INTRODUCCIÓN

Se sabe que el músculo esquelético tiene la capacidad de regenerar nuevas fibras musculares después de haber sido dañado por una lesión, o como consecuencia de enfermedades (^{Huard et al., 2002}). El proceso de reparación muscular parece ser similar en los diferentes mamíferos y, en rasgos generales, sigue el mismo programa para cada músculo. En circunstancias normales, el músculo esquelético adulto de mamíferos es un tejido estable con muy poca rotación de núcleos, sin embargo, después de una lesión, el músculo esquelético tiene la notable capacidad de iniciar un proceso de reparación rápido y extenso que previene la pérdida de masa muscular (^{Fu et al., 2018}).

Independientemente del tipo o la gravedad de la lesión, la reparación del músculo esquelético sigue un patrón establecido, que se puede dividir en tres fases: la fase de destrucción/inflamación, de reparación y de remodelación (^{Lehto & Järvinen, 1991}; Huard et al.; Järvinen et al., 2005). La fase inicial de la reparación muscular se caracteriza por necrosis del tejido dañado y activación de la respuesta inflamatoria. Esta fase es seguida rápidamente por la activación de células miogénicas para proliferar, diferenciarse y fusionarse, lo que conduce a la formación de miofibras y reconstitución de un aparato contráctil funcional (^{Charge & Rudnicki, 2004}). Por lo tanto, el episodio inicial en este proceso es la lesión de la membrana, donde los mecanismos de necrosis son similares e independientes de la causa. Para minimizar la necrosis, la primera reacción de la célula es separar las porciones muertas de las recuperables, lo que hace por generación de nueva membrana, cubriendo las regiones todavía recuperables. Eso ocurre rápidamente y es evidente en las primeras horas. Siguiendo un programa preexistente coordinado por la expresión o inhibición de una serie de péptidos, continúan las secuencias de necrosis, inflamación, fagocitosis, revascularización, creación de nuevos miocitos y reinervación (^{Chambers & McDermott, 1996}).

Aunque las dos primeras fases del proceso de reparación muscular son similares entre los diferentes tipos de músculos, independiente de la causa de la lesión, la cinética y amplitud de cada fase pueden variar según la extensión de la lesión, el músculo lesionado o el modelo animal (^{Mitchell et al., 1992}). Sin embargo, el factor primordial para la recuperación de las fibras es la presencia de una membrana basal intacta y la sincronización que involucra la activación de varias respuestas celulares, entre las que se destacan las células satélites (^{Järvinen et al., 2000}; Järvinen et al., 2005; ^{Forcina et al., 2019}). Para el proceso de regeneración, la activación de células satélite musculares es un elemento clave, donde se han identificado factores de señalización, pero sus funciones aún no se han definido por completo (^{Chen & Shan, 2019}). Además, la evidencia reciente respalda la posible contribución de las células madre en el proceso de regeneración muscular. En particular, las células madre derivadas de la médula ósea y de los músculos contribuyen a la nueva formación de miofibras y al conjunto de células satélite después de la lesión (Klimzak et al., 2018).

El músculo esquelético puede regenerarse completa y espontáneamente en respuesta a lesiones menores, como la tensión. En contraste, después de lesiones graves, la curación muscular es incompleta, lo que a menudo resulta en la formación de tejido fibrótico que deteriora la función muscular (^{Laumonier & Menetrey, 2016}). El músculo esquelético representa hasta el 40% de la masa corporal total siendo sus lesiones muy comunes en la práctica clínica (^{Mori et al., 2015}), en atletas y otros ámbitos, como en accidentes automovilísticos, laborales o en secuelas de procedimientos quirúrgicos, entre otros (^{Sánchez & Segovia, 2017}). Para promover la reparación y regeneración muscular, se han desarrollado diferentes estrategias en el siglo pasado y especialmente durante las últimas décadas, que incluyen técnicas quirúrgicas, fisioterapia, biomateriales e ingeniería de tejido muscular, así como terapia celular (^{Pereira et al., 2013}). Aunque los investigadores han estudiado ampliamente varios enfoques para mejorar la reparación muscular, su tratamiento actualmente es controversial. Por lo tanto, existe una gran necesidad de desarrollar nuevos métodos y materiales que promuevan la reparación del músculo esquelético y la regeneración funcional.

