INTRODUCCIÓN

Desde los inicios de la biología, los investigadores se han valido de la morfología para realizar descripciones y observaciones de la naturaleza y la vida. Y éstas observaciones, en base a diferencias y similitudes han servido para realizar aproximaciones de relación entre grupos, poblaciones e incluso especies, siendo la base de la taxonomía clásica. No obstante, y a pesar de las descripciones detalladas, la morfología no podía ser sujeta a un análisis cuantitativo fuerte, limitándose sólo a mediciones lineales de las estructuras. Ya a comienzos de la década de 1930, y con el desarrollo de nuevas técnicas estadísticas multivariadas (^{Toro-Ibacache et al., 2010}), el enfoque pasó a ser conocido como “morfometría tradicional” (MT) o “morfometría multivariada” (^{Marcus, 1990}; ^{Rohlf & Marcus, 1993}; ^{Adams et al., 2004}). No obstante, esta aproximación tenías sus limitantes, al no obtener una visualización gráfica del cambio de la forma. No fue hasta que ^{Kendall (1977}) sentaría las bases de la metodología que prestaría solución a los vacíos de la morfometría tradicional, definiendo a la forma como “Toda información geométrica que resulta de retirar los efectos de la posición, escala y rotación”. Es así como la morfometría tradicional comenzó a centrarse en la verdadera “forma de las estructuras” al adoptar nuevas técnicas adicionales, enfoque que pasaría a ser conocido como “Morfometría geométrica” (MG).

La MG es el estudio de la covariación de la forma con factores geométricos subyacentes, y se utiliza para determinar la “forma pura” (Shape) en un individuo o estructura, mediante puntos discretos en el espacio y bien definidos (Landmarks) (^{Zelditch et al., 2004}). Este tipo de análisis no se ve afectado por el tamaño del individuo, así como tampoco por su rotación ni escala, por lo que la forma del objeto en estudio no se describe en términos de sus dimensiones, sino de la relación espacial entre sus partes (Toro- Ibacache et al.; Zelditch et al.). Esto constituye una diferencia fundamental con la MT, la que entrega una “forma total” (Form) (Marcus; Rohlf & Marcus; Adams et al.; Zelditch et al.), y que no permite la recuperación de la forma en estudio. Lo anterior se debe a que las matrices que contienen la información, basadas en datos unidimensionales, sólo pueden entregar una representación abstracta de la estructura. La forma resultante en la MG, Shape en inglés, puede entregar importante información, como la adaptación a las presiones ambientales y reproductivas (^{Kaliontzopoulou et al., 2010}; ^{Weaver & Gunz, 2018}), así como también los rasgos que son más bien de carácter plesiomórficos y que permiten estimar grado de similitud entre individuos de distintos grupos o localidades (^{Fernández-Mazuecos et al., 2013}; Kaliontzopoulou et al.). Esto hace que la MG sea una herramienta útil y sencilla para evaluar similitudes y diferencias de carácter morfológico y ecológico entre individuos, grupos de una misma especie, entre especies distintas, poblaciones, etc. (^{Benítez & Püschel, 2014}; Toro-Ibacache et al.). Lo último permite realizar estudios de delimitación de especie y variaciones interespecíficas (^{Zúñiga-Reinoso & Benítez, 2015}).

Al igual que como ocurre con los nuevos enfoques para estudio de problemáticas biológicas, la MG ha incrementado su uso de forma exponencial en los últimos 10 años para responder preguntas de orden biológica en distintas áreas, en especial en biología integrativa. Así mismo, ha sufrido constantes cambios y actualizaciones en su metodología, haciendo al enfoque más preciso y capaz de resolver problemáticas cada vez más complejas (^{Benítez & Püschel, 2014}; Toro-Ibacache et al.). Por ejemplo, en el pasado quedó el uso de los partial warps (Pw) y relative warps (rw), los cuales eran usados como valores de componentes principales de la deformación de la grilla de forma (Thin plate spline), en análisis estadísticos exploratorios (Rohlf & Marcus; Toro-Ibacache et al.). No obstante, y a pesar de que las grillas de transformación son una herramienta muy útil para la visualización de los cambios de la forma, no necesariamente son fiables dependiendo de los algoritmos matemáticos asociados (como Pw y rw), señalando el cambio en las regiones más alejadas de los landmarks, ya que esta transformación responde en mayor medida como resultado del algoritmo de transformación y carece de sentido biológico (^{Klingenberg, 2013}b). Así mismo, estudios recientes (^{Wärmländer et al., 2019}) indican que, a pesar que lo que se creía anteriormente, los landmarks Tipo 1 son menos informativos que los Landmarks Tipo 3, en especial para recuperar información de la forma usando enfoques 3D.

Es por esta razón, y entendiendo la importancia del uso de las nuevas metodologías que corrigen los errores estadísticos metodológicos de la MG, es que se realiza esta revisión, para señalar las actualizaciones más recientes en MG, así como para indicar las nuevas metodologías, sus usos y las problemáticas que hoy en día intentan responder.

Revisión Bibliográfica. Para la revisión se realizó una búsqueda sistemática en los buscadores Scopus, Web of Science y Science Direct. Se utilizaron las palabras clave: Geometric Morphometrics, Fluctuating Asymmetry, Morphological Integration y Partial Least Squares. Además, como criterios de exclusión se consideraron únicamente los artículos científicos publicados en revistas desde el año 2010 en adelante, descartando revisiones bibliográficas y libros, y que con tuvieran al menos una de las siguientes palabras clave: “Geometric Morphometrics”, Evolution, Morphology, Morphometry, “Anatomy and histology”, y “Biological evolution”.

Se seleccionaron 65 artículos, los cuales fueron analizados para extraer la información de: Modelo de estudio, Método de análisis utilizado, Pregunta o Caso de estudio, y el Tipo de problemática (Tabla I). Y se graficó en el software GraphPad Prism V.5 la frecuencia de uso de metodologías (Fig. 1) y la frecuencia de temáticas de estudio (Fig. 2) desde el año 2010 al 2018.

Considerando que las temáticas más frecuentes actualmente para el uso de la MG son las evolutivas y ecológicas, distinguiéndose principalmente los métodos de: Integración y Modularidad, Asimetría Fluctuante, y Covariación de la forma (2B-PLS), es que en este trabajo nos centramos en ahondar en las metodologías de estas problemáticas. Por lo demás, y a pesar de que estas metodologías están cobrando importante notoriedad en las últimas décadas, no hay mucha bibliografía práctica que explique el uso y aplicaciones de los métodos, y en especial es relevante la falta de bibliografía en español, que pueda servir como un punto de inicio para los investigadores jóvenes que comienzan a profundizar en la MG.

Tabla I Resumen de los trabajos analizados, metodologías usadas, caso de estudio y tipo de problemática1. Nota 1: Eco= Ecología, DS= Dimorfismo Sexual, Alo= Alométrico, Evo= evolutivo. 

Fig. 1 Frecuencia porcentual de los métodos usados desde 2010 a 2018. rw= relative warp, PW= partial warp, PCA= análisis de components principals, CS= tamaño del centroide, CVA= análisis de variables canónicas, PLS= mínimos cuadrados parciales, FA= asimetría fluctuante, SW= singular warp, RV= Coeficiente de Escoufier, CR= tasa de covarianza, CCA= análisis de correlación canónica. 

