少基质的降解，从而降低对 CC 表型的破坏。如何联合加载低、中、高强度的 TS 使之促进 CC 增殖还需要广大研究者的不断探索。关于 TS 对体外 CC 代谢的影响详见表 1。
表1
TS 对体外 CC 代谢的影响
Table1.
Effect of tensile strain on metabolism of chondrocytes in vitro
1.2 静水压力
静水压力（hydrostatic pressure，HP）是作用于 CC 的主要力学刺激之一。低 HP（0～10 MPa）能够通过整联蛋白-FAK-细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）/磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）途径增强 CC 活性并减少其凋亡[14]。姚旺祥等[15]认为它还可以减少 MAPK 信号通路蛋白的表达来保护 ECM 的合成。研究表明高 HP（> 10 MPa）会显著增加应激及凋亡相关基因的表达，特别是加载 4 h 后，不利于维持细胞表型和基质的合成[16]。
单独施加 HP，比微重力（microgravity，MG）和流体剪切力（fluid shear stress，FSS）更能促进 ECM 的形成，甚至比 HP 和偏应力的联合使用更能促进 CC 表型形成，但三者皆有软骨保护作用，可以通过下调 COL10 的表达来抑制细胞肥大，减少细胞凋亡[17-19]。部分研究表明短时间（1～4 h/d）内加载的低 HP 对促进 CC 形成或抑制 CC 肥大来说可能是优势参数[17-18, 20]。另外，Ogura 等[21]发现重复间歇加载 HP 对 CC 的合成代谢和活性的影响可能更大。如果在短时间内进行重复间歇加载是否会对 CC 更有利目前尚无研究，未来可进一步探索。关于 HP 对体外 CC 代谢作用的影响详见表 2。
表2
HP 对体外 CC 代谢作用的影响
Table2.
Effect of hydrostatic pressure on metabolism of chondrocytes in vitro
1.3 流体剪切力
当关节处于运动状态时，被挤压的滑液对 CC 表面会产生 FSS。研究表明低强度（< 10 dyn/cm2）FSS 能够抑制白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）激活的 NF-κB，保护软骨运动[22]。但 Zhang 等[23]发现对正常 CC 加载低强度 FSS，会引起 CC 的终末分化和纤维化，说明 FSS 对正常 CC 没有治疗作用。Su 等[24]在研究 FSS 对抵抗素诱导的环氧化酶（cyclooxygenase，COX）-2 的作用时发现，在抵抗素诱导前后加载 FSS，COX2 的表达呈相反趋势，说明 FSS 对 CC 代谢的影响是多方向的。有报道认为中强度（> 12 dyn/cm2）FSS 会促进基质降解，抑制 CC 表型合成[23]。Adeniran-Catlett 等[25]却表示中强度 FSS 的施加并不会抑制 BMSCs 向 CC 分化的能力。
Kuang 等[26]表明高强度（> 20 dyn/cm2）FSS 会导致 CC 退化，促进破骨细胞性骨吸收。有学者在 BMSCs 上也发现了类似的结论，认为高强度 FSS 会抑制软骨表型的形成，引起 CC 退化[27]。另外，CS 和 FSS 在一定参数下联合加载能够增强 CC 表型，刺激 ECM 产生[27-28]。DiFederico 等[29]验证了上述观点，还发现双轴刺激更能提高 CC 的生物合成活性。研究表明旋转引起的 FSS 比平移引起的更能促进基质的合成[30]。接下来我们可以研究多轴加载或不同形式引起的 FSS 对 CC 活性的具体作用机制。关于 FSS 对 CC 代谢的影响详见表 3。
表3
FSS 对 CC 代谢的影响
Table3.
