INTRODUCCIÓN

La reutilización de los residuos es una de las prioridades para el logro del desarrollo sostenible a nivel global (^{Arabhosseini, 2018}). En este contexto, la cáscara de huevo de gallina representa uno de los más abundantes residuos generados por la industria agroalimentaria y sigue siendo dispuesta sin pretratamiento alguno (^{De Angelis et al., 2017}). Según datos de la FAO, China es el mayor productor de huevos en el mundo (40%), seguido de Estados Unidos (7%) y la India (6%); se estima que cerca de 7 millones de toneladas de desechos de cáscara de huevo se descartan anualmente en el mundo (^{Li et al., 2020}). Esta elevada cantidad de residuos despierta interés en la comunidad científica y es por esto que, en los últimos años se han realizado grandes esfuerzos para transformar los desechos de cáscara de huevo en productos de valor agregado (^{Ding et al., 2020}).

La cáscara de huevo es un biomaterial con una estructura especial, conformada principalmente por una fase mineral y una red de fibras proteicas que corresponden a las membranas intersticiales. Su composición química indica que contiene aproximadamente 95% de carbonato de calcio (CaCO₃) en forma de calcita, 3% de material orgánico o matriz proteica que da estructura a los cristales de CaCO₃; los componentes residuales corresponden a 1% de carbonato de magnesio y 1% de fosfato de calcio, además de algunos elementos traza como Na, K, Zn, Mn, Fe y Cu (^{Baláž, 2018}). La cáscara de huevo se usa para diversos fines, desde procesos de baja inversión para obtener fertilizantes y piensos para animales hasta la transformación del material para el consumo humano (^{Hess et al., 2018}). El campo de aplicación más grande es la utilización como fuente de calcio para la preparación de biocerámicas (hidroxiapatita y fosfato tricálcico) en aplicaciones biomédicas, materiales compuestos y semiconductores, agentes para la administración de fármacos, agente de des-halogenación, absorbentes para la eliminación y recuperación de cobre (^{Mittal et al., 2016}), pigmentos de recubrimiento para papel (^{Hassan et al., 2013}), adsorción de metales pesados y colorantes orgánicos (Mittal et al., 2016); como fuente potencial de bio-rellenos para mejorar las propiedades de los nanocompuestos poliméricos y como fuente de materias primas útiles para producir nanomateriales (^{Huang et al., 2020}). En general, se ha utilizado en plásticos, pinturas, papel, tintas, alimentos e industria farmacéutica.

La nanotecnología ha demostrado que las estructuras en esta escala mejoran sus propiedades funcionales, es por esto que se han usado nanopartículas (NPs) de cáscara de huevo como agente de nucleación en material compuesto derivado de almidón de maíz, para aplicación en empaques de alimentos mejorando sus propiedades físicas y mecánicas (^{Hassan et al., 2013}). Es así, como los nanomateriales (ENM), denominados estructuras de ingeniería con al menos una dimensión de 100 nm, han incursionado en la industria alimentaria durante los últimos años y en este campo se ha indicado que la fortificación de alimentos con ingredientes en escala nano (<1000 nm), mejoran la eficiencia en la absorción y biodisponibilidad a través de la reducción del tamaño de partícula permitiendo que minerales como el calcio se absorban más fácilmente en el tracto gastrointestinal (^{Erfanian et al., 2014}). Con pocas excepciones, se incluyen principalmente estudios realizados con sistemas de administración ENM preparados a partir de ingredientes de grado alimentario, materiales vegetales molidos y minerales con distribuciones de tamaño de partícula dentro del rango de hasta 300 nm.

La obtención de ENM se puede generar a partir de dos enfoques: el enfoque de abajo hacia arriba o Bottom up, es decir; a partir de moléculas individuales, mediante reacciones químicas o mediante el autoensamblaje de componentes individuales lo cual resulta en la creación de cápsulas, fibras o tubos que se pueden usar como sistemas de administración para moléculas más pequeñas, por ejemplo, compuestos bioactivos o aromáticos (^{Baláž, 2018}). Mientras que los procesos de preparación de ENM basados en la fragmentación de estructuras más grandes en estructuras más pequeñas, generalmente mediante la entrada de energía mecánica o térmica, por ejemplo, molienda, homogeneización a alta presión, dispersión a alta cizalla y ultrasonido; se conocen como el enfoque de arriba hacia abajo o Top Down (^{Pohshna et al., 2020}). El material de partida puede consistir, por ejemplo: en materiales vegetales, oligoelementos o minerales (Baláž, 2018).