Considerando este contexto, varios estudios validan la acción de la miel en la cicatrización (^{Gethin & Cowman, 2005}; ^{Ranzato et al., 2013}; ^{Majtan, 2014}), centrándose en sus propiedades biológicas y físicas para el tratamiento de heridas de diversas etiologías, reavivando el interés en la atención clínica (^{Seckam & Cooper, 2013}; ^{Vandamme et al., 2013}). Aunque la miel se produce en todo el mundo, su potencial biológico debe evaluarse según el origen. En Chile se producen varios tipos de miel nativa con importantes propiedades biológicas, heredadas según el tipo de fuente floral. La miel del Sur de Chile contiene un gran porcentaje de ulmo (Eucryphia cordifolia), un árbol nativo, que ha demostrado tener propiedades bactericidas, fungicidas, antioxidantes y curativas (^{Sherlock et al., 2010}). Para desarrollar una miel terapéutica para uso clínico, esta miel nativa ha sido suplementada con antioxidantes, lo que culminó con la formulación Ulmoplus® (CORFO I + D-13IDL223290) (^{Schencke et al., 2018}).

Basado en lo anteriormente descrito, el propósito de este estudio fue evaluar los efectos de una formulación basada en miel nativa (Ulmoplus®) en la reparación de lesiones musculares por incisión quirúrgica.

MATERIAL Y MÉTODO

Tratamiento. Para el tratamiento se utilizó la siguiente formulación: miel monofloral nativa del Sur de Chile con el sello NHF (factor de miel nativa), que certifica niveles significativos de actividad antibacteriana (^{Fredes et al., 2013}), complementada con antioxidantes. Esta formulación fue desarrollada con el apoyo de Corporación para la Promoción de la Producción del Estado de Chile, CORFO (13IDL223290) y protegida bajo el Secreto Comercial (RS Nº3654), por lo que no puede ser revelada, y se mantiene bajo la licencia Ulmoplus®.

Animales. Fueron utilizados seis conejos adultos sanos (Oryctolagus cuniculus) de 4,3 kg aproximadamente, provenientes del Centro de Excelencia en Estudios Morfológicos y Quirúrgicos (CEMyQ) de la Universidad de La Frontera, Temuco, Chile. Fueron alimentados con pellet y agua ad libitum y mantenidos en condiciones ambientales controladas respecto a temperatura, ruido ambiental y ciclos de 12 horas luz / 12 horas oscuridad. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo para la supervisión diaria de animales, de la Guía de Aspectos Bioéticos de Experimentos con Animales (^{Wolfensohn & Lloyd, 2013}), y las directrices establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (2011).

Modelo de injuria. A cinco animales se les realizó una incisión de 20 mm de largo y 3 mm de ancho en la región anterior de cada pierna, atravesando la epidermis, dermis y el músculo tibial anterior (MTA), hasta alcanzar el periostio de la tibia. La pierna izquierda de cada animal fue clasificada como grupo sutura (S) y la derecha como grupo sutura más Ulmoplus® (S+U). Posteriormente, al grupo S+U se le aplicó Ulmoplus® en toda la extensión de la herida (desde la epidermis hasta el periostio). Luego, en ambos grupos, la incisión fue suturada con cuatro puntos intradérmico de ácido poliglicólico (vicryl 2/0). El procedimiento se realizó bajo efectos anestésicos general con una triada anestésica en base a acepromazina 5 mg, ketamina 40 mg/kg y xilazina 5 mg/ kg por vía intramuscular. A los 10 días post incisión fueron tomadas las biopsias abarcando la piel y MTA. Un animal fue considerado como control para obtener imágenes histológicas del MTA sin injuria. Una vez obtenidas las muestras fueron lavadas con solución salina y fijadas en formalina tamponada al 10 % durante 72 horas. Posteriormente, fueron deshidratadas e incluidas en paraplast (Histotec-Merck®). Se realizaron cortes seriados de 5 µm de espesor, los cuales fueron montados en portaobjetos y teñidos con Hematoxilina Eosina (HE) y Van Gieson para el análisis histológico y con Sirius Red para el análisis de colágeno tipos I y III. Las láminas histológicas fueron visualizadas bajo microscopio de luz Leica® DM2000 LED y fotografiada con cámara digital Leica® MC170 HD. Para la visualización de las fibras colágenas se utilizó un microscopio Leica® DM750 bajo luz polarizada, con cámara digital Leica® ICC50 HD.

