将分离到的1株对地塞米松有降解作用的产碱假单胞菌进一步驯化。采用渗透休克法分离该菌各区域蛋白,将分离的具有高酶活性的胞内蛋白用硫酸铵盐析、离子交换层析和葡聚糖凝胶层析提取和纯化。纯化蛋白用HPLC检测其对地塞米松的降解活性,酶切后质谱鉴定。结果表明驯化后的产碱假单胞菌对地塞米松的降解率从23.63%提高到52.84%,降解地塞米松的酶主要存在于该菌胞质内,分子量约为41 kD;纯化后的酶蛋白比活力达到1.02 U·mg-1,该蛋白的5条肽段的氨基酸序列与异戊酰辅酶A脱氢酶的部分序列匹配,可能是一种新的甾体类化合物降解酶。本文为用微生物修复技术清除水环境的地塞米松污染提供了新策略。
引用本文： 朱黎黎, 杨致邦, 杨茜, 石中全, 邓西川. 一种产碱假单胞菌产生的地塞米松降解酶的提取纯化和鉴定. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(5): 1044-1049. doi: 10.7507/1001-5515.20150185 复制
引言
近年来，面对环境激素的严重污染和危害，国内外学者开始探索利用微生物自身的代谢过程来降解污染物，并以研究降解的关键酶为主[1]。地塞米松(dexamethasone)是以天然的氢化可的松为原料人工合成的长效皮质激素，临床常用制剂为易溶于水的地塞米松磷酸钠(dexamethasone sodium phosphate)。地塞米松类药物是世界范围内临床上广泛应用的激素，常用于临床各科多种疾病的治疗。在应用过程中，地塞米松类药物的残液可经各种途径污染环境，特别是医院的废水，也可从应用者体内经分泌液和尿液排出，污染更广泛的水环境[2]。国内外多篇资料报道，在医院废水、城市污水及江水中存在不同程度的地塞米松及其它糖皮质类激素污染[3-4]。目前，医院废水的处理主要采用的是物理、生物化学和消毒的方法，这些方法可清除废水中的病原体、放射性物质、重金属等，但尚未对激素类污染物进行有效处理[5]，也未见清除废水中地塞米松以及其它糖皮质类激素的方法和制剂的报道。本文在从污染地塞米松的医院废水中分离到1株可降解地塞米松磷酸钠和地塞米松的产碱假单胞菌(本文中简称降解菌)的基础上[6]，提取、纯化和鉴定其降解地塞米松的酶，为制备清除环境中地塞米松类药物污染的生物净化剂，甚至消除应用地塞米松类药物的临床副作用提供新策略。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与主要培养基
降解地塞米松磷酸钠和地塞米松的产碱假单胞菌(2012YZB2)为本实验室分离后保存，并同时保藏于中国典型培养物保藏中心，编号CCTCCNO：M2014231;该菌对地塞米松磷酸钠的转化率为50.86%，对地塞米松的降解率为23.63%[6]。缺碳培养基，成分为K2HPO4 1.6 g，KH2PO4 0.4 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1g，(NH4)2SO4 0.5 g[7]，为本实验室配制。LB(Luria-Bertani)固体培养基干粉为青岛海博生物技术有限公司售品，按说明书配制；地塞米松磷酸钠培养液为在缺碳培养液中加入500 μg/mL地塞米松磷酸钠，于使用前配制。
1.1.2 其它实验材料与仪器
Agilent1100高效液相色谱系统，美国Agilent公司；KQ-3200E型超声仪，江苏医疗仪器厂；垂直电泳仪，美国BIO-RAD公司；蛋白质谱分析仪(4800 Plus MALDI TOF/TOFTM)，ABI Foster City公司；地塞米松磷酸钠、地塞米松(HPLC用纯品，批号：100016-201015)，Sigma公司；阴离子交换纤维素(DEAE-52)、葡聚糖凝胶(Sephadex G-100)、层析柱(1×30 cm)、透析袋(孔径为0.45 μm)和Ziptip过滤器均购于重庆韵博科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 降解菌的进一步驯化
