Diagnóstico rápido de dos casos de mucormicosis
con tinción de blanco de calcoflúor

PATRICIA GARCIA C.^1-2, CONSTANZA BELTRÁN M.³, ANA M. GUZMÁN D.^1-2,
T.M. PILAR LEÓN C.¹, MARCELA P. ARREDONDO A.³, Y XIMENA FONSECA A.³

RAPID DIAGNOSIS OF MUCORMYCOSIS WITH CALCOFLUOR
WHITE STAIN: REPORT OF TWO CASES

Pontificia Universidad Católica de Chile, Facultad de Medicina:
¹ Laboratorio de Microbiología.
² Unidad Docente Asociada Laboratorios Clínicos.
³ Unidad Docente Asociada Otorrinolaringología.
Establecimiento donde se realizó el trabajo: Hospital Clínico Pontificia Universidad Católica de Chile.

Rapid diagnosis of mucormycosis is important for surgical control of infection. Diagnosis is made by the observation of fungi in tissue using direct examination or using standard staining methods like hematoxylin-eosin, peryodic acid stain or Gomori`s methenamine silver. Another useful method, of limited use in our country is calcofluor white stain. Calcofluor binds to quitin and cellulose of fungi. We describe two patients with clinical suspicion of mucormycosis. The diagnosis was made intraoperatively by the direct tissue examination using this stain. Fluorescence microscopy showed characteristic wide, non-septate hyphae of Mucorales. Rhizopus sp grew in culture, confirming inicial findings.

Key words: Mucormycosis, Calcofluor white stain, Diagnosis.

Mucormicosis es el término que define un grupo de infecciones causadas por hongos del Orden Mucorales. Las especies más frecuentemente aisladas en casos de mucormicosis son Rhizopus spp y Rhizomucor spp ambas de la Familia Mucoraceae. Otras especies involucradas más raramente son entre otras, Absidia spp, Apophysomyces spp, y Cuninghamella spp. Todos ellos son de distribución mundial y el reservorio principal son las materias orgánicas como la tierra, los desperdicios vegetales y el estiércol^1,2.

El poder patógeno intrínseco de los mucorales es mínimo en individuos inmunocompetentes; sin embargo, cambia de manera radical en pacientes con alteración de la inmunidad. En estos últimos, pueden causar infecciones graves e incluso mortales de presentación fulminante. Se pueden identificar como factores de riesgo para mucormicosis la cetoacidosis diabética, leucemias y linfomas con neutropenias prolongadas, uremia, medicamentos que alteran la respuesta inmune (ej: corticoides, agentes cito-tóxicos), grandes quemados, desnutrición calórico proteica y prematurez. Las formas de presentación más habituales de la mucormicosis son el compromiso rinocerebral, pulmonar, cutáneo, gastrointestinal, del sistema nervioso central y esporádicamente cuadros de compromiso de otros parénquimas como corazón, riñones, huesos, etc. El hongo ingresa habitualmente a través del tracto respiratorio e invade los distintos parénquimas causando angioinvasión y posteriormente trombosis y necrosis del tejido³.

De lo anterior se desprende que para lograr un resultado terapéutico exitoso, debe realizarse un diagnóstico precoz, impidiendo de esta manera, la progresión de la enfermedad. En estos casos, y a pesar de disponer de terapia antifúngica, es imprescindible proceder a la intervención quirúrgica con debridación amplia, y resección o amputación de los tejidos afectados. Por esto, es de gran ayuda contar con un examen de laboratorio durante el intraoperatorio que ayude a definir la extensión y radicalidad de la cirugía. Surgen como elementos básicos para el diagnóstico: la sospecha clínica (factores de riesgo, descarga nasal negra, presencia de escaras, etc), los estudios de imágenes y los estudios microbiológicos. Estos últimos certificarán el agente etiológico⁴.