Effect of fluid shear stress on metabolism of chondrocytes in vitro
1.4 压缩力
当关节移动时，关节面的相互触碰挤压导致软骨关节面上下受力形成压缩力（compression stress，CS）。研究表明中度动态 CS（30～40 psi）能够促进 ECM 合成，超过 40 psi 的静态 CS 则表现为 ECM 降解，甚至出现炎症迹象的骨关节炎（osteoarthritis，OA）样 CC，这表明低于 40 psi 的动态 CS 对培养 CC 更有利[31]。Diao[32]也表示动态 CS 能够刺激性别决定基因盒 9（sex-determining region Y box 9，SOX9）和下调基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）13 的表达来抑制分解代谢。
一些学者认为在低应变（< 20%）下，CS 能够促进未分化细胞向 CC 分化[33-34]。而在高应变（> 20%）下，CS 会引起细胞肥大和纤维化，促进炎症的产生[35]。但 Scholtes 等[36]发现间歇加载和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）似乎能够缓解高应变 CS 对 CC 表型的破坏，甚至能够通过 MAPK、Wnt 和 Notch 信号通路的相关因子上调 SOX9 的表达。还有研究发现短时间的加载培养（1～4 h/d）比长时间（> 12 h/d）更能促进 ECM 的合成[37]。
Iseki 等[38]认为动态 CS 比 FSS 更能促进微骨折中新组织软骨的生成和成熟。Scholtes 等[36]在基因调控上也发现了类似的趋势，动态 CS 能够显著提高 SOX9 和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的基因表达，对早期软骨的形成具有重要意义。未来可以进一步探索动态 CS 对 CC 去分化的机制研究。关于 CS 对体外 CC 代谢的影响详见表 4。
表4
CS 对体外 CC 代谢的影响
Table4.
Effect of compression stress on metabolism of chondrocytes in vitro
2 其他机械刺激
2.1 低强度脉冲超声
低强度脉冲超声（low intensity pulsed ultrasound，LIPUS）能够产生机械振动作用，促进细胞生长。大量研究已经证明 LIPUS 具有治疗软骨损伤的潜力，能够缓解软骨变形，促进骨折愈合[39-44]。Ito 等[45]表明高于 200 mW/cm2的 LIPUS 可导致细胞死亡，低于 120 mW/cm2的 LIPUS 可以促进软骨细胞存活。其中，强度小于 100 mW/cm2、振荡频率 1.5 MHz ± 10%、脉冲频率 1 kHz、20 min/d 的 LIPUS 已得到广泛的研究和应用[46-50]。Uddin 等[46]发现无论有没有 IL-1β 的刺激，LIPUS 都能维持软骨表型甚至提高 ECM 的合成，LIPUS 本身是否对细胞骨架或软骨再生有一定的积极作用还需要进一步的研究。
LIPUS 可以使钙离子通过瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族（transient receptor potential vanilloid，TRPV）4 内流并激活 MAPK 信号通路，促进结缔组织生长因子（CCN family protein 2/connective tissue growth factor，CCN2/CTGF）的产生，从而促进软骨再生[47]，抑制 IL-1β 诱导的 NF-κB-p65 磷酸化来缓解基质的降解[46]，或刺激蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）磷酸化激活 PI3K/Akt 转导通路来促进 ECM 的合成[48]，这些信号通路都为 OA 的治疗提供了新的思路，将来的研究中还需要广大学者的探索和发现。
2.2 微重力
MG 会严重影响软骨的完整性，所以失重对 CC 的影响不可忽略[51]。由于飞行试验的昂贵和有限性，国内外对体内 MG 的相关研究较少。目前较为认可的地面模拟 MG 的生物反应器有随机定位机（random positioning machine，RPM）、旋转细胞培养系统（rotary cell culture system，RCCS）和旋转壁式生物反应器（rotating wall vessel，RWV）等。我们发现在模拟 MG 过程中，不同转速、角度、持续时间对细胞产生的力学大小及影响在很大程度上尚不明确。