La cáscara de huevo posee características fisicoquímicas que favorecen su transformación en la nano escala a través de procesos top down, sin embargo; para que sea más eficiente se requiere la combinación de técnicas que permitan la reducción del tamaño de partícula; como la dispersión de alta cizalla y ultrasonido, esta última como una herramienta sonoquímica que permite la obtención de nanopartículas más pequeñas, dispersas y con mayor área superficial (^{Hassan et al., 2013}). La cizalladura es una de las fuerzas utilizadas en la reducción de tamaño de partículas, realizada a través de sistemas de alto corte como el efectuado en un homogeneizador rotor-estator, que gracias a la disipación de energía localizada y a las velocidades de corte intensas generan el proceso de dispersión y reducción de tamaño. Mientras que la sonicación a altas intensidades produce ondas de sonido que se propagan al medio líquido y dan como resultado ciclos alternos de alta presión (compresión) y baja presión (expansión), con velocidades que dependen de la frecuencia (^{Benavides-Guerrero et al., 2020}). Durante el ciclo de baja presión, las ondas ultrasónicas de alta intensidad crean pequeñas burbujas de vacío en el líquido, cuando las burbujas alcanzan un volumen en el que ya no pueden absorber energía, colapsan violentamente (implosionan) durante un ciclo de alta presión en un fenómeno denominado cavitación a través del cual se pueden obtener NPs de CaCO₃ (Hassan et al., 2013).

Valorizar desechos como las cáscaras de huevo, empleándolos como una fuente de calcio alternativa trae ventajas como: reducir el impacto en las reservas naturales de piedra caliza extraída de fuentes no renovables; disminuir el impacto ambiental y el riesgo microbiológico que representa el contenido orgánico de este material; reducir los costos de eliminación de estos desechos, y por último desarrollar productos con alto valor aprovechando su componente principal (CaCO₃) como ingrediente en alimentos. El objetivo principal de esta investigación es obtener nanopartículas de carbonato de calcio mediante un proceso combinado de dispersión de alta cizalla y ultrasonido de alta intensidad, a partir de la cáscara de huevo de gallina rojo AA (Gallus gallus domesticus) para aplicación en la industria de alimentos, con el fin de lograr una mayor biodisponibilidad de este mineral en el organismo humano.

METODOLOGÍA

La metodología presenta varias subsecciones, inicialmente se describe la separación de las membranas intersticiales y la caracterización de la cáscara de huevo, luego la preparación de las micropartículas de cáscara de huevo para la reducción de tamaño de partícula como una etapa previa, posteriormente la obtención y caracterización de las NPs de CaCO₃, el escalado del proceso de sonofragmentación y por último se estableció el análisis estadístico.

Pretratamiento de la cáscara de huevo

Los huevos de gallina rojo AA (Gallus gallus domesticus), fueron obtenidos en un mercado local de Medellín, Colombia. Se les separaron las cascaras, las cuales se lavaron varias veces con agua y se secaron a 80°C durante 2 horas. Se les retiraron las membranas intersticiales mediante un proceso de “Separación por diferencia de densidades” de acuerdo al método de ^{MacNeil, J., (2001}) con algunas modificaciones. Esto se da gracias a la turbulencia creada al interior del recipiente que contiene las cáscaras en fase acuosa, mediante un agitador de brazo a velocidad lenta (140 rpm) para lograr la flotabilidad de las membranas intersticiales y la sedimentación de las partículas de cáscara de huevo. Se realizaron 3 ensayos por triplicado con 300 g de cáscara de huevo en 1200 mL de solución y se determinó el rendimiento en peso seco de las cáscaras sin membrana en cada ensayo. Ensayo N°1: agua destilada (AD). Ensayo N°2: agua destilada y ácido acético al 5% (AD/AC) a 20°C. Ensayo N°3: agua destilada a 80°C (AD/80°C).

Caracterización de la cáscara de huevo

A las cáscaras de huevo se les determinó mediante análisis proximal el contenido de humedad, grasa, proteína y cenizas de acuerdo con los métodos de la AOAC (AOAC, 2005). Adicionalmente, se realizaron pruebas de calidad microbiológica (Codex Stan CAC/RCP 15-2007). Los análisis se hicieron por triplicado para las cáscaras de huevo con y sin membranas.

Preparación de partículas de CaCO₃ de cáscara de huevo

Se evaluaron varios métodos de reducción el tamaño de partícula hasta la escala micrométrica, con el fin de seleccionar el más eficiente. Para tal fin se usó un molino de bolas cerámico (DENVER, China), un molino de bolas centrífugo S-1000 (RETSCH, Alemania), un molino de bolas planetario (FRITSCH, Alemania) y un dispersor de alta cizalla - ultraturrax OV5 (VELP Scientífica, EE.UU.). El tamaño de partículas se clasificó por granulometría con un agitador de tamices ROTAP RX29 (Tyler) y un juego de tamices ASTM E-11 (Tyler).