Fig. 2 Frecuencia Porcentual de las temáticas analizadas con MG desde 2010 a 2018. Nótese que las problemáticas evolutivas y ecológicas suman alrededor del 60 % de las evaluadas durante el año 2018. 

Software. La morfometría geométrica desde sus inicios ha pasado por diferentes transiciones desde el punto de vista de software computacionales, donde en sus inicios la serie TPS por el profesor James Rohlf el cual bajo el alero de Stony Brook Univerity y la web (https://life.bio.sunysb.edu/morph/) por décadas actualizado las múltiples opciones de TPS para el público en morfometría en general con la desventaja que solo servía para algunos sistemas operativos (debía ser utilizado en Mac con emuladores de Windows). Luego del tiempo y fines de la década del 90 otros softwares que integraban morfometría 3D fueron apareciendo contemporáneos a la serie TPS (Morpheus, Morphologica, Landmark editor entre otros). Chris Klingenberg académico de la Universidad de Manchester en Reino Unido, crea un software basado en la plataforma java denominado MorphoJ (Klingenberg, 2011) el cual integra muchos de los métodos que la seria TPS tiene por separados en un solo programa de fácil manejo y compatible con todos los sistemas operativos. No obstante, en los últimos 10 años de investigación en el área y dentro de las nuevas aplicaciones en morfometría geométrica, el uso de R como software ha adquirido la fuerza suficiente para implementar todas las herramientas necesarias que una investigación en morfometría geométrica necesita desde la digitalización 2D o 3D hasta sus análisis correspondientes, por su versatilidad en la variedad y combinación de sus paquetes.

R es un entorno de programación libre que se utiliza para el procesamiento y análisis estadístico de datos entre otros análisis utilizando el lenguaje S. La variedad de software en morfometría geométrica no es muy amplia, no obstante, una buena combinación de software entre MorphoJ para principiantes y R más avanzados podría ser una buena recomendación.

Aprender R ciertamente necesita de práctica, y uso diario, entrenamiento que entrega una curva de aprendizaje notoriamente empinada. Depende las necesidades usando R no es necesario comprender el arte de la programación para poder realizar análisis morfométricos en R, no obstante, se necesita aprender algunos conceptos básicos y cómo manipular los archivos en R.

^{Zelditch et al. (2012}) indica que la ventaja de aprender los conceptos básicos de R es que la curva de aprendizaje para la morfometría geométrica es rápida y versátil debido a que los paquetes disponibles hoy en día han sido implementados con el cuidado necesario en sus guías de usuario que suelen ser muy simple seguir, es así como el Dr. Dean ^{Adams y su equipo liberan el paquete morfométrico "geomorph" (Adams & Otárola-Castillo, 2013}), además de la implementación de un foro de Google (https://groups.google.com/forum/#!forum/geomorph-r-package) libre para que cualquier usuario de geomorph puede hacer preguntas, y su equipo, o cualquier usuario experimentado puede ayudar a la comunidad morfometría a responder sus preguntas y de la misma forma motivar al uso de R para análisis morfométricos.

MÉTODOS

En la primera parte de este review, publicado por ^{Benítez & Puschel (2014}) se tocaron los temas básicos de la morfometría geométrica con una somera incursión en las técnicas morfométricas para estudios en ecología y evolución, las cuales en esta versión serán explicadas con mayor profundidad.

Integración Morfológica y Modularidad. Se conoce como integración morfológica (IM) al fenómeno de la variación morfológica coordinada entre rasgos funcionales y del desarrollo de los organismos (^{Benítez & Püschel, 2014}; ^{Klingenberg, 2013}b). A través de sus aspectos genéticos y del desarrollo, la IM está estrechamente relacionada con las mismas limitaciones evolutivas y del desarrollo (^{Futuyma, 2010}; Klingenberg, 2013b). En la última década, esta temática ha ganado particular protagonismo, en especial por el interés de los investigadores en responder preguntas complejas, que relacionan la variación morfológica con aspectos funcionales, del desarrollo u evolutivos, entre otros (^{Andjelkovic et al., 2017}; ^{Bardua et al., 2019}; ^{Bonneau et al., 2014}; ^{Curth et al., 2017}; Klingenberg, 2013a; ^{Labonne et al., 2014}; ^{Maiorino et al., 2017}; ^{Neustupa, 2017}; ^{Randau & Goswami, 2017}; ^{Stefanello et al., 2018}; ^{Watanabe et al., 2019}; ^{Zollikofer et al., 2017}).

A cada nivel de IM hace referencia de una forma u otra a la covariación entre las partes o rasgos, pero el origen de esta variación, así como el contexto conceptual y el enfoque de la investigación difieren de un nivel a otro (^{Klingenberg, 2008}, 2013a). Klingenberg (2014) analiza el estudio de la IM en varios niveles desde un nivel estático que incluye integración tanto en función, desarrollo, genético y ambiental, como a niveles ontogenéticos y evolutivos, para esto se ha utilizado una variedad de métodos morfométricos los cuales han cuantificado la forma de medir los niveles de integración de distintas maneras. Un método común es la cuantificación de la varianza de los eigenvalues en un PCA (Young 2006), o analizar los patrones de covariación entre partes utilizando un partial least-squares analyss (PLS). Además de estos "métodos estándar" para analizar los niveles de integración morfológica, algunos métodos morfométricos están diseñados específicamente para comparar patrones de integración en diferentes matrices de covarianza (análisis de coordenadas principales (PCoA)), una tarea que es especialmente relevante para comparaciones en diferentes niveles (^{Gonzalez et al., 2011}).

Un primer trabajo que compara y evalúa la integración en múltiples niveles desde el punto de vista estático, desarrollo y evolutivo fue el trabajo publicado por ^{Klingenberg et al. (2013}a) el cual evalúa principalmente aspectos de integración y modularidad evolutiva en la diversificación del cráneo de Aves. Bonneau et al., integra la morfometría 3D con la integración funcional, estudiando la articulación de la cadera en homínidos respecto a la postura bípeda. Para reducir el efecto de la orientación tridimensional en la covariación, los autores evaluaron los patrones de covariación entre sus respectivos valores tridimensionales de cada estructura, los cuales fueron cuantificados usando el coeficiente de RV de Escoufier como los métodos de PLS. Desde otro punto de vista, Watanabe et al. integra patrones ecomorfologicos con la diversificación evolutiva y la integración morfométrica en cráneos de reptiles principalmente Squamata (lagartos y serpientes), encontrando que, a pesar de sus tendencias evolutivas dispares, los lagartos y las serpientes comparten un patrón común de integración de rasgos, con las correlaciones más altas en el occipital, la articulación de la mandíbula y el paladar. Por lo tanto, Watanabe et al. concluye que los fenotipos altamente diversos, ejemplificados por lagartos y serpientes, pueden surgir de la selección diferencial que actúa sobre patrones conservados de integración fenotípica.