研究表明在 MG 下，CC 聚集成团且呈悬浮状态时，比贴壁状态更有利于维持软骨表型[52]。Mellor 等[18]发现 MG 能够抑制 ASCs 向 CC 分化，且与 Wnt 信号通路密切相关。但在加入诱导因子或细胞基质衍生物后促进了 BMSCs 向 CC 分化，这表明 MG 环境可能不利于细胞分化，需要在外源性因子的干预下才有促分化能力[53-54]。有报道称通过 30 d 的 MG，CC 表现出聚集蛋白多糖（aggrecan，ACAN）的减少，但胶原纤维仍保持完整，这说明 30 d 内的软骨退变是可能逆转的[55]，但对更长时间的 MG 培养及相关机制并无进一步的研究，广大学者将来可以做深入的探索。
2.3 电磁场
电磁场（electromagnetic field，EMF）是一种在较高频率下能够刺激生物组织中生物电流的电磁能[56]。目前大多数 EMF 对软骨细胞的研究采用每天 30 min 至 8 h 的加载时间，0.4～5 mT 场强，频率小于 100 Hz[56-57]。
Anbarasan 等[57]对超低场强（0.65～1.95 μT）EMF 进行研究，发现 CC 活性与场强呈正相关。Parate 等[58]对低场强（0～5 mT）EMF 做了更细致的研究，发现 2 mT、10 min 是间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向 CC 分化的优势参数，而长期反复加载反而不利于 CC 形成，这可能与 EMF 在 CC 形成的早期和晚期激活了不同的钙离子内流途径［如瞬时受体电位离子通道（transient receptor potential ion channels，TRPs）］有关。Escobar 等[59]对 2 mT EMF 进行了不同时间的加载，发现加载 3 h 可以促进 CC 增殖，5 h 可以促进糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）合成。以上研究表明 2 mT 场强是 CC 的优势参数，接下来研究人员可以就更长的加载时间探索 EMF 对 CC 代谢的影响。
有学者表明 EMF 刺激对退化或不理想的 CC 更加有效，这说明 EMF 效应不仅与 EMF 有关，还与细胞质量有关[60]。Zhou 等[61]对 OA 鼠模型进行 EMF 后发现，EMF 对 CC 的有效作用可能是通过调节 MMP13 和部分通过抑制 MAPK 信号途径来介导的。将来学者可以就这一效应的临床相关性进行下一步的研究。
3 总结与展望
综上所述，机械刺激对软骨细胞内稳定的发展和维持起到举足轻重的作用，尤其在调控软骨细胞代谢的过程中（见图 1）。构建一个功能性软骨模型首先应满足细胞代谢的要求，其次在模拟关节运动时，对软骨施加合适的机械刺激，实现其功能构建。在体外研究中，总结与软骨发育、分化和代谢相关的力学物理参数，有助于开发更为精准的软骨替代策略，同样也有助于最大限度地诱导软骨形成，促进 CC 的增殖以加快修复软骨损伤。
图1
机械刺激调控软骨细胞代谢的加载参数
Figure1.
Loading parameters of mechanical stimulation for regulating chondrocyte metabolism
然而，由于体外实验的局限性，仍有一些问题尚待解决：（1）虽然大量文献已经表明适当的机械刺激可改善 CC 表型或促进 CC 增殖，但仍无法完全模拟体内 CC 的力学环境。（2）由机械刺激引起的 CC 相关基因及蛋白表达的改变，其机制尚不完全明了。（3）软骨细胞所处的生化微环境也是一个重要而复杂的影响因素，应当充分考虑机械和生化因素的协同作用。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
引言
关节软骨（articular cartilage，AC）内在修复能力有限，因此一旦损伤就难以恢复。虽然临床用于治疗关节软骨损伤的方法有很多，包括软骨下骨钻孔术、全关节置换术以及微骨折术等多种方式，但仍存在诸多缺点。近年来，随着软骨组织工程（cartilage tissue engineering，CTE）的发展，自体软骨移植术得到了广泛应用，但体外培养的软骨细胞（chondrocyte，CC），其生物力学特性与天然软骨存在较大差异。天然软骨在关节运动过程中会与关节腔内的液体产生多种机械刺激，这些机械刺激可以通过细胞外基质（extracellular matrix，ECM）周围的机械传感器传递机械信号，从而直接或间接调控 CC 的活性和行为[1]。
由于体内机械环境的复杂性和 CC 对机械刺激的高度敏感性，如何模拟体内的机械环境使之达到对 CC 代谢的积极效应，成为目前体外培养 CC 的一大难点[2]。因此，为了进一步研究机械刺激对 CC 代谢的影响，本综述将从不同机械形式出发，阐述牵张力、静水压力、流体剪切力、压缩力、低强度脉冲超声、微重力、电磁场对 CC 分化代谢的作用，从而寻求并优化培养组织工程 CC 的潜在策略。
1 主要机械刺激
1.1 牵张力