Obtención de Nano-CaCO₃ de cáscara de huevo

Para la obtención de CaCO₃ en la escala nanométrica se combinaron dos métodos, aplicando en cada uno un diseño experimental con el objetivo de determinar las condiciones óptimas para su aplicación. En la primera fase se usó dispersión de alta cizalla y en la segunda sonofragmentación por ultrasonido. Este último ha sido usado con éxito para la obtención de nano partículas de diferentes materiales, gracias a las altas temperaturas y presiones, así como a las muy altas ratas de enfriamiento que se presentan durante la formación y colapso de las burbujas causadas por la irradiación ultrasónica (Tarig et al., 2013).

En la primera fase se preparó el sistema con 10 g de cáscara de huevo triturada en 100 mL de solución agua destilada/dispersante y se procesó en el dispersor de alta cizalla - ultraturrax OV5 (VELP Scientífica, EE. UU.). Se planteó un diseño experimental de superficie respuesta central compuesto, con 21 corridas experimentales, tomando como factores el tiempo (30 - 60 min) y la concentración de dispersante (0.5 % - 1%) y como variable respuesta el tamaño promedio de partícula (TP) (nm) y el índice de polidispersidad (IPD). Los rangos establecidos para los factores tiempo y dispersante se definieron a través de ensayos preliminares. El tamaño de partícula de carga (425 µm) y la velocidad de rotación (22000 rpm) fueron variables fijas. Para el análisis se utilizó el software Design-Expert® 10.0.6 (Stat-Ease, EE. UU.).

En la segunda fase, el CaCO₃ previamente dispersado en el homogeneizador ultraturrax, fue sometido a un proceso de sonofragmentación por ultrasonido en un equipo Vibra Cell VCX 500 (SONICS, EE. UU.). Se preparó el sistema, similar al contenido de carga usado por Baláž, M., (2018); con 3.5 g de muestra en 700 ml de solución (agua destilada/etanol). Para definir las condiciones de operación del sonofragmentador se aplicó un diseño experimental de superficie de respuesta central compuesto, con 13 corridas experimentales, utilizando como factores el % de amplitud (36% - 64%) y la concentración de solvente (14% - 56%) y como variables respuesta: el tamaño promedio de partícula (TP) (nm), el índice de polidispersidad (IPD) y el potencial zeta (PZ). Para el análisis se utilizó el software Design-Expert® 10.0.6 (Stat-Ease, EE. UU.). Para la determinación de TP e IPD se utilizó un equipo Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Reino Unido). La amplitud fue tomada como un factor importante en la investigación, puesto que, en ensayos preliminares, los incrementos de frecuencia en el rango de alta frecuencia (20480 a 20500 Hz), se evidenció una disminución en la generación de burbujas, por tanto, fue necesario aumentar la intensidad de la radiación, por medio del incremento en la amplitud de la onda.

Caracterización de las NPs de carbonato de calcio

A las nanopartículas de CaCO₃ se les analizó TP, IPD y PZ; características morfológicas y composición elemental mediante técnicas de microscopia; cristalinidad y fase del carbonato; y por último área superficial específica.

Tamaño de partícula e índice de polidispersidad

Se usó el método de dispersión de luz dinámica (DLS por sus siglas en inglés). Se dispersó 0.1 g de NPs en 10 mL de etanol, se mezcló bien y se colocó 1 mL de la suspensión en la celda para analizar por triplicado TP e IPD en Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Reino Unido) a 25°C y una longitud de onda de 633 nm (^{Jeong et al., 2013}).

Potencial zeta

La medición de PZ se realizó en Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Reino Unido) a 25°C y un ángulo de 15°. Para esto se diluyó 0.1 g de muestra en 10 mL de agua desionizada y se inyectó 1 mL de la muestra diluida en la celda de flujo, verificando la ausencia de burbujas de aire y que no se sobrepase el nivel establecido en la celda. Todas las mediciones fueron realizadas por triplicado (^{Huang et al., 2020}).

Análisis de microscopías electrónicas

Las características morfológicas de superficie y de tamaño de las partículas se investigaron usando microscopía electrónica de barrido y el análisis de composición elemental de la superficie se llevó a cabo utilizando un detector de espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDS por sus siglas en inglés) que analiza los rayos X generados como producto de la interacción del haz de electrones de un microscopio electrónico de barrido con material sometido a análisis para la identificación y cuantificación de rayos X. Para tal fin, cada muestra se extendió sobre la superficie de una cinta de carbono de doble pegamento, después de la pulverización con oro durante 120 s (^{Nasrollahzadeh et al., 2016}) y fueron medidas en un microscopio SEM-EDS CX-200 TM (Coxem, Korea).