RESULTADOS

Los conejos respondieron favorablemente a la intervención quirúrgica y el protocolo de control y seguimiento no reportó inconvenientes (Fig. 1A y C). A los 10 días post incisión, las injurias, en ambos grupos, se encontraban cerradas y sin signos de infección (Fig. 1B y D). En el grupo S se observó mayor longitud de la cicatriz y en algunos casos enrojecimiento e inflamación. El grupo S+U presentó una cicatriz de menor longitud, más plana y con mejores resultados estéticos.

Fig. 1 Región anterior de la pierna de conejo (Oryctolagus cuniculus). A. Grupo sutura (S), día cero. B. Grupo sutura (S), día 10 post incisión. C. Grupo sutura más Ulmoplus® (S+U), día cero. D. Grupo sutura más Ulmoplus® (S+U), día 10 post incisión. 

Las tinciones con HE obtenidas 10 días posterior a la incisión, mostró que el MTA de los animales del grupo S se encontraba en la fase de reparación, ya que no se evidenció edema o infiltrado de células inflamatorias (Fig. 2A). En la zona de reparación, se observaron procesos concomitantes de fagocitosis del tejido necrotizado, regeneración de miofibras y formación de tejido conectivo cicatrizal (Fig. 2B).

Fig. 2 Biopsia de músculo tibial anterior de conejo (Oryctolagus cuniculus) (grupo S). A. Se observa la dermis (Derm) con abundante cantidad de fibroblastos y fibras colágenas. En la zona de reparación (ZR) del músculo tibial anterior (mTA) se observan miocitos de pequeño calibre recién formadas. B. En la ZR se evidencia abundante tejido conectivo cicatrizal; destacan las fibras de colágeno en color fucsia. Tinciones HE y Van Gieson. 

El comienzo del proceso de regeneración lo demostró la existencia de mioblastos dentro de los cilindros de la lámina basal de las fibras necróticas (Fig. 3A) y la presencia de células miogénicas fusionadas en la zona de la injuria (Fig. 3B). La continuidad del proceso se evidenció con la presencia de miocitos multinucleados cuyas miofibrillas recién formadas mostraban mayor tamaño y mionúcleos de ubicación periférica en la fibra muscular (Fig. 3C). La apariencia de fibras musculares en regeneración y reparación muscular activa también se evidenció por la presencia de fibras con núcleos de ubicación central (Fig. 3D).

Fig. 3 Biopsia de músculo tibial anterior de conejo (Oryctolagus cuniculus) (grupo S). A. Fibra muscular necrótica (*) rodeada por mioblastos (flecha delgada). B. Sincitio de células miogénicas con múltiples núcleos vesiculares con prominentes nucléolos (fechas gruesa). C. Miocitos con núcleos periféricos (fecha amarilla). D. Miocitos de tamaño y forma variable, algunos presentan núcleos de ubicación centra. Tinción HE. 

El tejido conectivo cicatrizal producido en el sitio de la lesión se caracterizó por presentar fibroblastos, abundante colágeno tipo I, vasos sanguíneos y nervios intramusculares (Fig. 4).

Fig. 4 Biopsia de músculo tibial anterior de conejo (Oryctolagus cuniculus) (grupo S). A y B. En la ZR el tejido conectivo cicatrizal se caracteriza por presentar principalmente colágeno tipo I (color rojo). C. Se observan vasos sanguíneos de distintos calibres. D. Nervios intramusculares. Tinciones Van Gieson y Sirius Red. 

El MTA de los individuos del grupo S+U se encontraba en la fase de remodelación, ya que la arquitectura muscular se evidenciaba restablecida. En esta fase, la cantidad de tejido conectivo, y en particular el colágeno tipo I, fue menor al observado en el grupo S, sin embargo, parece ser mayor que en el músculo no lesionado. En el grupo S+U aún fue posible observar miocitos recién formadas, con núcleos de ubicación central, generalmente más pequeñas, de tamaño variable y con formas redondeadas (Fig. 5).