为提高降解菌对地塞米松的降解率，以利于提取降解酶，将降解菌进一步驯化。取LB琼脂平板上生长的降解菌菌落，参照Wang等[6]的方法反复驯化10次，再将培养的菌液转种LB平板，置37℃培养2 d后，取平板上生长的菌落，用新配制的地塞米松磷酸钠培养液配成4.2×109 cfu/mL浓度的菌液。取1 mL菌液加入含9 mL新配制的地塞米松磷酸钠培养基液中，同时以不加菌液的含10 mL新配制的地塞米松磷酸钠培养液为对照培养液，37 ℃培养15 d后，以新配制的含280 μg/mL地塞米松磷酸钠的甲醇溶解液为标准液，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定对照培养液、培养液中的地塞米松磷酸钠和地塞米松，以色谱图中的峰面积计算其含量[6]。通过公式计算出降解率：地塞米松磷酸钠降解率(%)=(对照培养液地塞米松磷酸钠浓度－降解菌培养液地塞米松磷酸钠浓度)÷对照培养液地塞米松磷酸钠浓度×100%；降解菌降解地塞米松为其它物质的降解率(%)=(降解菌培养液地塞米松磷酸钠降解量－降解菌培养液地塞米松含量)×地塞米松磷酸钠分子量÷地塞米松分子量÷降解菌地塞米松磷酸钠降解量×100%。
1.2.2 降解酶的提取
参照Quan等[8]方法采用渗透休克法分离降解菌各区域蛋白质。取在地塞米松磷酸钠培养液中最佳生长时期的降解菌菌液[6]，4 ℃、6 000 r/min离心10 min,取上清液(A1)冻存。将沉淀液(B1)用0.05 mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液5 mL重悬，4℃、6 000 r/min离心10 min，用相同缓冲液洗涤2次，取上清液(A2)冻存。其沉淀液(B2)再用20%蔗糖重悬，于37℃震荡10 min，4 ℃、15 000 r/min离心10 min，取上清液(A3)冻存，其沉淀液(B3)用于提取周质蛋白。将冻存的上清液A1、A2和A3混合，即含该菌的胞外蛋白质。将沉淀液(B3)用冷冻双蒸水重悬，在冰浴中震荡10 min后，4 ℃、15 000 r/min离心10 min，取上清液(A4)即含该菌的周质蛋白；将其沉淀液(B4)用0.01 mol/mL、pH 7.5的Tris-HCl重悬，在冰浴中超声破碎细菌，破碎条件为：破碎时间4 s，间隔10 s，重复10次，功率200 W。将碎菌液4 ℃、15 000 r/min离心20 min，取上清液(A5)即含该菌的胞内蛋白质；弃去沉淀。用BCA法测定各区域分离液的蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，凝胶图像分析仪分析其蛋白成分。
分别取分离的各区域蛋白液400 μL，加入400 μL含500 μg/mL地塞米松甲醇溶解液的pH7.5Tris-HCl缓冲液中，37 ℃作用24 h，100 ℃水浴终止反应。以加500 μg/mL地塞米松的相同缓冲液为空白对照，用HPLC检测对照液和试验液中地塞米松含量。以比活力(U·mg-1)为评价标准，即每毫克蛋白中所含的酶活性单位；1个酶活性单位(U)为在pH 7.5、37 ℃条件下，1 min内降解地塞米松的微克量。
1.2.3 降解酶的纯化
取胞内蛋白液，分别用含20%、30%、40%、50%、60%硫酸铵的溶液分级沉淀24 h后，4 ℃、15 000 r/min离心20 min，将上清液再分别用在前述浓度各增加10%硫酸铵的溶液再沉淀24 h，4 ℃、15 000 r/min离心20 min，弃上清液，其沉淀液用pH 7.5的Tris-HCl液溶解重悬[9]。用HPLC分别检测用不同浓度硫酸铵沉淀的蛋白液对地塞米松的降解作用，并计算酶活性，以确定胞内蛋白液盐析的最适硫酸铵浓度。