Las formas y tamaños de los cristales de las nanopartículas también se determinaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM) JEM-2010 (JEOL, Japón), con un voltaje de aceleración de 100 KV. La suspensión de NPs de CaCO₃ se preparó dispersando las partículas en una solución de etanol absoluto mediante ultrasonidos. Luego, se colocaron 1-2 gotas de la suspensión diluida en rejillas recubiertas con película Formvar y se dejó secar a temperatura ambiente antes del análisis. El análisis de microscopía de fuerza atómica (AFM), se realizó en un microscopio Core-AFM (Nanosurf, Suiza) calculando las fuerzas entre una sonda y la superficie a una distancia muy corta (^{Jeyakumar et al., 2018}).

Difracción de rayos X

Para la caracterización del patrón de cristalinidad del carbonato de calcio obtenido de la cáscara de huevo mediante el proceso de sonofragmentación en ultrasonido de alta intensidad, se utilizó el patrón de difracción de rayos X que permite investigar las estructuras de fase de las partículas de CaCO₃ preparadas. La pureza y cristalinidad de las nanopartículas de CaCO₃ se determinaron mediante un difractómetro Rayos X (DRX) XPert PANalytical Empyrean Serie II, Modelo 2012, goniómetro Omega/2 theta (Malvern Panalytical, Reino Unido), operado a 40 kV y 30 mA con un ángulo de exploración (2θ: 5- 80º), con un tamaño de paso 0.026°. La semicuantificación se realizó usando el software High Score Plus mediante el método Rietveld y la base de datos: ICSD FIZ Karlsruhe 2012-1 (^{Minić et al., 2012}).

Área de superficie específica

El área de superficie específica se determinó mediante el método de isotermas de adsorción de nitrógeno a baja temperatura utilizando un analizador de área de superficie y poro de ASAP 2020 (Micrometics, Brasil). Los valores se calcularon utilizando la teoría BET (Brunauer, Emmett y Teller) (^{Nasrollahzadeh et al., 2016}).

Análisis Estadístico

El modelo desarrollado y la significancia estadística de los coeficientes de regresión fueron probados mediante análisis de varianza (ANOVA). La significancia de los coeficientes estimados en el modelo se probó con el estadístico F (valor-P) con un nivel de confianza del 95%.

Escalado del proceso de sonofragmentación

Posterior a la optimización del modelo de fragmentación de partículas de CaCO₃, mediante la aplicación de ultrasonido de alta intensidad en escala laboratorio; se efectuó el escalado de la sonofragmentación a un equipo ultrasonido industrial ISP-3000 (SONOMECHANICS, EE.UU.), el cual fue operado en ciclos de 20 minutos durante un tiempo de 2 horas con 10 minutos de descanso entre cada ciclo, temperatura (27 a 36°C), amplitud: 40%, frecuencia (20480 a 20500 Hz). Se sonicaron en cada prueba 20 L de solución con 5% de carga de CaCO₃, en flujo continuo de 1.5 L/min. La muestra se mantuvo en constante agitación a 200 rpm/min. Estos ensayos fueron realizados por triplicado, mientras que la caracterización de las muestras obtenidas en el escalado se determinó a través de la distribución de tamaño de partícula, índice de polidispersidad y potencial zeta. Así mismo, se comprobó la morfología mediante DRX y el tamaño por microscopia electrónica de transmisión (TEM).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados de los ensayos de separación de membranas intersticiales por diferencia de densidades mostraron un rendimiento en masa de 93.47%, 81.95% y 93.38% para los ensayos AD, AD/AC y AD/80°C, respectivamente. Por lo que se seleccionó el método AD, para separar las membranas de las cáscaras. Este resultado es muy importante porque permite seleccionar el método más económico (no hay que calentar), ecológico (no hay que agregar ácidos u otros reactivos contaminantes) y muy probablemente permite realizar con mayor facilidad el escalado del proceso.

En la Tabla 1 se muestra la composición química proximal de cáscaras de huevo, estos resultados coinciden con ^{Waheed et al., (2019}) quienes reportaron 33.13% y 34.12% de Ca, 5% de proteína y 93% de ceniza. Adicionalmente, los análisis microbiológicos reportaron ausencia de patógenos como Salmonella spp en cáscaras con y sin membrana, mientras que, en los recuentos de microorganismos indicadores como bacterias aerobias mesófilas, mohos, levaduras y coliformes totales y fecales se evidenció mayor crecimiento en las cáscaras con membranas intersticiales (datos no mostrados).