Diagnóstico microbiológico

El diagnóstico definitivo depende de la demostración del hongo en una biopsia de tejido. Si existen escaras, se deben obtener muestras de éstas y del tejido subyacente. El tejido debe ser transportado rápidamente al laboratorio. No se recomienda la toma de muestra con tórula⁵.

Examen microscópico directo: la observación del tejido preparado con KOH al 10% para destruir elementos tisulares, mostrará presencia de hifas gruesas como cinta de 10-20 mm de diámetro no septadas, con ramificaciones en ángulo recto. Debido a la presencia de quitina y alto contenido de polisacáridos en su pared, los hongos se muestran resistentes al tratamiento con álcali. La presencia de elementos miceliales de estas características en un paciente con factores de riesgo, constituye fuerte evidencia de mucormicosis, permitiendo diferenciar los mucorales de otros hongos como Aspergillus spp. Sin embargo, se requiere un observador entrenado ya que a pesar del uso de KOH, la presencia de detritus epiteliales podrían dificultar la observación (Figura 1).

Figura 1. Examen directo con KOH de Rhizopus spp. Aumento 400x. Se observan hifas no septadas, anchas, con ramificaciones en 90°, características del Orden Mucorales.

Examen microscópico en tejido fijado: pueden utilizarse diferentes tinciones, como hematoxilina-eosina, ácido peryódico de Schiff o tinción con metenamina de plata de Gomori, todas ellas sustentadas en la presencia de quitina y polisacáridos en la pared fúngica. Sin embargo, todas ellas requieren un mayor tiempo de procesamiento, y no estarán disponibles en el intraoperatorio.

Cultivo de hongos: permite la identificación definitiva del microorganismo. Los muco-rales son hongos filamentosos monomórficos que crecen rápidamente (2 a 5 días) en la mayoría de los medios de cultivo. Sin embargo, el tiempo de incubación requerido tampoco permite un apoyo en el intraoperatorio (Figura 2).

Figura 2. Rhizopus spp en cultivo agar Saboraud.

Tinción fluorescente de calcoflúor: es un método de tinción fluorescente para la detección de hongos incluyendo Pneumocystis carinii. Maeda & Ishida en 1967, describieron que este blanqueador de algodón fluorescente, podía teñir hongos al exponerlo a la luz UV⁶. Hageage y Harrington lo utilizaron para la tinción de tejidos fijados en parafina, logrando identificar hifas y esporas^7,8.

La tinción se basa en la capacidad del blanco de calcoflúor para unirse a los ß 1-3, ß 1-4 polisacáridos (celulosa y quitina) de la pared fúngica, y en que el compuesto exhibe fluorescencia cuando se expone a luz ultravioleta, permitiendo delinear claramente elementos fúngicos. Al igual que en un examen directo se observarán hifas anchas, no septadas, con ramificaciones en ángulo recto. Se puede utilizar en tejidos frescos y/o congelados, fijados en parafina y en cultivos puros. Este método no sirve para teñir bacterias. Otros elementos como por ejemplo fibras vegetales (algodón) que pudieran teñirse, deben diferenciarse cuidadosamente por la morfología. Para realizar esta tinción, el tejido debe ser tratado con KOH al 10% e igual proporción de solución de calcoflúor al 0,05%. Para examinar el extendido se requiere un microscopio de fluorescencia. Las estructuras fúngicas se observarán verde claro o azul, dependiendo del filtro UV que se utilice (Figuras 3 y 4).

Figuras 3 y 4. Tinción blanco de calcoflúor, observación con microscopio de fluorescencia con distintos filtros. Aumento 400x.

CASO CLÍNICO 1

Paciente holandés de 40 años de edad, quien fuera transplantado de médula ósea por leucemia linfática aguda cromosoma Philadelphia positivo, con recaída posterior. Actualmente sólo con terapia paliativa.