Cabe destacar que la forma en la cual se cuantifica la integración morfológica ha pasado por serias revisiones desde su punto de vista metodológico. Tanto los análisis de coeficiente de RV como de PLS están basados en la matriz de covarianza, aunque ambos procesos son distintos y responden de forma diferente la pregunta de covariación. El coeficiente de RV representa la cantidad total de la covarianza, escalada por la cantidad de variación entre dos sets de variables (^{Klingenberg, 2009}; ^{Adams, 2016}). Se han utilizado pruebas de permutación para evaluar la significación estadística del coeficiente de RV, es decir, las observaciones en los dos conjuntos se permutan aleatoriamente para simular la hipótesis nula de independencia completa. En cuanto al análisis de PLS, este calcula las combinaciones lineales de covarianza maximizada utilizando el método de descomposición del valor singular para maximizar la representación de baja dimensión de la estructura de covarianza entre bloques. El análisis del coeficiente de RV y el análisis de PLS son dos métodos complementarios para explorar patrones de covarianza, ya que el primero trabaja en la covarianza total entre dos matrices en relación con la varianza de cada matriz, mientras que el segundo trabaja en dos de los ejes de covarianza máxima.

Es necesario destacar que la IM no es uniforme a través de todo el organismo, sino que tiende a concentrarse en ciertos complejos de partes que están estrechamente integradas de forma interna, pero que son independientes de otros complejos (^{Klingenberg, 2013}b), y la integración entre éstos es relativamente débil (^{Adams, 2016}). A estos complejos se les denomina módulos, por lo tanto, se entiende como Modularidad a la división de sistemas del desarrollo en componentes parcialmente disociados que se encuentran integrados a partir de distintos niveles de organización biológica (Adams, 2016; Klingenberg, 2008).

Modularidad. La modularidad describe el caso en el que los patrones de covariación de los rasgos están desigualmente dispersos entre estos. Un módulo se puede definir como una unidad morfológica dentro de la cual existe una alta integración de varias y/o fuertes interacciones, pero que a la vez poseen cierto grado de independencia de esas unidades (^{Benítez & Püschel, 2014}; ^{Klingenberg, 2008}).

La modularidad se encuentra en la organización de redes biológicas en diferentes contextos, desde la regulación genética hasta las redes alimentarias en los ecosistemas (^{Klingenberg, 2010}). Los estudios de integración morfológica y modularidad difieren de los análisis de redes en otros contextos, porque las interacciones responsables de la integración no son directamente observables y, en cambio, deben inferirse a partir de los patrones de covariación entre rasgos. Debido a esta razón, la modularidad ha sido temática de particular relevancia en la última década, en especial en estudios de evolución del desarrollo, donde varios autores argumentan que proporciona la flexibilidad suficiente para que diferentes rasgos evolucionen más fácilmente bajo demandas funcionales diferentes y/o contrastantes (Andjelkovic et al.; ^{Asahara, 2013}; ^{Goswami & Polly, 2010}; ^{Lehoux & Cloutier, 2015}; ^{Maga et al., 2017}; ^{Maiorino et al.; Randau & Goswami, 2017}, 2018; ^{Simons et al., 2018}; ^{Stefanello et al.; Tamagnini et al., 2018}; Zollikofer et al.). Por consiguiente, la delimitación de módulos a partir de datos sobre patrones de covariación es una preocupación clave para la evolución del desarrollo de la forma (Klingenberg, 2010). La modularidad, debido a la escasa integración entre los módulos, puede mitigar los efectos de las limitaciones que se aplicarían si la variación estuviera plenamente integrada. ^{Felice et al. (2018}) proponen que la magnitud, patrón y relación de rasgos que describen tanto la IM como la modularidad, reflejan interacciones genéticas, de desarrollo y funcionales, que dan forma a los procesos evolutivos al regular la capacidad de evolución y restricciones de ésta. Esto debido a la disparidad morfológica (diversidad) que se puede observar en escalas temporales macroevolutivas. Por lo tanto, la IM y la modularidad han sido descritas como las influencias fundamentales en la evolución morfológica y en la generación de biodiversidad. Específicamente, se sugiere que la fragmentación de las relaciones entre los rasgos, en módulos semiautónomos promueve la capacidad evolutiva al liberar conjuntos de rasgos con presiones de selección divergentes de las restricciones de su covariación, impuestas por la pleiotropía genética o la canalización del desarrollo (Felice et al.). Efectivamente, los autores evidenciaron que el patrón de disparidad morfológica respondía a un patrón de movimiento Browniano, siendo la varianza morfológica proporcional al tiempo y a la tasa de mutación (^{Felsenstein, 1985}).

Por otra parte, para sets de datos morfométricos, las hipótesis de modularidad han sido comúnmente evaluadas con el uso del coeficiente de RV, que es un estadístico de asociación utilizado en una amplia variedad de campos (^{Klingenberg, 2009}). No obstante, ^{Adams (2016}) utilizando datos simulados, demuestra que el coeficiente de RV es afectado negativamente por los atributos de los datos (tamaño muestral y número de variables), por lo que no caracteriza la covarianza de las estructuras entre los sets de variables (Fig. 3). En las simulaciones, se puede observar como en los sets de datos con bajo tamaño muestral produce valores de RV altos, y viceversa (Fig. 3A). La razón de este patrón es debido a que el denominador del coeficiente de RV (Fig. 4B), contiene tanto a la variación dentro de los módulos, como además la variación de todos los rasgos, los cuales se escalan con el tamaño muestral (Klingenberg, 2009). Así mismo, se evaluó el efecto del número de variables, y se encontró que el valor del coeficiente de RV también depende altamente de esto (Fig. 3B). Específicamente, se observó el valor del coeficiente de RV es directamente proporcional a la cantidad de variables examinadas. Para solucionar estos inconvenientes, Adams (2016) propone el test denominado covariance ratio (CR), para cuantificar la modularidad y demostrar que no se ve afectada por el tamaño de la muestra o el número de variables y además, complementado por un test estadístico estandarizado desarrollado por Adams & Collyer (2019) denominado (Covariance Ratio Effect Sizes: ZCR) para medir el grado de modularidad y estandarizar el efecto del tamaño entre conjuntos de variables y poder hacer una comparación estadística esta herramienta publicada a fines del 2019 se basada en el análisis de CR (Adams, 2016) para comparar la intensidad de la señal modular en los conjuntos de datos, así como para evaluar los patrones de la señal modular según la definición de hipótesis de modularidad alternativas para el mismo set de datos.

Fig. 3 Evaluación de los coeficientes de RV y CR bajo la hipótesis de asociación aleatoria de las variables (sin modularidad ni estructuración). (a) Valores de RV a distintos tamaños muestrales para datos simulados, (b) Valores de RV para datos simulados a distinta cantidad de variables. (c) Valores de CR a distintos tamaños muestrales para datos simulados, (d) Valores de CR para datos simulados a distinta cantidad de variables (^{Adams, 2016}). 

Fig. 4 A) Matriz de covarianza para el coeficiente de RV, donde los bloques diagonales S1 y S2 corresponden a las matrices de covarianza de los dos conjuntos de variables, mientras que el bloque fuera de la diagonal S12 es la matriz de covarianzas entre las variables de los dos conjuntos (la matriz S21 es la transposición de S12). B) Ecuación para el coeficiente RV de Escoufier. C) Matriz de covarianza para el coeficiente de tasa de covarianza (CR), donde los bloques diagonales S11 y S22 corresponden a las matrices de covarianza dentro de cada módulo, mientras que S12 y S21describen la covarianza entre módulos. D) Ecuación para el coeficiente de covariación CR, donde S*11 y S*22 representan las matrices de covariación dentro de cada módulo respectivo, reemplazando los elementos nulos por ceros (^{Klingenberg, 2009}; Adams). 