Obtención de partículas de CaCO₃

En la etapa preliminar de reducción de tamaño de partícula de CaCO₃ mediante procesos de molienda y dispersión de alta cizalla como pretratamiento para la sonofragmentación, se logró determinar el proceso de dispersión mecánico más eficiente, en el cual el sistema de alta cizalla mediante rotor - estator, mostró un mejor desempeño en la dispersión de las partículas como se puede apreciar en la Tabla 2. Esto favorece el rendimiento del material, con una disminución sustancial del tamaño de partícula y menor tiempo de proceso, comparado con el molino planetario, el cual ha sido reportado entre los más aplicados en procesos de molienda de cáscara de huevo a pesar del riesgo de contaminación por el desgaste de las bolas y la difícil recuperación del material adherido a los medios de molturación (^{Baláž, 2018}). Estos resultados demuestran que el mecanismo de alta cizalla favorece la ruptura de partículas de cáscara de huevo debido a la disipación de energía localizada y las velocidades de corte intensas que genera el proceso de dispersión. Adicionalmente, un tamaño de párticula menor en etapas posteriores de reducción de tamaño, dará lugar a procesos más eficientes y permitirá una mayor homogeneidad en el proceso de sonofragmentación (^{Shirsath et al., 2017}).

Efecto del tiempo y el dispersante sobre TP

En la Tabla 3 se muestra el ANOVA para tamaño de partícula durante el proceso de dispersión a alta cizalla, el cual contiene la significancia estadística del modelo, valor-P de cada factor o interacción, el R², R²-Ajustado y la carencia de ajuste. El análisis de varianza arrojó un modelo cúbico, con una carencia de ajuste no significativa. La variable con mayor significancia fue tiempo, indicando que éste tiene un mayor efecto sobre la reducción de tamaño de partícula. Esto posiblemente se debe a que a mayor tiempo de dispersión se logra mayor pulverización en el medio, sin embargo, cuando se generan partículas muy finas pueden alcanzar un valor límite de tamaño porque cada vez son más difíciles de romper a través de las fuerzas de corte del sistema de cizalla aplicado y posiblemente esté relacionado con que las partículas se vuelven elásticas cuando el tamaño de partículas está en el rango de 500 a 800 nm, como lo informaron ^{Strobel et al., (2017}). Adicionalmente, esta alta distribución de partículas posiblemente afecte la sonofragmentación posterior, cuando se aplica ultrasonido de alta intensidad.

En la Figura 1 se muestra el comportamiento gráfico de la respuesta (TP) en función de los factores. Para la variable PDI no hubo un modelo significativo que permitiera explicarlo en función de los factores evaluados, por lo cual no se tuvo en cuenta en la optimización del modelo. El polinomio que entrega el ANOVA describe la influencia de las variables sobre el TP como se indica en la Ecuación 1.

Optimización del modelo

El modelo de la Ecuación 1, fue optimizado para predecir el valor de los factores que minimicen el tamaño de partícula (nm), la solución numérica se muestra en la Tabla 4. Así mismo se realizaron ensayos adicionales (valores experimentales) para validar los valores predichos.

Efecto del solvente y la amplitud de la onda de ultrasonido sobre el TP de NPs de CaCO₃

Los resultados del ANOVA para la variable tamaño de partícula (TP) en la obtención de NPs mediante ultrasonido de alta intensidad se indican en la Tabla 5, donde se evidencia la significancia estadística del modelo, el valor-P de cada factor o interacción, el R², R²-Ajustado y la carencia de ajuste.

El análisis de varianza arrojó un modelo cúbico, con una carencia de ajuste no significativa y un R² de 0.9784. La variable con mayor significancia fue el solvente, indicando que éste tiene un mayor efecto sobre el tamaño de partícula (TP). Este efecto posiblemente está asociado a un aumento en la presión de vapor del solvente, que a su vez hace que disminuya la tensión superficial y la viscosidad del medio acuoso, favoreciendo que la generación de burbujas aumente la cavitación y como consecuencia se obtenga una mayor disminución del tamaño de las partículas de carbonato de calcio. Por su parte la amplitud también tiene efecto significativo sobre TP, dado que la cantidad de energía que puede transmitir una sonda ultrasónica a través de la punta del sonotrodo para lograr la cavitación depende de la amplitud utilizada y la potencia de sonicación. A niveles de potencia más altos, el número de eventos de cavitación aumenta puesto que se forma un mayor número de burbujas de cavitación transitorias, lo que contribuye a la magnitud de la rotura de partículas para la fragmentación del CaCO₃ (^{Jordens et al., 2016}).