Consultó en nuestro hospital por historia de tres días de evolución caracterizada por prurito ocular derecho asociado a edema bipalpebral doloroso. Al ingreso destacaba: paciente afebril, en buenas condiciones generales, globo ocular

derecho protruido, edema y eritema palpebral y facial, sin adenopatías palpables. Los exámenes mostraban un hematocrito de 25%, con recuento de blancos de 1.200/mm³, 60% de neutrófilos y recuento de plaquetas 1.000/ mm³. La TAC evidenció una celulitis orbitaria derecha asociada a una sinusitis etmoidomaxilar del mismo lado (Figuras 5a y b). Se inició tratamiento antimicrobiano con vancomicina e imipenem en dosis habituales, indicándose paralelamente drenaje endoscópico etmoidomaxilar inmediato en pabellón. En el intraoperatorio no se constataron costras ni necrosis de la mucosa nasal y se tomaron muestras para realizar, entre otros exámenes, tinción de calcoflúor y cultivo de hongos. La tinción de calcoflúor mostró hifas anchas no septadas, sugiriendo la presencia de un mucoral. Por este motivo, se agregó al tratamiento anfotericina B, en dosis de 70 mg ev/día evolucionando de manera satisfactoria. Posteriormente en el cultivo se demostró el desarrollo de Rhizopus spp confirmando el hallazgo de la tinción con blanco de calcoflúor. El paciente fue trasladado a su país 4 días después del ingreso manteniéndose en tratamiento.

Figura 5a. Caso clínico 1. TAC de cavidades paranasales, corte transversal. Proptosis globo ocular compatible con celulitis orbitaria derecha.

Figura 5b.Caso clínico 1. TAC de cavidades paranasales, corte transversal. Velamiento maxilar y esfenoidal sin erosión ósea, compatible con sinusitis maxilo-esfenoidal derecha.

CASO CLÍNICO 2

Paciente varón de 32 años, procedente de Rengo, con antecedentes de insuficiencia renal crónica e hipertensión arterial de etiología no precisada, en tratamiento irregular con enalapril. Encontrándose en buenas condiciones generales, cuatro días previos al ingreso, inició cuadro caracterizado por compromiso del estado general, epífora del ojo izquierdo y fotofobia moderada, agregándose aumento de volumen palpebral izquierdo doloroso, náuseas y vómitos en dos oportunidades, fiebre cuantificada hasta 37,8° C y singulto incontrolable. Al segundo día de evolución consultó en Rengo, indicándose amoxicilina 500 mg cada 8 horas, durante 5 días. Al completar un día de tratamiento, el paciente notó disminución de la diuresis sin nuevos síntomas. Fue visto nuevamente en Rengo siendo derivado a nuestro centro para evaluación por especialista. En el examen físico de ingreso destacaba: paciente febril, en regulares condiciones generales, con edema bipalpebral y globo ocular izquierdo protruido, asociado a ceguera y falta de reflejo fotomotor del mismo lado, sin rinorrea ni descarga posterior. Los exámenes mostraban un hematocrito de 19,4%, con recuento de blancos de 19.300/mm³ y 89% de neutrófilos. La TAC mostró una celulitis orbitaria y velamiento etmoidomaxilar ipsilateral (Figura 6). La RM mostró además trombosis del seno cavernoso y vasculitis del territorio carotídeo izquierdo. Se decidió realizar vaciamiento etmoidomaxilar por vía endoscópica y obtención de muestras para cultivo y biopsias. En la cirugía destacaba la mucosa violácea y sangrante, sin evidencias de costras o zonas de necrosis. En la apertura del seno maxilar se encontró escaso material blanquecino que fue enviado al laboratorio. La tinción de calcoflúor mostró presencia de hifas no septadas sugerentes de un mucoral. Por lo anterior se inició tratamiento con anfotericina B hasta completar una dosis total de 2 gr y realizar cirugía de enucleación del ojo izquierdo y apertura completa de las paredes del seno maxilar. El cultivo confirmó la presencia de Rhizopus spp. El paciente evolucionó favorablemente, encontrándose actualmente en control.

Figura 6.Caso clínico 2. TAC de cavidades paranasales, corte coronal. Velamiento maxilar y etmoidal sin erosión ósea, compatible con sinusitis maxilo-etmoidal izquierda.