A diferencia del coeficiente de RV, el CR usa sólo los pares de covarianza entre las variables, para cuantificar la estructura modular (Fig. 4D). Para estimar la relación de la covarianza, se obtienen variables en cada uno de los dos módulos (Y1 e Y2) para las N muestras. Las matrices de datos pueden entonces concatenarse en una única matriz (Y), a partir de la cual se construye la matriz de covarianza global (Fig. 4C), donde S11 y S22 son las matrices de covarianza dentro de los módulos Y1 e Y2 respectivamente, y S12 y S21 describen la covariación entre módulos. Así, al reemplazar con ceros los elementos diagonales de las matrices S11 y S22 (S*11 y S*22 respectivamente), obtenemos la ecuación para cal- cular el coeficiente CR (Fig. 6D). Al revisar la ecuación de CR, se puede apre- ciar que éste representa la tasa de covariación total entre los módulos relativos al total de la covariación dentro de los módulos. Específicamente, el numerador se obtiene a partir de la matriz de covarianza entre módulos (S12), y describe la suma total de la covarianza cuadrada entre Y1 e Y2. Por el contrario, el denominador se obtiene de la matriz de covarianza dentro de cada módulo (S11 y S22), por lo que describe la suma total del cuadrado de la covariación en cada dimensión del rasgo. Debido a que el CR describe la covariación entre módulos en relación con la covariación dentro de los módulos, es apropiado para evaluar pruebas de modularidad, en lugar de simplemente describir la covariación entre módulos. Así, el coeficiente de CR puede considerarse como una herramienta analítica complementaria, útil para diferentes propósitos. Empíricamente, el coeficiente de CR va desde cero a valores positivos, siendo directamente proporcional al grado de covariación entre módulos. En cuanto al desempeño de CR respecto a los datos simulados, se observó que el valor de CR esperado se mantiene constante a medida que aumenta el tamaño muestral (Fig. 3C). Así mismo, se observó que a medida que aumenta el número de variables, el coeficiente de CR alcanza la asíntota rápidamente (Fig. 3D). Por lo tanto, y a diferencia del coeficiente de RV, la hipótesis de covarianza nula de asociaciones aleatorias de variables, independiente de la relación, muestra un valor esperado constante (CR = 1·0) bajos distintos tamaños muestrales o cantidad de variables analizadas.

Como ejemplo de trabajos que evalúen modularidad con el coeficiente de CR, es el trabajo de ^{Randau & Goswami (2017}), en el cual analizan la hipótesis del desarrollo de módulos en las vértebras de félidos, con tal de determinar cómo las interacciones del desarrollo son la principal influencia en la modularidad vertebral. Además, analizaron la magnitud tanto de la integración como de la disparidad intravertebral, para evaluar si el nivel de integración varía a lo largo de la columna vertebral y, de ser así, si la integración y la disparidad están asociadas. Para esto utilizaron landmarks 3D en 19 de las 27 vértebras presacrales en nueve especies de félidos, los cuales fueron sometidos a análisis de GPA individuales para cada vértebra. Para recuperar la información de la forma, utilizaron un digitalizador MicroScrib® G2X de inmersión. Se hipotetizó que las vértebras estaban compuestas por dos módulos: “el centro” y la “espina neural”. Se evaluó el grado de modularidad y la significancia de esos modelos usando tantos el método del coeficiente de RV como el de CR. Para analizar las distintas especies, y sin eliminar de todo el efecto de la señal filogenética (que puede determinar la fuerza de la modularidad), se realizó una corrección para agrupar las distintas especies en un mismo análisis, mediante una matriz combinada de varianza-covarianza (VCV) para cada vértebra, y luego se evaluó esta VCV con el uso del análisis de CR. La matriz de VCV fue calculada mediante una función de covarianza en R. Es importante señalar que ésta es una nueva utilización para el coeficiente de CR, el cual aún no ha sido testeado mediante simulación de datos. No obstante, los resultados de modularidad tanto con o sin el uso de la matriz de VCV, fueron similares, por lo tanto, no existe alguna razón obvia para pensar que las propiedades del método CR no sean válidas para este caso.

Los resultados del trabajo, confirmaron la hipótesis del desarrollo modular de las vértebras, mostrando dos módulos en las vértebras más presacrales (Fig. 5). Las excepciones se centran en los límites entre las regiones tradicionales y funcionales, lo que sugiere que la modularidad intervertebral puede reflejar una modularidad a mayor escala en la columna de los félidos. Además, las autoras demostraron que la integración general y la disparidad son mayores en las vértebras posteriores, proporcionando así un ejemplo empírico de integración que potencialmente promueve mayores respuestas morfológicas a la selección.

Fig. 5 Diagrama que muestra la distribución de la disparidad morfológica entre especies (como varianza de Procrustes y distancia máxima de Procrustes) y la dispersión de valores propios (es decir, la integración morfológica) a través de las vértebras C4 a L7, calculada utilizando 16 puntos landmarks homólogos. Las líneas verticales discontinuas ilustran los límites morfológicos y funcionales de la columna vertebral presacra, mientras que las líneas discontinuas horizontales representan la varianza media de Procrustes (gris) y la distancia media de Procrustes (negro) (^{Randau & Goswami, 2017}). 

Asimetría Fluctuante. Si consideramos que toda respuesta fenotípica es producto de la interacción entre el genoma y el ambiente, entonces podemos suponer que, en ciertas ocasiones, es el ambiente el que determina la variabilidad morfológica de ciertos rasgos o individuos. En la mayor parte de los casos, los organismos presentan un plan corporal consistente en la repetición de estructuras en diferentes posiciones u orientaciones unas de otras (^{Palmer & Strobeck, 1986}). A esto se le conoce como simetría (^{Klingenberg, 2015}). En la naturaleza podemos encontrar varios tipos de simetría, siendo la simetría radial (como la presente en algunas flores, cnidarios y equinodermos), y la simetría bilateral las más comunes en la naturaleza, siendo esta última la más extendida entre los animales. Este tipo de simetría se caracteriza por la capacidad de distinguir un lado derecho e izquierdo a través de un plano medio del cuerpo, haciendo que estos lados sean una imagen espejo una de otra. Esta reflexión a través del plano medio del cuerpo, es importante para la simetría bilateral, y puede ser usada para caracterizarla (^{Benítez et al., 2011}b).

Matemáticamente, un objeto es simétrico si al realizar transformaciones sobre éste, la forma del objeto permanece sin cambios. Por ejemplo, la reflexión sobre el plano medio, deja a las estructuras simétricamente bilaterales inalteradas. De forma similar, la rotación sobre el eje, de un objeto de simetría radial, dejaría inalterada la forma del objeto o estructura.