先用DEAE-52对硫酸铵盐析后的蛋白液进行层析。将DEAE-52用0.5 mol/mL的氢氧化钠与0.5 mol/mL的盐酸反复膨胀活化直到中性，再将膨胀活化后的DEAE-52凝胶缓慢倒入层析柱，用pH 7.5的Tris-HCl缓冲液平衡2 h，再加入用最适硫酸铵盐析后的蛋白液。待蛋白液全部进入DEAE-52柱后，再用两倍柱体积的相同缓冲液洗脱未结合蛋白，然后用0~0.5 mol/mL的氯化钠液进行梯度洗脱，流速为0.4 mL/min，回收洗脱液，并检测洗脱液的酶活性。将有酶活性的洗脱液混合后用包有聚乙二醇粉末的透析袋进行浓缩[10]，取浓缩后的酶蛋白用SDS-PAGE电泳检测其纯度。最后用Sephadex G-100层析浓缩后的酶蛋白。先将膨胀活化后的Sephadex G-100凝胶缓慢倒入层析柱中，然后用pH 7.5的Tris-HCl缓冲液平衡2 h，再加入浓缩后的酶蛋白。待样品完全进入层析柱后，用相同缓冲液洗脱蛋白，流速为0.5 mL/min，回收洗脱液，检测洗脱液中的酶活性。将有酶活性的洗脱液混合,用前述方法浓缩，SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度，HPLC检测纯化蛋白对地塞米松的降解作用，计算酶活性。
1.2.4 纯化蛋白的酶切及质谱鉴定
将纯化后的蛋白液经SDS-PAGE电泳的蛋白条带切下,用200 μL浓度为100 mmol/L的NH4HCO3乙腈脱色后，将凝胶冻干，加入胰蛋白酶，37 ℃反应20 h,再加入60%乙腈与0.1%三氟乙酸的混合液100 μL，超声15 min后，用Ziptip过滤器进行脱盐，然后质谱分析。质谱分析仪激光源的波长为355 nm，加速电压为2 kV。采用正离子和自动获取数据的模式采集数据，肽指纹图谱质量扫描范围为800~4 000 Da，用信噪比大于50的母离子进行二级质谱(MS/MS)分析。每个样品点上选择8个母离子，MS/MS激光激发2 500次，碰撞能量为2 kV。将质谱分析后的数据用MSCOT收索引擎检索鉴定。在检索过程中，系统根据提供的肽段数量和匹配率综合考虑，得出一个分值，若该分值大于61分为可信，小于61分则为不可信[11]。
2 结果
2.1 降解菌驯化后的降解作用
HPLC检测结果显示，进一步驯化后的降解菌对地塞米松磷酸钠的降解率从驯化前的50.86%[6]提高到97.96%，将地塞米松降解为其它物质的降解率从驯化前的23.63%[6]提高到52.84%，HPLC检测结果如图 1所示。
图1
降解菌对地塞米松磷酸钠降解作用
Figure1.
Effect of degrading bacteria on dexamethasone sodium phosphate
2.2 降解菌各区域蛋白的酶活性
用渗透休克法从降解菌各区域分离到的蛋白液经SDS-PAGE电泳分析显示,各区域均有大量不同分子量的蛋白质，以分离的胞外液含量最高，其次为胞内液，周质液最少，如图 2所示。通过对地塞米松降解率以及酶活性的检测，降解菌中的地塞米松降解酶活性主要分布在胞内液中，其降解率为36%，其HPLC检测图，如图 3所示。周质液中酶活性较少，胞外液中未检测到酶活性。各区域蛋白液对地塞米松的降解率、酶活性、比活力如表 1所示。
表1
降解菌中地塞米松降解酶的分布
Table1.
Localization of degrading enzymes for dexamethasone
图2
降解菌各部位蛋白的SDS-PAGE电泳分析
1：胞外蛋白；2：周质蛋白；3：胞内蛋白；M：蛋白marker
Figure2. SDS-PAGE analysis of proteins of every position in the bacteria1: extracellular protein; 2: periplasm protein; 3: intracellular protein; M: protein marke
图3
胞内蛋白降解地塞米松的高效液相色谱图谱
Figure3.