COMENTARIO

La mucormicosis rinocerebral o craneofacial es una condición dramática y clínicamente característica; sin embargo, puede ser confundida con una trombosis del seno cavernoso, una celulitis orbitaria bacteriana, o una aspergilosis rinocerebral. Debido a que la mucormicosis es una condición grave, y existiendo la sospecha clínica, se debe iniciar inmediatamente la búsqueda de signos claves para establecer un diagnóstico microbiológico de certeza. La clave más útil es la presencia de escaras negras necróticas en la nasofaringe o en el paladar que a veces son confundidas con sangre coagulada, elemento que estuvo ausente en los dos pacientes descritos. Como se mostró en ellos, la tinción de blanco de calcoflúor resultó de gran utilidad en el diagnóstico intraoperatorio de mucormi-cosis, entregándole al médico la información fundamental para su toma de decisiones. El método permitió examinar el tejido fresco con gran rapidez mostrando las estructuras fúngicas claramente, sin presentar dificultades para el operador. Es además un examen de bajo costo y que requiere solamente un microscopio de fluorescencia, lo que nos permite sugerirlo como un test a implementar en cualquier laboratorio clínico que reciba este tipo de muestras. Si bien la incidencia de la mucormicosis es baja, el apoyo como elemento diagnóstico será trascendental para el inicio de la terapia apropiada y por tanto mejorar el pronóstico del paciente.

RESUMEN

El diagnóstico precoz de la mucormicosis es de vital importancia para el manejo del paciente, definiendo extensión y radicalidad de la cirugía. El diagnóstico se basa en la demostración del hongo en biopsias, por examen directo con KOH, o con tinciones clásicas como hematoxilina-eosina, ácido peryódico o tinción de plata. Otra técnica útil y de poca difusión en nuestro país es el blanco de calcoflúor, tinción fluorescente que se une a la quitina y celulosa de la pared fúngica. Se describen 2 casos de mucormicosis, en los cuales el diagnóstico inicial se realizó a través de esta técnica. En forma rápida e intraoperatoria se visualizaron bajo microscopio de fluorescencia hifas anchas no septadas características de los hongos pertenecientes a la Orden Mucorales. La observación de las estructuras fúngicas resultó fácil y discriminatoria. Posteriormente por cultivo fueron confirmados como Rhizopus spp.

BIBLIOGRAFÍA

1.- Borel C. Mucormicosis. Rev Otorrinolaringol Cir Cab Cuello. 1987; 47: 29-35.

2.- Sugar A. Agents of mucormycosis and related species. En Mandell, Douglas & Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. Mandell G L, Bennett J E, Dolin R eds. 5th edition. 2000. Churchill Livingstone, Philadelphia pp 2311-9.

3.- Bravo M, Ferrer S, Etchart M, Tru-jillo S. Mucormicosis rinocerebral. Comunicación de cuatro casos. Rev Méd Chile 1999; 127: 712-8.

4.- Monheit J, Cowan D, Moore D. Rapid detection of fungi in tissues using calcofluor white and fluorescent microscopy. Arch Pathol Lab Med 1984; 108: 616-8.

5.- Richardson M, Shankland G. Rhizopus, Rhizomucor, Absidia, and other agents of subcutaneous Zygomycoses. Murray P, Baron E, Pfaller M et al. Manual of Clinical Microbiology. 7^th Edition, Washington, ASM Press 1999; 1242-57.

6.- Maeda H, Ishida N. Specificity of binding hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brigtheners J. Biochem 1967; 62: 267-78.

7.- Harrington B, Hageage G. Calcofluor white: tips for improving the use. Clin Microbiol News 1991; 13: 3-5.

8.- Hageage G J, Harrington B J. The use of calcofluor white in clinical mycology. Abstracts and Program of the 26^th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Atlanta Oct 1-4 1978; 183.

Correspondencia a:
Patricia García C.
E-mail: pgarcia@med.puc.cl