Al ser ambos lados (derecho e izquierdo) configurados por los mismos genes, podemos esperar que bajo condiciones idóneas del desarrollo, ambos lados sean idénticos uno del otro (^{Benítez & Püschel, 2014}; ^{Klingenberg, 2015}). De lo contrario, al detectar asimetría en la forma de estructuras u organismos, entonces podemos estar ante la presencia de algún factor o condición que produce alteraciones en la estabilidad del desarrollo (^{Polak, 2003}). Los patrones de asimetría son la manifestación observable de procesos biológicos, pero no son procesos biológicos en sí (Klingenberg, 2015). Es decir, son la consecuencia de un proceso biológico. Inferir procesos biológicos desde patrones de asimetría es complejo, y por lo general requiere de evidencia adicional. Tradicionalmente, tres tipos de asimetrías pueden distinguirse en una población, acorde a la distribución de las diferencias entre los lados derecho e izquierdo: asimetría direccional, asimetría fluctuante y antisimetría (Fig. 6). Estos tipos de asimetría difieren en sus propiedades estadísticas, así como por sus orígenes e implicancias biológicas (^{Palmer & Strobeck, 1986}).

Fig. 6 Gráficos de frecuencia para las diferencias entre lados derecho e izquierdo de acuerdo a los principales tipos de asimetría. a) Asimetría Fluctuante “pura”. Las diferencias derecho-izquierdo siguen una distribución acampanada con una media de cero (ausencia de asimetría direccional); b) Asimetría Direccional y simétrica. Las diferencias derecho-izquierdo están distribuidas a alrededor de una media distinta de cero, indicando asimetría direccional. La dispersión de las diferencias individuales derecha-izquierda alrededor de la media, es asimetría fluctuante. c) Antisimetría. La distribución de las diferencias derecha-izquierda es bimodal, indicando que la mayoría de los individuos son claramente asimétricos, pero pueden estar sesgados hacia la derecha o a la izquierda. Las unidades de los ejes del gráfico son arbitrarias (^{Palmer & Strobeck 1986}). 

La asimetría direccional puede ser cuantificada por las diferencias promedio entre los lados derecho e izquierdo. Esta diferencia entre los lados puede ser grande o pequeña, pero el promedio de las diferencias entre los lados derecho e izquierdo debe diferir de cero. El mejor ejemplo de asimetría direccional es la disposición de los órganos internos en la mayoría de los animales, incluidos los humanos, donde el corazón está en el lado izquierdo, el intestino está enrollado de manera constante y asimétrica, y otros órganos como los pulmones o el hígado también son asimétricos de manera consistente. La disposición en espejo de todos los órganos internos, situs inversus, es rara en humanos y la heterotaxia, o situs ambiguus, es también una condición rara en humanos donde sólo algunos pero no todos los órganos internos ocurren en la orientación de la imagen en espejo y se asocia con malformaciones y causa morbilidad o mortalidad graves en personas afectadas (^{Sutherland & Ware, 2009}).

La asimetría direccional requiere diferencias sistemáticas de desarrollo entre el lado izquierdo y el derecho. Tales diferencias han sido investigadas extensamente para las asimetrías direccionales conspicuas de los órganos internos que existen en la mayoría de las fila de los animales bilaterales, y se ha encontrado una variedad de mecanismos moleculares que pueden establecer una distinción inicial entre los lados izquierdo y derecho y transmitir esta información a los órganos en desarrollo (^{Coutelis et al., 2014}; ^{Namigai et al., 2014}; ^{Vandenberg & Levin, 2013}). Algunos de los mecanismos y genes involucrados en la producción de la asimetría direccional de los órganos internos parecen estar muy conservados, lo que sugiere que la asimetría izquierda-derecha es una característica ancestral de los animales bilaterales (Coutelis et al.; Namigai et al.; ^{Pélabon et al., 2006}; Vandenberg & Levin). La posible importancia funcional y adaptativa de la asimetría direccional no está clara (Namigai et al.; Pélabon et al.) y es concebible, por ejemplo, que los bajos niveles de asimetría direccional de muchas estructuras externas sea una consecuencia no adaptativa de las limitaciones del desarrollo relacionadas con la asimetría direccional conspicua de los órganos internos. ^{Benítez et al. (2014}b) demuestra en un estudio con escarabajos invasores que los niveles de simetría direccional además pueden ser heredables o pasar de generaciones siendo esta característica conspicua de dichas poblaciones.

En el caso de la antisimetría, por el contrario, la mayoría de los individuos de una población son asimétricos, pero difieren en la dirección de la asimetría. Así, la población estará conformada por una mezcla de afines al “lado derecho” y afines al “lado izquierdo” (^{Klingenberg, 2015}). Y como resultado de esta mezcla, la distribución de las frecuencias de las diferencias derecha-izquierda puede ser bimodal (Fig. 7c). En algunos casos, cuando la antisimetría es débil, con pequeñas variaciones de simetría, puede que no se observe un claro patrón bimodal. Por lo que parecería razonable prever una transición gradual entre la asimetría fluctuante y la antisimetría. Para poder definir de forma correcta a la antisimetría, se requiere de algún tipo de correlación negativa o retroalimentación entre los valores de los rasgos de los lados derecho e izquierdo (Klingenberg, 2015). Mientras que tal correlación es inexistente en la asimetría fluctuante. La antisimetría está altamente extendida en la naturaleza, tanto en animales como en plantas, pudiéndose observar por ejemplo en las tenazas de algunas especies de cangrejo, o en la forma de algunas orquídeas.

Fig. 7 La relación entre asimetría fluctuante, variabilidad morfológica e idoneidad ambiental. Las gráficas de dispersión muestran la relación entre la asimetría fluctuante y la idoneidad ambiental en dos escalas espaciales (arriba) y la relación entre la varianza morfológica y la idoneidad ambiental (abajo). Las barras discontinuas representan el error estándar. Se muestra el valor del coeficiente de determinación (^{Maestri et al., 2015}). 

La asimetría fluctuante (FA) a diferencia de la asimetría direccional y la antisimetría, denotas pequeñas diferencias ente los lados derecho e izquierdo, debido a imprecisiones aleatorias ocurridas durante los procesos de desarrollo (^{Klingenberg, 2015}). Si se espera que un rasgo morfológico se exprese, en promedio, de una manera particular bajo el control de un genoma particular, bajo condiciones ambientales particulares, y para el lado del cuerpo en cuestión, un rasgo real se desviará generalmente en mayor o menor medida de esta expectativa (o "fenotipo ideal" (^{Nijhout & Davidowitz, 2003})). Estas desviaciones existen porque los procesos de desarrollo no son totalmente deterministas, sino que tienen un componente inherente de variación aleatoria (Klingenberg, 2015). A este componente aleatorio o residual, es a lo que se le conoce como asimetría fluctuante. Un problema práctico con este razonamiento es que el fenotipo objetivo normalmente no se conoce, pero debe ser estimado. Si el fenotipo ideal se estima por el promedio de cada lado de una población de organismos genéticamente homogéneos desarrollados en un mismo ambiente, entonces la asimetría fluctuante puede obtenerse como la diferencia entre la asimetría de cada individuo y el promedio de la asimetría direccional (Polak). En otras palabras, la asimetría fluctuante es la variación individual de las diferencias izquierda-derecha de los valores de los rasgos (Klingenberg, 2015; ^{Van Valen, 1962}). Algunos autores han sugerido que esta debería ser una distribución normal y que las pruebas de kurtosis podrían ser útiles para distinguir entre asimetría fluctuante y antisimetría o para hacer inferencias sobre procesos biológicos subyacentes (^{Van Dongen et al., 2003}; ^{Palmer & Strobeck, 2003}) explican que una distribución normal de las diferencias izquierda-derecha surge si las desviaciones del fenotipo objetivo son el resultado de muchos pequeños efectos aleatorios que son aditivos e independientes entre sí. Esta es una traducción biológica del teorema del límite central de la estadística. Si bien es plausible que las fluctuaciones del desarrollo sean aleatorias en sus direcciones, es dudoso que sean aditivas e independientes, porque los procesos no lineales (no aditivos) y la interdependencia mutua son características prominentes de los procesos del desarrollo (Klingenberg, 2003).