El polinomio que entrega el ANOVA describe la influencia de las variables sobre el tamaño promedio de partícula (TP) (Ecuación 2). En el se observa que el efecto de la sonicación sobre el tamaño de partícula de CaCO₃, depende de manera conjunta tanto de la amplitud como del % de solvente, factores que presentan efecto tanto en su término independiente como en algunos cuadráticos, e interacciones de tercer orden (Tabla 3). Por su parte, en la Figura 2 se muestra el comportamiento gráfico de la respuesta (TP) en función de los factores.

El ANOVA para IPD indica un modelo significativo, con una carencia de ajuste no significativa; se ajustó a un modelo cúbico donde la interacción con mayor significancia fue A². El polinomio que entrega el ANOVA describe la influencia de las variables sobre el IPD (Ecuación 3). En la Figura 3 se muestra el comportamiento gráfico de la respuesta (IPD) en función de los factores.

Optimización del modelo

El modelo de la Ecuación 2 correspondiente a TP y la Ecuación 3 para IPD fue optimizado para predecir el valor de los factores que minimice el tamaño de partícula (nm) y el IPD mediante aplicación de ultrasonido, la solución numérica se muestra en la Tabla 6, así mismo se validó de forma experimental. Para la variable PZ no hubo un modelo significativo que permitiera explicarlo en función de los factores evaluados, por lo cual no se tuvo en cuenta en la optimización del modelo.

Caracterización de NPs de carbonato de calcio

A las nanopartículas de carbonato de calcio obtenidas de la cáscara de huevo, bajo las condiciones óptimas mediante el proceso combinado de dispersión de alta cizalla y ultrasonido de alta intensidad, se les realizó la siguiente caracterización:

Tamaño de partícula, polidispersidad y potencial zeta

Se realizó análisis de TP, IPD y PZ a las NPs CaCO₃ obtenidas a partir del proceso de sonofragmentación de cáscara de huevo realizada en el laboratorio después de 2 h de proceso en bache y se comparó con el escalado realizado en el equipo industrial ultrasonido de alta intensidad durante el mismo tiempo. En la Tabla 7, se aprecia que a través de la sonofragmentación realizada en el laboratorio se obtiene un tamaño promedio de partícula cercano al reportado por ^{Oehlke et al., (2014}) (550 nm), mientras que en el escalado del proceso se obtuvieron mejores resultados tanto en el TP como el IPD los cuales resultaron menores; lo que demostró que la fragmentación de partículas mediante ultrasonido de alta intensidad resulta favorecido por la formación de burbujas de cavitación transitorias que con potencias más altas conducen a partículas más pequeñas como lo indicaron ^{Jordens et al., (2016}). Esto se debe a que las altas potencias crean grandes burbujas de cavitación que implosionan violentamente y por lo tanto generan fuertes ondas de choque, microjets y turbulencias que eventualmente crean ruptura de las partículas cercanas.

Este mecanismo de ruptura para la reducción de tamaño de partícula se puede caracterizar como fractura o abrasión (^{Mosquera-Vivas et al., 2019}). El primero (fractura), consiste en la división de la partícula original en partículas más pequeñas de tamaño variable dando como resultado una amplia distribución del tamaño de partícula; mientras que la abrasión, en contraste, es un mecanismo de reducción de tamaño en el que las partículas significativamente más pequeñas se desprenden de los bordes y las superficies de las partículas originales. En tanto, estos mecanismos explican la amplia distribución que se presenta en el tamaño de partícula obtenidas de la cáscara de huevo en la sonofragmentación. Esto corresponde a efectos mecánicos, que surgen de las fuerzas de cizalladura durante la fragmentación ultrasónica; los cuales producen cambios físicos en estas partículas sólidas. Este efecto de la sonofragmentación puede estar relacionado con la interacción partícula-onda de choque (^{Benavides-Guerrero et al., 2020}). Adicionalmente, la amplia distribución de tamaño también puede deberse a la alta variabilidad de tamaño en la microsuspensión utilizada como insumo en el proceso de sonofragmentación.

El potencial zeta es un parámetro importante que puede ayudar a predecir la estabilidad electrostática de los sistemas coloidales y está relacionado con la carga eléctrica de la superficie de la partícula, por tanto, este parámetro permitió predecir la estabilidad de almacenamiento de las dispersiones coloidales submicrométricas (^{Huang et al., 2020}). Los valores promedio de PZ observados en las partículas CaCO₃ obtenidas mediante la aplicación de ultrasonido en el laboratorio (-14.9 ± 3.92 mV) y en el escalado (-22.4 ± 3.47 mV) confirmaron que la mayor estabilidad de las partículas obtenidas en el proceso de escalado se pueden atribuir a una mayor carga negativa de las partículas, que les permite repelerse entre sí con mayor intensidad permitiendo durante más tiempo que las partículas permanezcan en suspensión de forma individualizada y esto sumado a un menor TP obtenido (281.34 ± 25.83 nm) que también favorece la estabilidad del sistema, lo cual puede estar relacionado con que la suspensión tratada con mayor intensidad de ultrasonido, formó una suspensión más estable, fina y homogénea de nanopartículas de CaCO₃ (^{Shirsath et al., 2017}).

