但是上述突变较少见，只能对原发性耐药做出部分解释。EGFR突变的NSCLC对EGFR信号通路高度依赖，称为EGFR依赖或成瘾，当应用EGFR抑制剂时，这些通路被关闭而发生凋亡，然而EGFR野生型的NSCLC中没有此EGFR依赖来调控下游信号通路，可能伴有其它信号通路的异常，因此对EGFR-TKIs不敏感。研究[6]发现大约有10%-30%的NSCLC患者存在KRAS基因突变，这些突变与吸烟之间具有很强的相关性，而EGFR突变却常常发生在非吸烟者的亚裔患者中，这些数据说明KRAS和EGFR突变很少同时出现在同一类型的肿瘤中。另有研究[7]显示KRAS突变与EGFR突变互相排斥，也就是说该突变大多存在于EGFR野生型肿瘤，这可能是导致EGFRTKIs原发性耐药的另一重要机制。KRAS基因突变主要发生于第12、13位密码子，这两种密码子主要发生G-T颠换，突变的结果导致编码的氨基酸发生改变，持续性激活EGFR非依赖性信号通路，导致瘤细胞增殖、转移以及凋亡抵抗，进而对EGFR-TKIs产生原发性耐药。KRAS突变在高加索人群NSCLC患者的突变率较高[8]，尤其是在肺腺癌患者中突变率达30%-50%，而EGFR的突变率较低（3%-8%），这可能是高加索人群对TKIs原发性耐药发生率较高。BR.21安慰剂对照试验[9]对KRAS与EGFR基因型对厄洛替尼治疗效果的影响进行了评估，结果显示，KRAS野生型患者（HR=0.69, P=0.03）可从厄洛替尼治疗中获得统计学意义上的生存益处，而KRAS突变型（HR=1.67, P=0.31）生存获益则未达到统计学意义。Sasaki等[10]分析研究了172例日本NSCLC患者的KRAS突变及其基因拷贝数的联系，以及与生存期的关系，结果显示仅KRAS突变与肺癌患者的生存期有关，KRAS突变及其基因拷贝数增加导致患者预后不良。因此，以上研究提示KRAS基因突变与肺癌患者对EGFR-TKIs的原发耐药有关，利用KRAS基因检测可以为TKIs药物治疗病人的筛选提供重要参考。

KRAS信号途径的其它信号分子可能与EGFR-TKIs的原发耐药有关，如BRAF（Raf亚型）突变。BRAF基因是RAF家族的成员之一，该家族还包括ARAF和RAF1。BRAF编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学过程，如细胞增殖、分化和凋亡等，与肿瘤的发生关系密切。研究表明约3%的NSCLC存在BRAF突变，最常见的BRAF突变发生在BRAF激酶区活性部分的600位，由谷氨酸取代了缬氨酸（V600E），突变可激活MEK-ERK信号传导通路，诱导细胞增殖和分化。BRAF突变的NSCLC对EGFR信号通路缺乏依赖性，故对EGFRTKIs有耐药性，而对MEK抑制剂敏感[11]。因此，应用靶向BRAF及整个RAF家族或它的效应器（如MEK）的药物，可对部分BRAF突变患者临床获益。

另外有研究[12]结果表明，棘皮动物微管相关蛋白样4（EML4）/间变淋巴瘤激酶（ALK）融合基因（EML4-ALK融合基因）与TKIs耐药有关，约3%-5%的NSCLC患者可发现EML4-ALK基因重排，EML4-ALK基因重排常导致异常酪氨酸激酶表达。2009年Shaw等[13]分析了141例NSCLC患者EML4-ALK的突变情况，发现19例患者存在EML4-ALK突变（13%），这些多为不吸烟或轻度吸烟及腺癌患者，且EML-ALK阳性患者通常对TKIs治疗无效。因此需要转变对这部分患者的治疗策略，例如针对ALK的靶向治疗。

3.2.1 T790M突变 EGFR二次突变是第一个被国际上认可的引起EGFR-TKIs获得性耐药的机制，率先由Kobayashi等[17]2005年发表在N Engl J Med上的文章提出。该研究对1例治疗前有EGFR 19外显子敏感活化突变（del L747-S752）、接受吉非替尼二线治疗达完全缓解24个月后出现进展的肺腺癌患者进行二次活检，分析其活检组织EGFR基因突变情况，发现在原有突变基础上，EGFR基因发生了第二次突变，突变位点在20外显子，即酪氨酸激酶活化域的790位苏氨酸残基被甲硫氨酸取代，从而形成位阻效应，在空间上阻碍了吉非替尼和厄洛替尼的连接。近年来的研究[18]显示，T790M突变增加了EGFR与ATP之间的亲和力，相对削弱了与EGFR-TKIs的亲和力。因此针对T790M突变导致TKIs耐药的NSCLC，可给予不可逆性的多靶点抑制剂作为后续治疗。