Fig. 5 Biopsia de músculo tibial anterior de conejo (Oryctolagus cuniculus). A, C y D imágenes del grupo S+U. B, D y F imágenes del animal control. En el músculo tibial anterior de los animales del grupo S+U se observa mayor cantidad de tejido conectivo, rico en colágeno tipo I (A y C) en comparación con el músculo tibial anterior del animal control (B y D). En el grupo S+U se observan miofibras recién formadas con núcleos periféricos (flechas) (E), mientras que en el animal control solo se observan miofibras maduras (F). Tinciones HE, Van Gieson y Sirius Red. 

DISCUSIÓN

Las lesiones del músculo esquelético son muy frecuentes y plantean problemas desafiantes en relación a su reparación y rehabilitación. A pesar de su importancia clínica, las estrategias óptimas para tratar estas lesiones no están bien definidas. En este sentido, nuestro estudio ha permitido conocer la idoneidad del uso de la miel en la reparación y regeneración de MTA de conejo lesionado por incisión quirúrgica a través de la evaluación de las características histológicas que presentó cada grupo en relación al proceso de reparación muscular.

La lesión muscular siempre será una lesión profunda, en el sentido que compromete desde la piel, fascias superficial y profunda y los elementos que se encuentran en ellas y, por su puesto, el tejido muscular. A los 10 días post incisión, las injurias en ambos grupos se encontraban cerradas evidenciando un proceso de reparación activo, lo que demuestra la excelente capacidad de reparación y regeneración que tiene el tejido muscular, característica ya señalada, entre otros, por Fu et al. No obstante lo señalado, la injuria en la región anterior de la pierna de los animales del grupo S+U, no solo presentó una cicatriz más estética, sino que también, la reparación del músculo se encontró en una fase más avanzada.

Lo anterior, se basó en lo observado histológicamente en el MTA de ambos grupos. El grupo S presentó en la zona de reparación estructuras que se observan comúnmente durante la fase de reparación, tales como, mioblastos próximos a miocitos necróticos, sincitio de células miogénicas distribuidos en la zona de reparación y miocitos de tamaño variable con núcleos centrales (^{Järvinen et al., 2005}; ^{Turner & Badylak, 2012}). El grupo S+U, en cambio, no mostró una zona de reparación evidente a nivel muscular, ya que la arquitectura del tejido se encontraba restablecida, evidenciando una fase de remodelación; su identificación se basó principalmente en la observación de miocitos de menor diámetro, en los cuales, algunos de ellos presentaban núcleos centrales.

La utilización de las tinciones Van Gieson y Sirius Red, permitió evaluar la presencia de tejido conectivo cicatrizal de mejor manera en la zona de reparación muscular. Nuestros resultados mostraron que el grupo S presentó mayor cantidad de tejido conectivo en comparación al grupo S+U. Sin embargo, se debe tener en consideración que no es posible determinar si el grupo S desarrollará fibrosis, debido a que la observación se realizó solo en un determinado momento, el día 10 post injuria, y el proceso de fibrosis comienza aproximadamente durante la segunda semana tras la lesión y no es valorable hasta la cuarta semana (^{Aurora et al., 2016}).

Otro aspecto que destacamos en ambos grupos, es la presencia de vasos sanguíneos y fibras nerviosas intramusculares en el tejido conectivo cicatrizal, ya que para una buena reparación y regeneración muscular es relevante el restablecimiento de la vascularización y la inervación (Turner & Badylak). Bajo este contexto, estudios demuestran que la miel tiene la capacidad de estimular la angiogénesis en el proceso de curación de heridas, ya que la alta presión osmótica y el peróxido de hidrógeno contenido en niveles bajos en la miel, estimula el desarrollo de nuevos capilares (^{Molan, 2002}; ^{Nakajima et al., 2013}).

Lo precedente, podría explicar, no solo la adecuada vascularización del grupo S+U, sino que además, una aceleración del proceso de reparación muscular, ya que las propiedades cicatrizantes de la miel le permiten promover además, la granulación en la zona de la injuria, estimular linfocitos, fagocitos y fibroblastos y, modular la síntesis de colágeno y su maduración (^{Schencke et al., 2016}).

En base a nuestros resultados concluimos que Ulmoplus®, como coadyuvante en el proceso de cierre de heridas quirúrgicas de músculo esquelético utilizando sutura convencional, es una buena alternativa terapéutica, ya que acelera el proceso de reparación muscular y reduce el tejido conectivo cicatrizal.