Muchos estudios han utilizado la asimetría fluctuante como medida de la inestabilidad del desarrollo (^{Benítez et al., 2013}a, 2018; ^{Bravi & Benítez, 2013}; Maestri et al.) y han tratado de correlacionarla con medidas de exposición al estrés u otras condiciones adversas, endogamia o hibridación, o fitness. La inestabilidad del desarrollo es la cantidad de variación entre estructuras para las cuales se espera el mismo fenotipo objetivo: es el resultado de la imprecisión de los procesos de desarrollo y, por lo tanto, una medida de la regulación del desarrollo. Debido a que los lados derecho e izquierdo del mismo organismo comparten el mismo genoma y por lo general casi el mismo ambiente, se puede esperar que los órganos del lado izquierdo y del lado derecho compartan el mismo fenotipo objetivo (asumiendo que no hay asimetría direccional) y por lo tanto difieren sólo por la inestabilidad del desarrollo (^{Klingenberg, 2015}). La mayoría de estos estudios evalúan a la FA con el uso de la MG. Esto debido a la necesidad de contar con una herramienta específica, de gran poder, que sea capaz de detectar los mínimos cambios de la forma entre los lados derecho e izquierdo, y que ésta pueda detectar o determinar la varianza a nivel de la inestabilidad del desarrollo, ya que la FA es un parámetro que tiene un fuerte contexto de en la evolución del desarrollo. La estabilidad del desarrollo es la capacidad del sistema de desarrollo para lograr un fenotipo cercano al objetivo a pesar de las fluctuaciones en los procesos de desarrollo (Polak). Por ende, lo que se busca evaluar con el uso de la MG es el efecto del desarrollo sobre la forma (shape) del individuo, siendo las variaciones una respuesta del organismo a la inestabilidad del desarrollo. Otro tipo diferente de aplicación de la FA, también con el uso mayoritario de la MG, es la utilización de la FA para inferir el origen del desarrollo de la integración dentro y entre estructuras morfológicas (^{Debat et al., 2009}; Klingenberg, 2008; Klingenberg et al., 2002; Lehoux & Cloutier; Maestri et al.).

En resumen, el uso de la morfometría geométrica en estudios de FA ha proporcionado nuevos métodos para el estudio de cuestiones que ya se habían abordado en estudios de asimetría fluctuante con morfometría tradicional, con el uso de mediciones lineales, como las mediciones de longitud, y ha abierto nuevas direcciones de investigación que abordan cuestiones relativas a temas como la integración morfológica.

Como ejemplo de trabajos con éstos enfoques, tenemos el realizado por Maestri et al., en el cual los autores analizan la idoneidad de especies a determinados hábitats, para con fines de conservación, predecir la supervivencia de una especie a largo plazo. Para esto, los autores analizaron la FA como una medida de estrés del desarrollo, que a su vez la utilizan como indicador indirecto del desempeño de un individuo en diferentes regiones. Por lo cual, pusieron a prueba la congruencia de la idoneidad de distintas áreas geográficas (determinadas por modelos de nicho ecológico), con los marcadores morfológicos que reflejan estrés ambiental y varianza morfológica, en la especie de roedor endémico de Brasil Akodon cursor.

Las mediciones de FA fueron realizadas para cada individuo de forma particular. Para esto, 1° se hizo un reflejo de cada una de las configuraciones originales de los landmarks a su imagen espejo, generando una copia reflejada de cada configuración; 2° usando Procrustes fit, se generó un promedio de las configuraciones originales y reflejadas para cada espécimen, lo cual es una configuración perfectamente simétrica; y 3° la asimetría de la forma se calculó para cada individuo, como la desviación de la configuración original de los landmarks del consenso simétrico. Además, de cada individuo se obtuvo un valor, expresado en unidades de distancia de Procrustes, que refleja la cantidad de asimetría individual. Y se utilizó este valor individual de los individuos de una misma población, para obtener un valor promedio de FA de todos los individuos dentro de una población. Y como medida de varianza morfológica, utilizaron la disparidad morfológica dentro de cada población.

Para medir la variabilidad en la idoneidad de hábitat, se correlacionaron los valores promedio de FA y varianza morfológica (dentro de una población), con los valores de idoneidad de hábitat generados a partir de modelamientos de nicho. Además, se realizaron pruebas de autocorrelación espacial para determinar si las variables de forma estaban correlacionadas en el espacio, lo podría haber generado sesgos en los análisis al violar los principios de independencia entre muestras.

Como resultado, los autores obtuvieron que existe una significativa relación ente los niveles de idoneidad y los niveles de FA, los que indica que en aquellas áreas menos adecuadas, los individuos experimentan numerosas perturbaciones durante el desarrollo ontogenético del cráneo. Así mismo, no encontraron asociación entre la varianza morfológica y la idoneidad del hábitat (Fig. 7). Estos resultados confirman las predicciones de que, en ambientes con menor idoneidad, el estrés en el desarrollo aumenta.

Otro ejemplo de trabajo que utiliza la FA, es el de ^{Benítez et al. (2018}), en el cual los autores utilizan a la FA como bio-indicador del desarrollo de la estabilidad en la forma de individuos de escarabajos carábidos de la especie Pterostichus melas melas, en múltiples poblaciones de dos producciones agrícolas diferentes: Perennes y anuales. Para obtener datos de forma, los investigadores utilizaron imágenes 2D de la zona ventral del cuerpo de los escarabajos. Se utilizaron 16 landmarks considerando los lados derecho e izquierdo, y se obtuvieron las coordenadas de forma mediante un completo ajuste de Procrustes. Con tal de medir la simetría, la reflexión fue eliminada mediante la inclusión de la imagen espejo y la imagen original, de todas las configuraciones analizadas y simultáneamente realizando la superposición de todas ellas. Se analizó el error de la FA digitalizando dos veces cada individuo, y analizando la varianza de los CS para detectar posibles diferencias, mientras que se realizó un análisis de Procrustes ANOVA para analizar las diferencias de la forma. Estos análisis fueron realizados entre sexos de forma separada, con tal de analizar la influencia del dimorfismo sexual sobre la asimetría de la forma. Los patrones principales de la variación de la forma fueron analizados mediante un análisis de PCA, calculado a partir de la matriz de covarianza del promedio poblacional del componente simétrico de forma. Para analizar la relación entre la forma y los niveles de FA se realizó una regresión multivariante que incluyó sus respectivas elipses de confianza (90 %) por grupo, utilizando la forma y las puntuaciones de FA, y se realizó un análisis de permutación de 10.000 iteraciones. Para analizar la correlación entre los datos climáticos y la forma, se realizó un análisis de PLS utilizando la temperatura y las precipitaciones como covariables. Como resultado, los investigadores obtuvieron que las regresiones (valores de la FA VS Forma) y PLS, mostraron que los carábidos que habitaban el agroecosistema perenne parecen haberse adaptado a nivel fenotípico, a la fuerte influencia antropogénica (es decir, las prácticas de Plan de Manejo Integrado de Inocuidad de Sustancias Químicas), mientras que los carábidos que habitan los agroecosistemas anuales experimentan ambientes más inestables y sus fenotipos parecen haber sido cambiados en fechas más recientes (Figs. 8 y 9).