T790M突变是怎样产生的呢？为了说明这一问题，2006年Inukai等[19]用一种使T790M突变富集的高敏感性PCR检测方法，从280例未经吉非替尼治疗的NSCLC患者中发现9例T790M突变（3.6%），而用直接测序方法仅检出1例，据此作者提出了假说：经过EGFR-TKls治疗后敏感肿瘤细胞被杀灭，而其有T790M突变的耐药肿瘤细胞则被选择性存活下来。Maheswaran等[20]通过用一种高敏感的PCR方法，对26例具有EGFR突变的NSCLC患者外周血循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）及肿瘤组织进行了分析，有10例在血液中检测出了具有T790M突变的肿瘤细胞（38%），且只有以很高的扩增循环数才能检测到，发现该突变不仅存在于接受EGFR-TKIs治疗的患者肿瘤细胞中，还存在于治疗前的肿瘤组织中，突变表明PFS持续时间更短。以上研究结果表明，T790M突变在未经EGFR-TKIs治疗的肿瘤细胞中有微克隆存在，治疗过程中这些克隆被选择性富集。

3.2.2 MET扩增 原癌基因MET扩增是导致EGFR-TKIs获得性耐药性的另一重要机制。MET是肝细胞生长因子（HGF）/分散因子的一种高亲和力的酪氨酸激酶受体，被激活后发生自身磷酸化，引起多种底物蛋白磷化和细胞内一系列信号传导，激活MAPK-ERK1/2及P13K-Akt等信号通路，促进多种瘤细胞的生长、侵袭和转移。2007年Engelman等[21]构建了一株开始对吉非替尼敏感的但暴露在递增浓度的吉非替尼6个月后产生对其耐药的克隆的细胞株，结果发现这一耐药归因于MET原癌基因的扩增。研究者提出MET扩增导致的吉非替尼耐药是通过以ErbB3介导的PI3K通路持续激活，从而绕过了受抑制的EGFR靶点而产生。

由于MET扩增可促进TKIs耐药性的产生，多个MET抑制剂正在研究中，如HGF抗体（AMG102）、MET抗体（MetMAb）及MET小分子抑制剂（XL184、ARQ 197、SGX-523等）。其中ARQ197是一种选择性的METTKIs，应用于晚期NSCLC的II期临床研究[22]显示，厄洛替尼+ARQ197组的PFS为16.1周，而厄洛替尼+安慰剂组为9.7周。联合EGFR-TKIs和c-MET抑制剂可能延缓耐药，但有待进一步研究结果证实。

3.2.3 其它机制 对TKIs获得性耐药的患者，约30%-40%既无继发突变，也无MET扩增，这些患者耐药机制的研究还在进行中。可能的机制如下：

肿瘤细胞从上皮细胞向间充质细胞转化（epithelialmesenchymal transition, EMT)，是生物胚胎形成和发育常见的生理过程，同时还存在于多种病理过程中，与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移有着密切的关系。EMT以上皮标记物蛋白（如E-钙粘蛋白、EpCAM等）的下调及间叶标记物蛋白（如波形蛋白、纤连蛋白等）的上调为特征。研究[23]发现，当发生EMT的肺癌重新表达E-钙粘蛋白后，肿瘤细胞可恢复对EGFR-TKIs治疗的敏感性。Yauch等[24]收集了87例化疗联合厄洛替尼治疗后复发的肺癌患者，对其中的65例进行分析后发现，E-钙粘蛋白高表达的患者PFS更长（HR=0.37），而对厄洛替尼不敏感的肺癌组织往往合并波形蛋白和（或）纤连蛋白等标记物的表达。以上研究提示EMT状态可作为预测EGFRTKIs疗效的潜在因素，这仍需进一步研究确定是否有临床意义[25,26]。

胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R）是一种跨膜蛋白，在致癌性转化、肿瘤细胞生长和存活起到非常重要的作用。有研究[27]指出，EGFR-TKIs可诱导NSCLC细胞膜表面EGFR/IGF1R异源二聚体化进而激活IGF-1R及其下游信号通路MAPK和P13K/AKT的转导，并能刺激mTOP介导的survivin蛋白合成引发抗凋亡效应，从而引起肺癌患者对TKIs耐药。 另一项体外研究[28]显示，对吉非替尼耐药的细胞株中，IGF结合蛋白3（IGFBP3）及IGF结合蛋白4（IGFBP4）表达下调，与IGF-1R及其下游信号通路转导的激活有关。EGFR高表达的样本中也伴随着IGFR-1的高表达，因此EGFR和IGF-1R双靶点抑制剂可作为潜在的治疗策略。