牵张力（tensile strain，TS）是体内最为常见的内力，是近年来研究的热点[3]。有报道表明低强度（0～1%）应变、1 Hz 的 TS 能够促进骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）向 CC 分化，且软骨形成标志物的表达随时间的延长而上调[4]。也有研究发现加载中强度（2%～10%）应变、0.16～0.5 Hz 的 TS 可以促进 CC 合成[5-7]。一些学者认为这可能是通过激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）和抑制核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）-p65 的核转运来减轻软骨损伤[8]。但 Zhong 等[9]对兔 CC 进行 10% 应变的 TS 后，却发现 CC 表型被破坏，这可能与 TS 激活粘附斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）-丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号，从而上调炎症因子的表达有关[10]。Liu 等[7]表明在中度 TS 加载下，浅层 CC 更能维持细胞表型，延缓细胞衰老。而高强度（> 10%）应变、0.5 Hz 的 TS 常常会抑制 CC 表型的形成，引起基质的降解[6, 11-12]。但 Lohberger 等[13]发现交替加载低、高强度的 TS 反而能够显著减少基质的降解，从而降低对 CC 表型的破坏。如何联合加载低、中、高强度的 TS 使之促进 CC 增殖还需要广大研究者的不断探索。关于 TS 对体外 CC 代谢的影响详见表 1。
表1
TS 对体外 CC 代谢的影响
Table1.
Effect of tensile strain on metabolism of chondrocytes in vitro
1.2 静水压力
静水压力（hydrostatic pressure，HP）是作用于 CC 的主要力学刺激之一。低 HP（0～10 MPa）能够通过整联蛋白-FAK-细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）/磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）途径增强 CC 活性并减少其凋亡[14]。姚旺祥等[15]认为它还可以减少 MAPK 信号通路蛋白的表达来保护 ECM 的合成。研究表明高 HP（> 10 MPa）会显著增加应激及凋亡相关基因的表达，特别是加载 4 h 后，不利于维持细胞表型和基质的合成[16]。
单独施加 HP，比微重力（microgravity，MG）和流体剪切力（fluid shear stress，FSS）更能促进 ECM 的形成，甚至比 HP 和偏应力的联合使用更能促进 CC 表型形成，但三者皆有软骨保护作用，可以通过下调 COL10 的表达来抑制细胞肥大，减少细胞凋亡[17-19]。部分研究表明短时间（1～4 h/d）内加载的低 HP 对促进 CC 形成或抑制 CC 肥大来说可能是优势参数[17-18, 20]。另外，Ogura 等[21]发现重复间歇加载 HP 对 CC 的合成代谢和活性的影响可能更大。如果在短时间内进行重复间歇加载是否会对 CC 更有利目前尚无研究，未来可进一步探索。关于 HP 对体外 CC 代谢作用的影响详见表 2。
表2
HP 对体外 CC 代谢作用的影响
Table2.
Effect of hydrostatic pressure on metabolism of chondrocytes in vitro
1.3 流体剪切力
当关节处于运动状态时，被挤压的滑液对 CC 表面会产生 FSS。研究表明低强度（< 10 dyn/cm2）FSS 能够抑制白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）激活的 NF-κB，保护软骨运动[22]。但 Zhang 等[23]发现对正常 CC 加载低强度 FSS，会引起 CC 的终末分化和纤维化，说明 FSS 对正常 CC 没有治疗作用。Su 等[24]在研究 FSS 对抵抗素诱导的环氧化酶（cyclooxygenase，COX）-2 的作用时发现，在抵抗素诱导前后加载 FSS，COX2 的表达呈相反趋势，说明 FSS 对 CC 代谢的影响是多方向的。有报道认为中强度（> 12 dyn/cm2）FSS 会促进基质降解，抑制 CC 表型合成[23]。Adeniran-Catlett 等[25]却表示中强度 FSS 的施加并不会抑制 BMSCs 向 CC 分化的能力。
Kuang 等[26]表明高强度（> 20 dyn/cm2）FSS 会导致 CC 退化，促进破骨细胞性骨吸收。有学者在 BMSCs 上也发现了类似的结论，认为高强度 FSS 会抑制软骨表型的形成，引起 CC 退化[27]。另外，CS 和 FSS 在一定参数下联合加载能够增强 CC 表型，刺激 ECM 产生[27-28]。DiFederico 等[29]验证了上述观点，还发现双轴刺激更能提高 CC 的生物合成活性。研究表明旋转引起的 FSS 比平移引起的更能促进基质的合成[30]。接下来我们可以研究多轴加载或不同形式引起的 FSS 对 CC 活性的具体作用机制。关于 FSS 对 CC 代谢的影响详见表 3。
表3
FSS 对 CC 代谢的影响
Table3.