HPLC chromatogram of the degradation to dexamethasone of the intracellular
2.3 降解酶的提取与纯化
用不同浓度的硫酸铵盐析含有降解酶活性的胞内液，结果显示最适盐析浓度为30%~40%。用最适硫酸铵浓度盐析、DEAE-52层析、Sephadex G-100层析后，随着胞内液酶活性蛋白的提取和逐步层析，虽然蛋白含量和总的酶活性逐渐减少，但比活力明显增高，如表 2所示。SDS-PAGE分析显示，硫酸铵盐析后还存在大量蛋白带，DEAE-52层析后存在少量蛋白带，Sephadex-100层析后只剩1条蛋白带，分子量大约为41 KD，如图 4所示，其纯度约为96%，表明已获得具有较高纯度的蛋白酶。
表2
各纯化步骤中降解酶的活性
Table2.
Enzymatic active in every steps of purification
图4
纯化蛋白的SDS-PAGE电泳分析
M：蛋白marker；1：硫酸铵盐析液；2：DEAE-52层析；3：Sephadex-100层析
Figure4. SDS-PAGE analysis of the purified proteinM: protein marker; 1： protein after salting-out; 2: protein after DEAE-52; 3: protein after Sephadex-100
2.4 质谱鉴定结果
纯化后的41 kD蛋白带经酶切后质谱分析，获得多条肽段的氨基酸序列数据。用MSCOT收索引擎检索鉴定，结果显示该蛋白有五条肽段与异戊酰辅酶A脱氢酶(NCBI，WP-010487056)的部分氨基酸序列完全匹配，覆盖率为56%，其得分为273分，P＜0.05，鉴定为可信。匹配的5条肽段的氨基酸序列分别为：A: MHVPSLNFDLGEDIDLLR；B: RHQFGEAIGSFQLIQGKI；C: RAYVYAVARA；D: KATWLTGQAIQILGGNGYINEYPTGRL；E: KLYEIGAGTSEIRR。匹配肽段的二级质谱(MS/MS)图如图 5所示。
图5
匹配肽段的MS/MS质谱图
Figure5.
MS/MS spectrogram of matched peptides
3 讨论
本实验为获得更多的地塞米松降解酶，先将分离到的地塞米松降解菌进一步驯化，经多次驯化培养后，降解菌对地塞米松的降解作用明显提高。为探讨降解菌的地塞米松降解酶产生的部位，采用渗透休克法提取降解菌的各区域蛋白质。渗透休克法的基本原理是革兰阴性菌在液体环境突然发生渗透压改变时，细菌出现质璧分离，再突然降温，使外膜破裂而释放出周质蛋白[8]。对降解菌各区域蛋白的降解酶活性检测结果显示其酶活性主要存在于胞内液中，因此，对地塞米松降解酶的进一步提取和纯化均采用胞内液。
因为地塞米松难溶于水，若用甲醇等溶解地塞米松后再加入培养基中，会影响细菌的生长；但在对酶的活性检测中，虽然用甲醇溶解地塞米松，但量少，并不影响酶的活性。因此本实验在细菌的培养中仅应用了地塞米松磷酸钠培养基，而在酶活性检测中，还应用了地塞米松。经硫酸铵盐析后的蛋白液，虽然降解酶的活性较高，但酶的纯度不高。为了进一步提高酶的纯度，采用了蛋白纯化最有效的离子交换层析和葡聚糖凝胶层析相结合的方法进一步纯化。离子交换蛋白层析的基本原理是带电的蛋白质和离子交换剂的基团进行交换而被分离纯化[12]，葡聚糖凝胶层析的基本原理是以多孔珠为固定相，根据蛋白的不同分子大小而对蛋白进行分离纯化。纯化后的蛋白液虽然酶的活性有所降低，但是纯度提高了19.62倍。