Microscopías electrónicas

Las imágenes de microscopia electrónica de barrido SEM y composición química elemental de las partículas obtenidas de la cáscara de huevo tras la sonofragmentación, se ilustran en la Figura 4 y 5. Estas imágenes revelaron la morfología superficial, el tamaño y la forma de las nanopartículas derivadas de la cáscara de huevo, las cuales mostraron ser de apariencia rugosa, de forma irregular con un tamaño que varió desde 45 nm a 550 nm, este último se debe a la aglomeración de partículas, lo que conduce a resultados de medición más grandes en cuanto a la distribución de tamaño de partícula, hallazgo similar al de ^{Mijan et al., (2014}) y ^{Huang et al., (2009}) quienes indicaron la aglomeración de nanocarbonato cálcico y nano citrato cálcico en su estudio. Estos resultados mostraron que las NPs de CaCO₃ no son homogéneas, por lo que varias partículas primarias tienden a agruparse formando aglomerados. La micrografía de la Fig. 4, se puede correlacionar con el alto IPD obtenido por DLS. Esta tendencia a la aglomeración es inducida por las fuerzas de Van-der-Waals que actúan entre las partículas individuales, generando alta tensión superficial (^{Salman et al., 2020}), y a pesar de que la vibración ultrasónica lograba desaglomerar, las partículas se volvían a unir rápidamente formando agregados, situación que coincide con lo que observaron ^{Zhang et al., (2004}) en su investigación con NPs de CaCO₃.

La composición química elemental del nanopolvo obtenido de la cáscara de huevo, se analizó cualitativamente mediante espectros EDS, los cuales mostraron picos distintivos correspondientes a las partículas de cáscara de huevo. Como se muestra en la Figura 5, se identificaron picos de carbono (C), oxígeno (O) y calcio (Ca) en los espectros de las NPs CaCO₃, lo que confirmó la pureza de las cáscaras de huevo e indicó que están compuestas exclusivamente de C, Ca y O y una pequeña traza de Mg (^{Nasrollahzadeh et al., 2016}). La proporción de Ca obtenida por EDS en las nanopartículas de CaCO₃ coincide con la cantidad de Ca obtenido en la caracterización inicial de este material (33.9% de Ca), indicando pocas pérdidas de este elemento y alta estabilidad química, de forma similar ^{Ray et al., (2017}), reportaron un 34.1% de Ca a partir de cáscara de huevo.

Las micrografías obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) permitieron observar en diferentes aumentos que las muestras de nanopartículas de CaCO₃ obtenidas a partir de la cáscara de huevo, están conformadas por partículas cristalinas de forma irregular y naturaleza porosa como se puede apreciar en la Fig. 6. Los poros identificados al interior de las nanopartículas pueden variar entre 1,86 nm a 3,04 nm aproximadamente, esto nos confirma una de las características que hace que las cáscaras de huevo tengan aplicación como soportes/catalizadores eficientes con propiedades económicas y respetuosas con el medio ambiente, donde se utiliza como una plantilla dura y eficaz gracias a su estructura porosa (^{Li et al., 2020}).

Los cristales observados en las micrografías de la Fig. 7 se encuentran en un rango aproximado de 10 nm a 60 nm, los cuales revelan la característica cristalina de las NPs derivadas de la cáscara de huevo, esto se confirmó con los patrones de difracción de electrones del área seleccionada (Fig. 8), mostrándose como una imagen de anillo de varios círculos que indica la naturaleza policristalina de las nanopartículas de CaCO_3. A partir de estos cristales se forman estructuras de mayor tamaño logrando alcanzar un diámetro de hasta 500 nm en promedio, lo cual corrobora que las partículas presentan una tendencia a la aglomeración como se evidenció en la Fig. 4.

Por otra parte, la microscopía de fuerza atómica (AFM) ofrece un perfil 3D de la superficie de la partícula, que permitió evidenciar que el polvo de cáscara de huevo a escala nano se caracteriza por su estructura rugosa e irregular como puede apreciarse en la topografía de la Figura 7. Los resultados para la topografía de los cristales obtenidos mostraron un espesor de 65.4 nm el cual es similar a lo encontrado por ^{Polat y Sayan (2020}) con un espesor de 54.36 nm a partir de CaCO₃ obtenido mediante síntesis química.