Effect of fluid shear stress on metabolism of chondrocytes in vitro
1.4 压缩力
当关节移动时，关节面的相互触碰挤压导致软骨关节面上下受力形成压缩力（compression stress，CS）。研究表明中度动态 CS（30～40 psi）能够促进 ECM 合成，超过 40 psi 的静态 CS 则表现为 ECM 降解，甚至出现炎症迹象的骨关节炎（osteoarthritis，OA）样 CC，这表明低于 40 psi 的动态 CS 对培养 CC 更有利[31]。Diao[32]也表示动态 CS 能够刺激性别决定基因盒 9（sex-determining region Y box 9，SOX9）和下调基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）13 的表达来抑制分解代谢。
一些学者认为在低应变（< 20%）下，CS 能够促进未分化细胞向 CC 分化[33-34]。而在高应变（> 20%）下，CS 会引起细胞肥大和纤维化，促进炎症的产生[35]。但 Scholtes 等[36]发现间歇加载和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）似乎能够缓解高应变 CS 对 CC 表型的破坏，甚至能够通过 MAPK、Wnt 和 Notch 信号通路的相关因子上调 SOX9 的表达。还有研究发现短时间的加载培养（1～4 h/d）比长时间（> 12 h/d）更能促进 ECM 的合成[37]。
Iseki 等[38]认为动态 CS 比 FSS 更能促进微骨折中新组织软骨的生成和成熟。Scholtes 等[36]在基因调控上也发现了类似的趋势，动态 CS 能够显著提高 SOX9 和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的基因表达，对早期软骨的形成具有重要意义。未来可以进一步探索动态 CS 对 CC 去分化的机制研究。关于 CS 对体外 CC 代谢的影响详见表 4。
表4
CS 对体外 CC 代谢的影响
Table4.
Effect of compression stress on metabolism of chondrocytes in vitro
2 其他机械刺激
2.1 低强度脉冲超声
低强度脉冲超声（low intensity pulsed ultrasound，LIPUS）能够产生机械振动作用，促进细胞生长。大量研究已经证明 LIPUS 具有治疗软骨损伤的潜力，能够缓解软骨变形，促进骨折愈合[39-44]。Ito 等[45]表明高于 200 mW/cm2的 LIPUS 可导致细胞死亡，低于 120 mW/cm2的 LIPUS 可以促进软骨细胞存活。其中，强度小于 100 mW/cm2、振荡频率 1.5 MHz ± 10%、脉冲频率 1 kHz、20 min/d 的 LIPUS 已得到广泛的研究和应用[46-50]。Uddin 等[46]发现无论有没有 IL-1β 的刺激，LIPUS 都能维持软骨表型甚至提高 ECM 的合成，LIPUS 本身是否对细胞骨架或软骨再生有一定的积极作用还需要进一步的研究。
LIPUS 可以使钙离子通过瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族（transient receptor potential vanilloid，TRPV）4 内流并激活 MAPK 信号通路，促进结缔组织生长因子（CCN family protein 2/connective tissue growth factor，CCN2/CTGF）的产生，从而促进软骨再生[47]，抑制 IL-1β 诱导的 NF-κB-p65 磷酸化来缓解基质的降解[46]，或刺激蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）磷酸化激活 PI3K/Akt 转导通路来促进 ECM 的合成[48]，这些信号通路都为 OA 的治疗提供了新的思路，将来的研究中还需要广大学者的探索和发现。
2.2 微重力