Tanaka等[13]发现异戊酰辅酶A脱氢酶可以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅助因子将异戊酰辅酶A脱氢为3-甲基巴豆酰辅酶A，Forster等[14-15]在铜绿假单胞菌中也发现了异戊酰辅酶A脱氢酶，该酶在有机物的利用中，起着关键的作用。本文提取纯化的蛋白酶经质谱鉴定，再与蛋白数据库对比结果表明，纯化后蛋白有5条肽段的氨基酸序列与异戊酰辅酶A脱氢酶的部分氨基酸序列完全匹配，覆盖率为56%，由此可推断该酶具有与异戊酰辅酶A脱氢酶相似的功能，但其氨基酸序列尚存在44%的不匹配，由此推测可能是一种新的甾体类化合物降解酶。本文的结果为采用微生物修复技术清除水环境污染的地塞米松磷酸钠和地塞米松，以及治理其它甾体类化合物的环境污染提供了一种新策略。
引言
近年来，面对环境激素的严重污染和危害，国内外学者开始探索利用微生物自身的代谢过程来降解污染物，并以研究降解的关键酶为主[1]。地塞米松(dexamethasone)是以天然的氢化可的松为原料人工合成的长效皮质激素，临床常用制剂为易溶于水的地塞米松磷酸钠(dexamethasone sodium phosphate)。地塞米松类药物是世界范围内临床上广泛应用的激素，常用于临床各科多种疾病的治疗。在应用过程中，地塞米松类药物的残液可经各种途径污染环境，特别是医院的废水，也可从应用者体内经分泌液和尿液排出，污染更广泛的水环境[2]。国内外多篇资料报道，在医院废水、城市污水及江水中存在不同程度的地塞米松及其它糖皮质类激素污染[3-4]。目前，医院废水的处理主要采用的是物理、生物化学和消毒的方法，这些方法可清除废水中的病原体、放射性物质、重金属等，但尚未对激素类污染物进行有效处理[5]，也未见清除废水中地塞米松以及其它糖皮质类激素的方法和制剂的报道。本文在从污染地塞米松的医院废水中分离到1株可降解地塞米松磷酸钠和地塞米松的产碱假单胞菌(本文中简称降解菌)的基础上[6]，提取、纯化和鉴定其降解地塞米松的酶，为制备清除环境中地塞米松类药物污染的生物净化剂，甚至消除应用地塞米松类药物的临床副作用提供新策略。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与主要培养基
降解地塞米松磷酸钠和地塞米松的产碱假单胞菌(2012YZB2)为本实验室分离后保存，并同时保藏于中国典型培养物保藏中心，编号CCTCCNO：M2014231;该菌对地塞米松磷酸钠的转化率为50.86%，对地塞米松的降解率为23.63%[6]。缺碳培养基，成分为K2HPO4 1.6 g，KH2PO4 0.4 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1g，(NH4)2SO4 0.5 g[7]，为本实验室配制。LB(Luria-Bertani)固体培养基干粉为青岛海博生物技术有限公司售品，按说明书配制；地塞米松磷酸钠培养液为在缺碳培养液中加入500 μg/mL地塞米松磷酸钠，于使用前配制。
1.1.2 其它实验材料与仪器
Agilent1100高效液相色谱系统，美国Agilent公司；KQ-3200E型超声仪，江苏医疗仪器厂；垂直电泳仪，美国BIO-RAD公司；蛋白质谱分析仪(4800 Plus MALDI TOF/TOFTM)，ABI Foster City公司；地塞米松磷酸钠、地塞米松(HPLC用纯品，批号：100016-201015)，Sigma公司；阴离子交换纤维素(DEAE-52)、葡聚糖凝胶(Sephadex G-100)、层析柱(1×30 cm)、透析袋(孔径为0.45 μm)和Ziptip过滤器均购于重庆韵博科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 降解菌的进一步驯化