Fig. 8 Análisis de los componentes principales de la forma media del cuerpo en Pterostichus melas melas. Los dos primeros componentes principales (PCs) se utilizan para mostrar la mayor parte de la variación de forma. (Edit. ^{Benítez et al. 2018}). 

Fig. 9 Análisis de regresión multivariante de la forma en Procustes FA. Los diferentes colores representan las diferentes poblaciones bajo estudio (Rojo= Perenne; Verde= Anual; Azul= Control; Negro= Control de Museo). Las elipses de confianza del 90 % se calcularon para la media de cada población. (Edit. ^{Benítez et al. 2018}). 

Covariación de la forma con variables ecológicas: 2B-PLS. Mientras que los estudios de integración miden la covariación de la forma entre distintas partes o lados de una estructura, en los estudios que utilizan la metodología de Two-Block Partial Least Squares (Cuadrados Mínimos parciales de 2 Bloques - 2B-PLS) analizan la covariación entre dos sets de variables: morfológica y ecológica-ambientales. Este método difiere del análisis de regresión en que los dos conjuntos de variables se tratan simétricamente en lugar de utilizar un conjunto de variables (variables independientes) para predecir la variación en el otro conjunto de variables (variables dependientes). Aunque el método tiene similitudes con el conocido método de análisis de correlación canónica (CCA), es diferente y se utiliza para responder a una pregunta un tanto diferente (^{Rohlf & Corti, 2000}). Una de las ventajas de los 2B-PLS sobre los CCA, es que pueden ser aplicados en morfometría, donde una de las variables puede ser variables de forma. La fuente más directa de las variables de forma es utilizar las coordenadas x, y (o x, y, z para los datos tridimensionales) de las coordenadas de las ubicaciones de los landmarks morfológicos después de que hayan sido alineados a su forma media, mediante el uso de un análisis de PGA. La ventaja de los datos obtenidos mediante PGA, de los datos obtenidos por morfometría tradicional, es que en éstos se elimina el efecto de la variación ajena a la forma (tamaño, rotación, traslación, etc).

El método 2B-PLS se utiliza para explorar el patrón de covariación entre dos conjuntos de variables. Si se divide una matriz Y de datos n X p, por columnas en Y1 y Y2 (con columnas p1 y p2, respectivamente), entonces 2B-PLS construye pares de variables que son combinaciones lineales de las variables dentro de cada uno de los dos conjuntos. Las combinaciones lineales se construyen de manera que las nuevas variables representen en la medida de lo posible la covariación entre los dos conjuntos de variables originales. Se espera que estas nuevas variables sean útiles para describir cualquier patrón de covariación que exista entre los dos conjuntos de variables originales (Rohlf & Corti). Éste tipo de método presta una herramienta precisa para evaluar, por ejemplo, el impacto de la geografía y el ambiente en la variabilidad fenotípica (^{Benítez et al., 2014}a; ^{Cardini et al., 2007}; ^{Ismail, 2018}), o como la variabilidad morfológica se correlaciona se relaciona con la variabilidad en el comportamiento (^{Fabre et al., 2018}) o como se relaciona la forma con los aspectos funcionales (^{Polychronis & Halazonetis, 2014}; ^{Randau & Goswami, 2018}).

Un ejemplo de un estudio que utiliza este enfoque, es el trabajo de Ismail, en el que analiza la forma del escudo del cangrejo ermitaño Clibanarius signatus, el cual habita varios hábitats intermareales del mar rojo, como costas rocas y manglares de marismas litorales, en este estudio el autor analizó la variación de la forma del escudo entre tres poblaciones de C. signatus. Para medir el efecto de las variables ambientales sobre los cambios fenotípicos, utilizó un análisis de 2B-PLS para examinar la covariación entre dos conjuntos de variables (forma de escudo entre poblaciones usando las coordenadas de Procrustes) y variables ambientales. Las variables ambientales se resumieron en 6 variables que representan variaciones de la concha (en las que habita) y en las condiciones climáticas: (1) longitud de la concha; (2) peso de la concha; (3) longitud del opérculo de la concha; (4) grado de protección costera; (5) tipo de sustrato y (6) tipo de vegetación. El autor utilizó una prueba de Mantel (10.000 permutaciones aleatorias) para evaluar si la variación del escudo está relacionada con la distancia geográfica entre los sitios de estudio, utilizando distancias geográficas en línea recta entre los sitios de muestreo. Además, comparó la matriz de distancia de Procrustes entre todos los individuos en cada sitio, con la matriz de distancia geográfica entre los tres sitios de muestreo y calculó su correlación de momento de producto. La primera matriz con- siste en la distancia de Procrustes, mientras que la segunda matriz representa la distancia geográfica (Km). Los resultados mostraron una fuerte asociación entre la variación de la forma del escudo y la longitud de la concha, la longitud del opérculo de la concha y el peso de la concha, así como baja a débil asociación con la protección de la costa, el tipo de sustrato y el tipo de vegetación. La relación entre la forma del escudo y la distancia geográfica fue insignificante (Fig. 10). Esto sugiere que la relación entre la forma del escudo y la concha podría ser resultado de la plasticidad fenotípica de la especie.

Fig. 10 Análisis de 2B-PLS para la forma del escudo de C. signatus y las condiciones ambientales (^{Ismail, 2018}). 

Otro trabajo de la misma línea, es el trabajo de Fabre et al., pero en este caso los autores analizaron la covariación de la forma de los huesos largos de las extremidades anteriores con el comportamiento de agarre en los primates estrepsirrinos. Para esto los autores trabajaron con variables de forma obtenidas mediante el uso de semilandmarks 3D de desplazamiento, para cuantificar las formas y curvaturas de cada uno de los huesos largos de las extremidades anteriores en 22 especies de primates estreptirrinos. Luego, mediante el uso de 2B-PLS analizaron la covariación entre la forma de los huesos largos y la conducta de agarre. Debido a que las especies comparten una historia evolutiva, no pueden ser tratadas como datos independientes. Para esto se corrigió el análisis cuantificando el grado de coevolución entre la forma media de cada especie para cada hueso largo y el comportamiento de agarre, teniendo en cuenta la filogenia mediante un algoritmo de mínimos cuadrados parciales generalizados bajo un modelo de evolución de movimiento Browniano. Los valores de PLS evolutivos se calcularon a partir de los dos bloques de datos filogenéticamente corregidos, y se evaluó la correlación evolutiva entre los dos bloques de los valores de PLS (rPLS). Se evaluó la significancia de la correlación PLS utilizando permutaciones filogenéticas, donde la forma o los valores de comportamiento de agarre para todas las especies para un bloque se permutaban en los tips de la filogenia. Los valores de correlación así derivados, se obtuvieron a partir de los conjuntos de datos permutables y pueden compararse con el valor observado. Como resultado, los autores encontraron existe una señal filogenética débil, aunque significativa, en el comportamiento de agarre y la forma del cúbito y el radio, y una señal filogenética moderada y significativa en la forma del húmero. Además encontraron que existe una marcada coevolución entre el comportamiento de agarre y la forma del húmero (Fig. 11) y el radio (Fig. 12). Este hallazgo sugiere una asociación funcional entre el agarre y la forma de la extremidad anterior, lo que a su vez sugiere que la forma ósea limita o facilita el comportamiento de agarre.

