실험 쥐 대동맥 유래의 1차혈관평활근세포 (primary vascular smooth muscle cells) 계대배양

1차세포 제작에 필요한 혈관 조직은 기관생명윤리위원회 (Institutional Review Board, IRB) 승인을 얻은 후, 혈관 조직을 제공받아 분리 및 배양을 실시하였다. 실험쥐 1차혈관평활근세포의 분리 및 배양에 관한 표준 프로토콜을 확립하고 최적화하기 위해서 다음과 같이 실시하였다.

실험 쥐 대동맥 조직 (Sprague Dawley, 7개월령)을 채취하여 지방조직을 제거하고 혈관을 절개한 뒤, 혈관내피세포를 조심스럽게 긁어서 제거하였다. 이후 조직을 조각 낸 뒤 collagenase type 1 (1 mg/mL, C1639; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 elastase (0.74 units/mL, E1250; Sigma-Aldrich)로 조직의 결합단백질 및 세포간 단백질을 제거하고, soybean trypsin inhibitor (1 mg/mL, 17075-029; Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)을 사용하여 단백질 분해 저해와 세포 오염을 방지하였다. 이후, 계대배양 준비된 세포조직은 1X Dulbecco's Modified Eagle's Medium에 Penicillin/Streptomycin (1% final)과 fetal bovine serum (heat inactivated, 20% final)이 첨가된 세포배양액에 옮겨서 배양하였으며, 이후 일반적인 평활근세포 배양 방식대로 계대배양 하였다. 1차세포는 계대배양 수 (passage number)가 일정한 수치를 넘어가면 혈관평활근세포의 특성을 잃는 편이며, 따라서 본 연구에서는 계대 수 4–5 이하로 저장하여 사용하였다. 세포배양의 진행과정은 위상차 현미경 (phase-contrast microscopy)를 사용하여 관찰하였다. 1차혈관세포배양 및 세포 아연처리 과정은 Fig. 1에 도식화하여 나타내었다.

Fig. 1
The diagram for the isolation of primary vascular smooth muscle cell from rat aorta and cellular Zn treatment. (A) The isolation and primary cell culture from rat aorta is shown with cellular Zn treatment. (B) Rat thoracic aorta were collected and then enzymatic digestion and inoculation of culture were processed for primary cell culture.
Zn, zinc; DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium; FBS, fetal bovine serum.

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동물실험 허가는 영국 로웨트연구윤리위원회 (Ethics Committee, Rowett Research Institute)의 승인을 받았으며 (Investigation confirmation to Directive 2010/63/EU of the European parliament), 모든 절차와 관리는 영국 동물복지관리 (UK Home Office Animal Welfare) 및 안동대 동물실험윤리위원회의 규정을 준수하였다.

세포 아연 처리

세포의 아연 처리는 두 가지 방법으로 실시하였는데, 1) 세포 밖 배양액의 아연을 결합하여 세포의 아연 결핍을 유도하는 Chelexing (chelex-100; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 방법과 세포막을 통과하여 세포 내외의 아연을 결합하면서 세포의 아연 결핍을 유도하는 TPEN (Sigma-Aldrich)을 사용하였다. 세포 밖 세포 배양액의 아연이 고갈되는 Chelexing 방법은 약한 수준의 세포 아연 결핍인 반면에 (extracellular Zn depletion), 세포 내외의 아연을 모두 고갈시킬 수 있는 TPEN을 사용하는 방법은 심한 수준의 세포 아연 고갈 방법이다 (extracellular and intracellular Zn depletion). 두 방법 모두 세포의 아연을 고갈시킨 후에, 처리하고자 하는 아연의 양을 배양액에 추가하여 세포배양 하였다.

Western blot 및 1차혈관평활근세포 증식 측정

Western blot을 이용하여 혈관평활근세포 마커단백질인 SM22α (transgelin 단백질 family)와 calponin, 그리고 혈관내피세포 마커단백질인 von Willebrand factor 단백질 발현을 측정하였다. 세포증식 (세포 활성)은 MTT assay를 사용하여 측정하였다.

1차혈관평활근세포의 계대배양 특성

실험쥐로부터 채취한 대동맥 1차혈관평활근세포 (rat primary vascular smooth muscle cells, pVSMCs)의 계대배양 특성을 Fig. 2에 나타내었다. 혈관조직을 1차 배양한 후의 세포 형태적 변화를 보면, 배양 1일에는 세포들이 배양접시에서 서로 이동해서 증식하기 시작하며, 6–7일째에는 혈관평활근세포의 주요 특성인 섬유세포 (fibroblastic) 모습을 나타내기 시작하였다. 8일 이후에는 80% 이상의 세포 배양 포화상태로 증식해서 혈관평활근세포의 전형적인 높고 낮은 세포배양층의 모습을 나타내었다 (hill and valley like morphology) (Fig. 2A). 최초의 1차배양 (passage number, PN=0) 이후, 계대배양 1–2번째까지도 혈관평활근세포의 특성인 섬유세포 모양을 나타내었으며, 계대배양 4–5번째까지도 이러한 특성을 그대로 유지하였다. 따라서 본 연구에서의 계대배양은 4번까지로 최적화하였다 (Fig. 2B).