为提高降解菌对地塞米松的降解率，以利于提取降解酶，将降解菌进一步驯化。取LB琼脂平板上生长的降解菌菌落，参照Wang等[6]的方法反复驯化10次，再将培养的菌液转种LB平板，置37℃培养2 d后，取平板上生长的菌落，用新配制的地塞米松磷酸钠培养液配成4.2×109 cfu/mL浓度的菌液。取1 mL菌液加入含9 mL新配制的地塞米松磷酸钠培养基液中，同时以不加菌液的含10 mL新配制的地塞米松磷酸钠培养液为对照培养液，37 ℃培养15 d后，以新配制的含280 μg/mL地塞米松磷酸钠的甲醇溶解液为标准液，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定对照培养液、培养液中的地塞米松磷酸钠和地塞米松，以色谱图中的峰面积计算其含量[6]。通过公式计算出降解率：地塞米松磷酸钠降解率(%)=(对照培养液地塞米松磷酸钠浓度－降解菌培养液地塞米松磷酸钠浓度)÷对照培养液地塞米松磷酸钠浓度×100%；降解菌降解地塞米松为其它物质的降解率(%)=(降解菌培养液地塞米松磷酸钠降解量－降解菌培养液地塞米松含量)×地塞米松磷酸钠分子量÷地塞米松分子量÷降解菌地塞米松磷酸钠降解量×100%。
1.2.2 降解酶的提取
参照Quan等[8]方法采用渗透休克法分离降解菌各区域蛋白质。取在地塞米松磷酸钠培养液中最佳生长时期的降解菌菌液[6]，4 ℃、6 000 r/min离心10 min,取上清液(A1)冻存。将沉淀液(B1)用0.05 mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液5 mL重悬，4℃、6 000 r/min离心10 min，用相同缓冲液洗涤2次，取上清液(A2)冻存。其沉淀液(B2)再用20%蔗糖重悬，于37℃震荡10 min，4 ℃、15 000 r/min离心10 min，取上清液(A3)冻存，其沉淀液(B3)用于提取周质蛋白。将冻存的上清液A1、A2和A3混合，即含该菌的胞外蛋白质。将沉淀液(B3)用冷冻双蒸水重悬，在冰浴中震荡10 min后，4 ℃、15 000 r/min离心10 min，取上清液(A4)即含该菌的周质蛋白；将其沉淀液(B4)用0.01 mol/mL、pH 7.5的Tris-HCl重悬，在冰浴中超声破碎细菌，破碎条件为：破碎时间4 s，间隔10 s，重复10次，功率200 W。将碎菌液4 ℃、15 000 r/min离心20 min，取上清液(A5)即含该菌的胞内蛋白质；弃去沉淀。用BCA法测定各区域分离液的蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，凝胶图像分析仪分析其蛋白成分。
分别取分离的各区域蛋白液400 μL，加入400 μL含500 μg/mL地塞米松甲醇溶解液的pH7.5Tris-HCl缓冲液中，37 ℃作用24 h，100 ℃水浴终止反应。以加500 μg/mL地塞米松的相同缓冲液为空白对照，用HPLC检测对照液和试验液中地塞米松含量。以比活力(U·mg-1)为评价标准，即每毫克蛋白中所含的酶活性单位；1个酶活性单位(U)为在pH 7.5、37 ℃条件下，1 min内降解地塞米松的微克量。
1.2.3 降解酶的纯化
取胞内蛋白液，分别用含20%、30%、40%、50%、60%硫酸铵的溶液分级沉淀24 h后，4 ℃、15 000 r/min离心20 min，将上清液再分别用在前述浓度各增加10%硫酸铵的溶液再沉淀24 h，4 ℃、15 000 r/min离心20 min，弃上清液，其沉淀液用pH 7.5的Tris-HCl液溶解重悬[9]。用HPLC分别检测用不同浓度硫酸铵沉淀的蛋白液对地塞米松的降解作用，并计算酶活性，以确定胞内蛋白液盐析的最适硫酸铵浓度。
先用DEAE-52对硫酸铵盐析后的蛋白液进行层析。将DEAE-52用0.5 mol/mL的氢氧化钠与0.5 mol/mL的盐酸反复膨胀活化直到中性，再将膨胀活化后的DEAE-52凝胶缓慢倒入层析柱，用pH 7.5的Tris-HCl缓冲液平衡2 h，再加入用最适硫酸铵盐析后的蛋白液。待蛋白液全部进入DEAE-52柱后，再用两倍柱体积的相同缓冲液洗脱未结合蛋白，然后用0~0.5 mol/mL的氯化钠液进行梯度洗脱，流速为0.4 mL/min，回收洗脱液，并检测洗脱液的酶活性。将有酶活性的洗脱液混合后用包有聚乙二醇粉末的透析袋进行浓缩[10]，取浓缩后的酶蛋白用SDS-PAGE电泳检测其纯度。最后用Sephadex G-100层析浓缩后的酶蛋白。先将膨胀活化后的Sephadex G-100凝胶缓慢倒入层析柱中，然后用pH 7.5的Tris-HCl缓冲液平衡2 h，再加入浓缩后的酶蛋白。待样品完全进入层析柱后，用相同缓冲液洗脱蛋白，流速为0.5 mL/min，回收洗脱液，检测洗脱液中的酶活性。将有酶活性的洗脱液混合,用前述方法浓缩，SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度，HPLC检测纯化蛋白对地塞米松的降解作用，计算酶活性。