Difracción de rayos X

La Figura 8 muestra el difractograma del carbonato de calcio obtenido de la cáscara de huevo. Las NPs CaCO₃ se caracterizaron por picos amplios sin fases secundarias, lo que indica la pureza de las partículas; adicionalmente, se pudo inferir que el proceso de dispersión y sonofragmentación no generó ningún cambio de fase en la cáscara del huevo (^{Jeong et al., 2013}). Este resultado indicó que las nanopartículas de cáscara de huevo se pueden obtener con su pureza y cristalinidad inherentes (^{Mijan et al., 2014}). Entre estos planos se observó el pico más agudo que es el plano característico del CaCO₃ romboédrico y reveló la alta cristalinidad de la muestra, cuya fase principal es la calcita con un contenido de 98.7 % como se indicó en la Tabla 8. Este resultado coincide con el reportado por ^{Ramasamy et al., (2018}) en su estudio de nanocarbonato de calcio obtenido de piedra caliza.

Área de superficie específica

El área de superficie específica de NPs de CaCO₃ medida por el método N₂ Brunauere Emmette Teller fue 11.13 m²/g, un valor muy cercano al reportado por ^{Huang et al., (2020}) y ^{Polat y Sayan (2020}) de 11.20 m²/g alcanzado en la síntesis de nanocarbonato cálcico mediada por ultrasonidos de alta intensidad. El área de superficie específica real fue más pequeña de lo esperado, porque las partículas primarias de calcio se aglomeraron para formar grupos más grandes. Sin embargo, se pudo comprobar que el proceso de dispersión de alta cizalla y ultrasonido condujo a un aumento en el área de superficie específica BET de CaCO₃.

La obtención de nanopartículas de carbonato de calcio derivadas de cáscara de huevo de gallina mediante métodos combinados, muestra la posibilidad de escalar la producción de este material para el aprovechamiento de un residuo subvalorado y al mismo tiempo revela la oportunidad de explorar diversas áreas en la industria alimentaria, como la formulación de alimentos con ingredientes nano (NPs CaCO₃) para mejorar el valor nutricional y favorecer la bioaccesibilidad y biodisponibilidad del calcio a través de sistemas nanoestructurados, que terminen siendo potenciales promotores de la salud mediante el desarrollo de alimentos funcionales o nutraceúticos a partir de estas nanopartículas, con el fin de dar respuesta a las distintas necesidades de calcio en el organismo humano. A partir de los métodos empleados en esta investigación se logró demostrar un mayor rendimiento del nano polvo, en un tiempo más corto, sin el uso de solventes y contaminantes químicos, a diferencia de las metodologías hasta ahora empleadas para la obtención de NPs a partir de cáscara de huevo con enfoque Top Down, como la molienda húmeda en molinos de alta energía; por lo que resulta interesante escalar en ultrasonido de alta intensidad, donde los parámetros industriales son fáciles de operar, con alta capacidad de producción continua, sin aplicación de disolventes orgánicos, constituyendo este método como una tecnología amigable con el ambiente.

CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos y analizados en esta investigación, se pueden extraer las siguientes conclusiones sobre el efecto de métodos combinados para transformar la cáscara de huevo en NPs de CaCO₃: 1) La dispersión a alta cizalla es un mecanismo más efectivo que la molienda de bolas empleado actualmente para reducir el tamaño de partícula de CaCO₃; 2) La aplicación de ultrasonido de alta intensidad permitió obtener NPs de CaCO₃ y es un mecanismo escalable a nivel industrial para agregar valor a las cáscaras de huevo; 3) La combinación de los métodos mencionados en este estudio y la caracterización mediante microscopia, BET y XRD nos confirman que se puede obtener NPs de CaCO₃ con unas características fisicoquímicas similares a las conseguidas través de métodos como la molienda húmeda de alta energía; disminuyendo el número de pruebas y el tiempo de proceso, ya que estos últimos se pueden tomar hasta 25 horas.

NOTACION

NPs= Nanopartículas

CaCO₃= Carbonato de calcio

TP= Tamaño promedio de partícula

IPD= Índice de polidispersidad

PZ= Potencial zeta

SEM= Microscopía electrónica de barrido

TEM= Microscopía electrónica de transmisión

AFM= Microscopía de fuerza atómica

XRD= Difracción de rayos X

BET= Brunauer, Emmett y Teller

FAO= Food and Agriculture Organization

ENM= Nanomateriales

AOAC= Association of Official Analytical Chemists

AD= Agua destilada

AD/AC= Agua destilada y ácido acético al 5%

AD/80°C= Agua destilada a 80°C

DLS= Dispersión dinámica de luz

EDS= Dispersión de energía rayos X