MG 会严重影响软骨的完整性，所以失重对 CC 的影响不可忽略[51]。由于飞行试验的昂贵和有限性，国内外对体内 MG 的相关研究较少。目前较为认可的地面模拟 MG 的生物反应器有随机定位机（random positioning machine，RPM）、旋转细胞培养系统（rotary cell culture system，RCCS）和旋转壁式生物反应器（rotating wall vessel，RWV）等。我们发现在模拟 MG 过程中，不同转速、角度、持续时间对细胞产生的力学大小及影响在很大程度上尚不明确。
研究表明在 MG 下，CC 聚集成团且呈悬浮状态时，比贴壁状态更有利于维持软骨表型[52]。Mellor 等[18]发现 MG 能够抑制 ASCs 向 CC 分化，且与 Wnt 信号通路密切相关。但在加入诱导因子或细胞基质衍生物后促进了 BMSCs 向 CC 分化，这表明 MG 环境可能不利于细胞分化，需要在外源性因子的干预下才有促分化能力[53-54]。有报道称通过 30 d 的 MG，CC 表现出聚集蛋白多糖（aggrecan，ACAN）的减少，但胶原纤维仍保持完整，这说明 30 d 内的软骨退变是可能逆转的[55]，但对更长时间的 MG 培养及相关机制并无进一步的研究，广大学者将来可以做深入的探索。
2.3 电磁场
电磁场（electromagnetic field，EMF）是一种在较高频率下能够刺激生物组织中生物电流的电磁能[56]。目前大多数 EMF 对软骨细胞的研究采用每天 30 min 至 8 h 的加载时间，0.4～5 mT 场强，频率小于 100 Hz[56-57]。
Anbarasan 等[57]对超低场强（0.65～1.95 μT）EMF 进行研究，发现 CC 活性与场强呈正相关。Parate 等[58]对低场强（0～5 mT）EMF 做了更细致的研究，发现 2 mT、10 min 是间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向 CC 分化的优势参数，而长期反复加载反而不利于 CC 形成，这可能与 EMF 在 CC 形成的早期和晚期激活了不同的钙离子内流途径［如瞬时受体电位离子通道（transient receptor potential ion channels，TRPs）］有关。Escobar 等[59]对 2 mT EMF 进行了不同时间的加载，发现加载 3 h 可以促进 CC 增殖，5 h 可以促进糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）合成。以上研究表明 2 mT 场强是 CC 的优势参数，接下来研究人员可以就更长的加载时间探索 EMF 对 CC 代谢的影响。
有学者表明 EMF 刺激对退化或不理想的 CC 更加有效，这说明 EMF 效应不仅与 EMF 有关，还与细胞质量有关[60]。Zhou 等[61]对 OA 鼠模型进行 EMF 后发现，EMF 对 CC 的有效作用可能是通过调节 MMP13 和部分通过抑制 MAPK 信号途径来介导的。将来学者可以就这一效应的临床相关性进行下一步的研究。
3 总结与展望
综上所述，机械刺激对软骨细胞内稳定的发展和维持起到举足轻重的作用，尤其在调控软骨细胞代谢的过程中（见图 1）。构建一个功能性软骨模型首先应满足细胞代谢的要求，其次在模拟关节运动时，对软骨施加合适的机械刺激，实现其功能构建。在体外研究中，总结与软骨发育、分化和代谢相关的力学物理参数，有助于开发更为精准的软骨替代策略，同样也有助于最大限度地诱导软骨形成，促进 CC 的增殖以加快修复软骨损伤。
图1
机械刺激调控软骨细胞代谢的加载参数
Figure1.
Loading parameters of mechanical stimulation for regulating chondrocyte metabolism
然而，由于体外实验的局限性，仍有一些问题尚待解决：（1）虽然大量文献已经表明适当的机械刺激可改善 CC 表型或促进 CC 增殖，但仍无法完全模拟体内 CC 的力学环境。（2）由机械刺激引起的 CC 相关基因及蛋白表达的改变，其机制尚不完全明了。（3）软骨细胞所处的生化微环境也是一个重要而复杂的影响因素，应当充分考虑机械和生化因素的协同作用。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