1.2.4 纯化蛋白的酶切及质谱鉴定
将纯化后的蛋白液经SDS-PAGE电泳的蛋白条带切下,用200 μL浓度为100 mmol/L的NH4HCO3乙腈脱色后，将凝胶冻干，加入胰蛋白酶，37 ℃反应20 h,再加入60%乙腈与0.1%三氟乙酸的混合液100 μL，超声15 min后，用Ziptip过滤器进行脱盐，然后质谱分析。质谱分析仪激光源的波长为355 nm，加速电压为2 kV。采用正离子和自动获取数据的模式采集数据，肽指纹图谱质量扫描范围为800~4 000 Da，用信噪比大于50的母离子进行二级质谱(MS/MS)分析。每个样品点上选择8个母离子，MS/MS激光激发2 500次，碰撞能量为2 kV。将质谱分析后的数据用MSCOT收索引擎检索鉴定。在检索过程中，系统根据提供的肽段数量和匹配率综合考虑，得出一个分值，若该分值大于61分为可信，小于61分则为不可信[11]。
2 结果
2.1 降解菌驯化后的降解作用
HPLC检测结果显示，进一步驯化后的降解菌对地塞米松磷酸钠的降解率从驯化前的50.86%[6]提高到97.96%，将地塞米松降解为其它物质的降解率从驯化前的23.63%[6]提高到52.84%，HPLC检测结果如图 1所示。
图1
降解菌对地塞米松磷酸钠降解作用
Figure1.
Effect of degrading bacteria on dexamethasone sodium phosphate
2.2 降解菌各区域蛋白的酶活性
用渗透休克法从降解菌各区域分离到的蛋白液经SDS-PAGE电泳分析显示,各区域均有大量不同分子量的蛋白质，以分离的胞外液含量最高，其次为胞内液，周质液最少，如图 2所示。通过对地塞米松降解率以及酶活性的检测，降解菌中的地塞米松降解酶活性主要分布在胞内液中，其降解率为36%，其HPLC检测图，如图 3所示。周质液中酶活性较少，胞外液中未检测到酶活性。各区域蛋白液对地塞米松的降解率、酶活性、比活力如表 1所示。
表1
降解菌中地塞米松降解酶的分布
Table1.
Localization of degrading enzymes for dexamethasone
图2
降解菌各部位蛋白的SDS-PAGE电泳分析
1：胞外蛋白；2：周质蛋白；3：胞内蛋白；M：蛋白marker
Figure2. SDS-PAGE analysis of proteins of every position in the bacteria1: extracellular protein; 2: periplasm protein; 3: intracellular protein; M: protein marke
图3
胞内蛋白降解地塞米松的高效液相色谱图谱
Figure3.
HPLC chromatogram of the degradation to dexamethasone of the intracellular
2.3 降解酶的提取与纯化
用不同浓度的硫酸铵盐析含有降解酶活性的胞内液，结果显示最适盐析浓度为30%~40%。用最适硫酸铵浓度盐析、DEAE-52层析、Sephadex G-100层析后，随着胞内液酶活性蛋白的提取和逐步层析，虽然蛋白含量和总的酶活性逐渐减少，但比活力明显增高，如表 2所示。SDS-PAGE分析显示，硫酸铵盐析后还存在大量蛋白带，DEAE-52层析后存在少量蛋白带，Sephadex-100层析后只剩1条蛋白带，分子量大约为41 KD，如图 4所示，其纯度约为96%，表明已获得具有较高纯度的蛋白酶。
表2
各纯化步骤中降解酶的活性
Table2.