Fig. 2
Cell morphology of isolated rat pVSMCs in cultures (A and B) and smooth muscle cell marker expression (C). (A) The aorta isolated from rat 1 was cut into small portions and were allowed to adhere to the culture dish. After 1 day, some cells began to migrate from the tissue explants. At 6 days, healthy cells with a characteristic fibroblast shape began to grow. At 7–8 days, growing cells began to come in contact with each other and formed a subconfluent layer. (B) Cell morphology of passaged pVSMCs isolated from different rats. The morphology of the passaged pVSMCs also exhibited fibroblastic morphology indicating the smooth muscle cell phenotype. (C) The phenotype of the cultured pVSMCs was assessed by the expression of SM22α and calponin, both of which are abundantly expressed by differentiated smooth muscle cells. The purity of the isolated cultures was assessed by the lack of expression of the endothelial cell marker von Willebrand factor, the common contaminant in pVSMCs isolation. Protein expression was assessed by Western blotting.
pVSMC, primary vascular smooth muscle cell; PN, passage number.

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1차혈관평활근세포의 형질 특성 측정

분리 배양한 1차평활근세포 형질 (cell phenotype)이 최적화 조건으로 배양되었고, 혈관내피세포로 오염 배양은 되지 않았는지를 확인하기 위해서 SM22α과 calponin (혈관평활근세포 마커단백질)과 von Willebrand factor (혈관내피세포 마커단백질) 발현을 측정하였으며, 이에 대한 결과를 Fig. 2C에 나타내었다. SM22α (transgelin 단백질 family)와 calponin은 혈관평활근세포가 적절히 잘 분화하면 나타나는 주요 마커단백질인데 [9, 10, 11], Western blot 측정 결과 이 두 마커단백질의 발현은 1차혈관평활근세포 배양에서 충분히 발현되었다 (Fig. 2C). 또한 혈관내피세포 마커인 von Willebrand factor 단백질 발현은 나타나지 않았다 (Fig. 2C). 따라서 본 혈관평활근세포의 1차배양은 평활근세포 마커단백질의 발현과 내피세포로 인한 오염 배양이 없는 최적화된 1차혈관평활근세포의 배양임을 확인하였다.

아연의 1차혈관평활근세포 증식에 대한 영향

실험쥐의 대동맥 유래의 1차평활근세포의 증식에 미치는 아연의 영향에 대한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 세포의 생리적 아연 수준은 15 µM 정도가 일반적인 수준으로 제시되고 있다 [5]. 본 연구에서는 아연에 의한 1차혈관평활근세포의 증식은 저농도 구간에서 낮아졌으며 (0–1 µM), 이 현상은 TPEN (intra- and extra-cellular Zn chelator) 처리한 세포배양에서 더 두드러졌으며, Chelexing (extra-cellular Zn chelator) 처리를 한 경우에는 통계적으로 유의적 의미는 보이지 않았지만 비슷한 경향을 나타내었다. 이는 TPEN 이 세포 안과 밖의 아연을 고갈시킬 수 있는 심한 수준의 아연 결핍인 것에 비교해서, Chelex-resin 은 세포 밖의 아연만 고갈시킬 수 있으며, 이에 따른 세포 아연 고갈 정도에 따른 결과라고 해석된다.

Fig. 3
Cell proliferation of rat pVSMCs cultured under extracellular (chelexed) and intracellular (TPNEed) Zn depletion. pVSMCs were grown until confluence. At confluence, cells were switched to media containing chelexed serum (extracellular Zn depletion) or 3 µM TPEN (intracellular Zn depletion) resulting in a mild and severe Zn deficiency, respectively. Cells were treated with Zn for 1 day. Cell proliferation was measured by MTT assay and presented as % GM (cells cultured in normal GM only). Statistically, Zn effect was analyzed by one-way analysis of variance at p < 0.05 followed by Turkey as post hoc test.
pVSMC, primary vascular smooth muscle cell; Zn, zinc; GM, growth media.

^a-dMeans having different superscripts indicated significance among Zn treatments (mean ± SD, n = 7).

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또한 3 µM TPEN 처리한 실험에서는 50 µM 아연 처리군에서 세포 증식이 대조군 (growth media, GM) 보다 높았으며 (p < 0.05), 이는 세포의 아연이 충분할수록 단기간의 혈관평활근세포 증식을 증가하는 것으로 나타났다. 이는 혈관평활근세포가 일정한 증식기간이 필요한 초기 혈관생성에는 아연의 긍정적 효과를 나타내며, 선행연구에서의 장기간 (20일 이상)의 혈관평활근세포 배양에서는 오히려 세포 아연이 결핍될수록 혈관평활근세포 증식이 높아졌는데, 이는 혈관평활근세포의 분화가 지연되고 증식은 여전히 많아서 혈관벽이 두꺼워지는 현상과 관련이 있는 것으로 이해되며 이는 동맥경화증 같은 혈관계 질환 유발에 아연 결핍이 관여됨을 시사하는 점이다 [12]. 한편, 아연이 혈소판이 분비하는 당단백질 thrombospondin 이 있을 때에 혈관평활근세포의 증식을 추가적으로 증가시킬 수 있다는 논문 결과가 보고된 적이 있으며, 이 결과 역시 아연이 혈관세포조직과의 연관성을 제시하는 연구라고 생각된다 [13].

본 연구의 결과는 실험쥐 대동맥으로부터 채취한 혈관평활근세포의 1차배양에서 평활근세포 마커단백질 발현은 충분히 나타났고, 혈관내피세포의 오염 배양은 없었으며, 따라서 혈관평활근세포 모델로서 최적화된 형질 특성을 보여주었다. 또한 1차혈관평활근세포에서의 아연 결핍은 세포 증식을 감소시켰는데, 이는 세포의 아연 고갈수준이 심할수록 더 감소되었으며, 이러한 결과는 혈관평활근 세포에서의 아연 결핍은 혈관의 손상을 가지고 올 수 있음을 암시하는 연구결과이다.