Fig. 11 Resultados del análisis de 2B-PLS entre la forma del húmero y el comportamiento de agarre para el análisis realizado en el conjunto de datos. Diagrama de dispersión de los primeros ejes PLS que describen la coevolución entre la forma del húmero y el comportamiento de agarre. Los círculos y cuadrados representan la familia a la que pertenece cada especie. Las formas humorales (lado izquierdo) asociadas a cada mínimo y máximo de coevolución se ilustran en los extremos derecho e izquierdo, respectivamente, mientras que al centro se representa la forma intermedia, en la parte inferior de la gráfica de dispersión. Las cargas de comportamiento de agarre asociadas con la covariación de la forma humeral están representadas por el diagrama de barras a la izquierda del diagrama de dispersión. Los comportamientos utilizados para agarrar objetos grandes se representan en gris y los utilizados para agarrar objetos pequeños en blanco. Abreviaturas: O, oral; U, unimanual; MU, bucal-unimanual; MB, bucal-bimanual; B, bimanual (^{Fabre et al., 2018}). 

Fig. 12 Resultados del análisis de 2B-PLS entre la forma del radio y el comportamiento de agarre para el análisis realizado en el conjunto de datos. Diagrama de dispersión de los primeros ejes PLS que describen la coevolución entre la forma del radio y el comportamiento de agarre. Los círculos y cuadrados representan la familia a la que pertenece cada especie. Las formas humorales (lado izquierdo) asociadas a cada mínimo y máximo de coevolución se ilustran en los extremos derecho e izquierdo, respectivamente, mientras que al centro se representa la forma intermedia, en la parte inferior de la gráfica de dispersión. Las cargas de comportamiento de agarre asociadas con la covariación de la forma humeral están representadas por el diagrama de barras a la izquierda del diagrama de dispersión. Los comportamientos utilizados para agarrar objetos grandes se representan en gris y los utilizados para agarrar objetos pequeños en blanco. Abreviaturas: O, oral; U, unimanual; MU, bucal-unimanual; MB, bucal-bimanual; B, bimanual (^{Fabre et al., 2018}) 

DISCUSIÓN

Ya desde sus inicios, a fines de la década de los 70’s, la MG ha sido una valiosa herramienta que ha entregado información mucho más precisa que la MT, particularmente por su base matemática más robusta, lo que ha permitido realizar estudios más complejos con preguntas más sofisticadas.

En las últimas décadas, el uso cada vez más masivo de MG ha propiciado que más investigadores realicen actualizaciones de los métodos usados, correcciones matemáticas de los índices, recomendaciones o nuevos enfoques metodológicos (^{Adams, 2016}; ^{Openshaw et al., 2016}; Maga et al.; ^{Attard et al., 2018}; ^{Felice et al.; Karakostis et al., 2018}; Palci & Lee, 2018; Simons et al.; Weaver & Gunz), lo que ha permitido un crecimiento exponencial de preguntas y problemáticas que se intentan resolver con MG, desde la variación del espacio morfológico en un contexto de biología del desarrollo (Maestri et al.; ^{Fernandez Blanco et al., 2018}; Simons et al.), hasta la asociación de la variación en un contexto macroevolutivo (Adams & Collyer; Maiorino et al.; ^{Randau & Goswami, 2018}; ^{Taverne et al., 2018}).

El objetivo de muchos estudios morfométricos es encontrar y explorar las relaciones entre diferentes conjuntos de variables. Por ejemplo, los estudios de alometría analizan la asociación entre el tamaño y la forma en una muestra de especímenes, los estudios ecomorfológicos caracterizan las relaciones entre datos ecológicos y morfológicos, y los análisis de la selección natural pueden investigar los efectos de la morfología en la adecuación biológica de los organismos (^{Klingenberg, 2010}). El incremento de estudios metodológicos que han incorporado la morfometría geométrica, ha permitido utilizar varias estrategias para estudiar la covarianza entre conjuntos de variables dependiendo de la naturaleza específica de la relación entre ellas y de los objetivos del análisis. Dentro de este paradigma de comprender las relaciones entre covariables y la forma geométrica de los organismos es que estudios asociados a procesos del desarrollo morfológico adquirieron fuerza en los últimos años con metodologías directas como el estudio de la integración, modularidad y principalmente patrones de simetría llevando a la MG a estudiar la inferencia de la variación morfológica en sus procesos de desarrollo. Es importante destacar, que estos procesos generalmente se expresan en patrones de covarianza entre rasgos, por ejemplo, asociaciones de cambios adaptativos, que resultan de la variación en el proceso de desarrollo. Si el proceso no varía en absoluto, es decir, si se desarrolla exactamente de la misma manera en todos los individuos, entonces significa que no habrá ninguna información de variación en los rasgos morfológicos, por lo tanto enfoque por lo tanto fallaría (Klingenberg, 2010).

Es importante entender estos avances metodológicos como una forma de depuración y refinamiento de los resultados, eliminando efectos algorítmicos en éstos, para estar más relacionados a un trasfondo biológico (^{Adams, 2016}; ^{Klingenberg, 2013}b). Así mismo, existe la necesidad de realizar estudios de forma en un contexto evolutivo, analizando las variaciones morfológicas en un contexto filogenético, para responder preguntas con componentes multidimensionales (^{Cardini & Elton, 2008}; ^{Fernandez Blanco et al.; Maiorino et al.; Morningstar et al., 2018}; Simons et al.).

Los métodos morfométricos para visualizar tendencias macroevolutivas en datos multidimensionales, recientemente han comenzado a dar resultados, luego de años de controversia en su uso (Adams & Collyer). Uno de los patrones más importantes a calcular en evolución fenotípica, es el grado de señal filogenética el cual solo después de los últimos años de extensiva investigación se pueden cuantificar de manera confiable y además de caracterizar patrones de covariación, tanto dentro de fenotipos multivariados como entre fenotipos multivariados y otras variables (Adams & Collyer).

Finalmente, el objetivo del presente artículo fue realizar una revisión en las últimas actualizaciones en la MG, con tal de entregar una nueva perspectiva, ampliando el conocimiento en los usos metodológicos de esta herramienta para responder nuevas interrogantes cada vez más complejas, tanto en contextos ecomorfológico como morfoevolutivos. Sin duda, este campo está en un proceso de aumento metodológico exponencial lo que genera de forma imperativa la necesidad de comprender las nuevas metodologías. Por lo tanto, con este trabajo pretendemos ser un primer punto de partida para aquellos investigadores que se están iniciando en la MG, y que así, en un futuro, esta se pueda seguir expandiendo para facilitar las respuestas a preguntas cada vez más complejas y sofisticadas.