Enzymatic active in every steps of purification
图4
纯化蛋白的SDS-PAGE电泳分析
M：蛋白marker；1：硫酸铵盐析液；2：DEAE-52层析；3：Sephadex-100层析
Figure4. SDS-PAGE analysis of the purified proteinM: protein marker; 1： protein after salting-out; 2: protein after DEAE-52; 3: protein after Sephadex-100
2.4 质谱鉴定结果
纯化后的41 kD蛋白带经酶切后质谱分析，获得多条肽段的氨基酸序列数据。用MSCOT收索引擎检索鉴定，结果显示该蛋白有五条肽段与异戊酰辅酶A脱氢酶(NCBI，WP-010487056)的部分氨基酸序列完全匹配，覆盖率为56%，其得分为273分，P＜0.05，鉴定为可信。匹配的5条肽段的氨基酸序列分别为：A: MHVPSLNFDLGEDIDLLR；B: RHQFGEAIGSFQLIQGKI；C: RAYVYAVARA；D: KATWLTGQAIQILGGNGYINEYPTGRL；E: KLYEIGAGTSEIRR。匹配肽段的二级质谱(MS/MS)图如图 5所示。
图5
匹配肽段的MS/MS质谱图
Figure5.
MS/MS spectrogram of matched peptides
3 讨论
本实验为获得更多的地塞米松降解酶，先将分离到的地塞米松降解菌进一步驯化，经多次驯化培养后，降解菌对地塞米松的降解作用明显提高。为探讨降解菌的地塞米松降解酶产生的部位，采用渗透休克法提取降解菌的各区域蛋白质。渗透休克法的基本原理是革兰阴性菌在液体环境突然发生渗透压改变时，细菌出现质璧分离，再突然降温，使外膜破裂而释放出周质蛋白[8]。对降解菌各区域蛋白的降解酶活性检测结果显示其酶活性主要存在于胞内液中，因此，对地塞米松降解酶的进一步提取和纯化均采用胞内液。
因为地塞米松难溶于水，若用甲醇等溶解地塞米松后再加入培养基中，会影响细菌的生长；但在对酶的活性检测中，虽然用甲醇溶解地塞米松，但量少，并不影响酶的活性。因此本实验在细菌的培养中仅应用了地塞米松磷酸钠培养基，而在酶活性检测中，还应用了地塞米松。经硫酸铵盐析后的蛋白液，虽然降解酶的活性较高，但酶的纯度不高。为了进一步提高酶的纯度，采用了蛋白纯化最有效的离子交换层析和葡聚糖凝胶层析相结合的方法进一步纯化。离子交换蛋白层析的基本原理是带电的蛋白质和离子交换剂的基团进行交换而被分离纯化[12]，葡聚糖凝胶层析的基本原理是以多孔珠为固定相，根据蛋白的不同分子大小而对蛋白进行分离纯化。纯化后的蛋白液虽然酶的活性有所降低，但是纯度提高了19.62倍。
Tanaka等[13]发现异戊酰辅酶A脱氢酶可以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅助因子将异戊酰辅酶A脱氢为3-甲基巴豆酰辅酶A，Forster等[14-15]在铜绿假单胞菌中也发现了异戊酰辅酶A脱氢酶，该酶在有机物的利用中，起着关键的作用。本文提取纯化的蛋白酶经质谱鉴定，再与蛋白数据库对比结果表明，纯化后蛋白有5条肽段的氨基酸序列与异戊酰辅酶A脱氢酶的部分氨基酸序列完全匹配，覆盖率为56%，由此可推断该酶具有与异戊酰辅酶A脱氢酶相似的功能，但其氨基酸序列尚存在44%的不匹配，由此推测可能是一种新的甾体类化合物降解酶。本文的结果为采用微生物修复技术清除水环境污染的地塞米松磷酸钠和地塞米松，以及治理其它甾体类化合物的环境污染提供了一种新策略。
