分析TCRβ链恒定区结构域蛋白TRBC1在成熟T细胞淋巴瘤（TCL）中的表达特点，并与TCRVβ分析和TCR基因重排结果比较，探索TRBC1在TCL诊断中的价值。
通过多参数流式细胞术（FCM）检测南京医科大学第一附属医院血液科收治的30例TCL患者（TCL组）、40名正常对照和50例无T淋巴细胞增殖性疾病患者（非TCL组）TRBC1的表达特点，同时分析TCRVβ受体库检测、TCR基因重排与TRBC1限制性表达检测在TCL中的诊断价值。
正常对照组CD4+T和CD8+T细胞亚群TRBC1阳性表达率分别为（39.6±6.5）%和（39.3±4.4）%，非TCL组患者CD4+T和CD8+T细胞亚群TRBC1阳性表达率分别为（39.1±3.8）%和（36.0±8.4）%，TRBC1表达在两组中均呈双相表达模式。TCL组患者均为CD3+TCRγδ-，TRBC1阳性表达率>92.3%或<12.7%，所有病例均呈限制性表达模式（单克隆表达），与正常对照和非TCL组相比差异有统计学意义（P<0.001）。在T细胞克隆性检测效能方面，TRBC1灵敏性为100%，TCR基因重排阳性检出率为92.8%，TCRVβ流式试剂盒敏感性为94.1%，Kappa检验显示，三种检测方法一致性较高。
多参数FCM检测TRBC1表达水平能够快速高效地诊断TCL，具有较好的临床应用价值。
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成熟T细胞淋巴瘤（mature T cell lymphoma，TCL）是一类异质性血液系统恶性肿瘤，特点为T淋巴细胞的克隆性增殖[1]。常用的实验室诊断方法包括病理学、细胞形态学、分子生物学、流式细胞术免疫表型分析等。发现T细胞的单克隆表达是诊断TCL的重要依据，目前T细胞受体（TCR）基因重排和TCRs二代测序是评估T细胞克隆性的分子学方法[2,3]，但由于操作复杂、报告解读专业性高等因素，其临床推广受到一定限制。目前也有实验室采用流式细胞术（FCM）检测TCRβ链可变区（TCRVβ）受体库，共有24种亚家族，可以覆盖70% T细胞克隆的亚家族。虽有报道显示该方法检测T细胞肿瘤灵敏度为89%，特异性为88%[4,5]，但由于成本要求较高，且覆盖面有限，在常规实验室推广应用有一定困难。近年来有研究发现一种针对人TCRβ链恒定区结构域（TRBC1）的单克隆抗体，可快速评估T细胞克隆的免疫表型，对TCL特异性较高[6]。本研究回顾性分析南京医科大学第一附属医院30例确诊TCL的免疫表型特征，并与TCR基因重排及TCRVβ受体库检测结果比较，探索TRBC1在TCL与非TCL中的表达差异及其在临床诊断中的价值。
纳入2021年1月-7月在南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）血液科住院的30例TCL患者作为TCL组，纳入50例无T淋巴细胞增殖性疾病患者作为非TCL组。综合患者的临床症状、细胞形态学、免疫表型、组织病理学及影像学等检查结果，疾病诊断均符合2016年世界卫生组织造血和淋巴肿瘤分类修订版[7,8]。随机选取同时期40名体检健康者的外周血样本作为正常对照组。
无菌操作下抽取2 ml骨髓或外周血，EDTA抗凝，在24 h内进行FCM检测。应用多参数FCM分析各组细胞表面不同抗原的表达情况，单克隆荧光抗体组合方案：CD3-PerCP-Cy5.5/CD4-PE/CD8-APC-Cy7/CD2-PE-Cy7/CD5-V450/CD7-APC/CD45-BV605/TCRγδ-APC-A750/TRBC1-FITC，所有抗体均购自美国Beckman公司。抗体与标本混匀后，室温下避光孵育20 min，用氯化铵溶血素裂解红细胞，PBS洗涤后上机检测。用美国Beckman Navios流式细胞仪收集100 000个细胞，以CD45/SSC、CD3/SSC等散点图设门，结合各个抗原的表达设门异常CD3+ T淋巴细胞，使用Kaluza Version 2.1（美国Beckman公司）分析目标细胞群体的免疫表型特点。
用Ficoll-Hypaca分离外周血或骨髓单个核细胞。通过QIAamp试剂盒（德国Qiagen公司）提取和纯化DNA。采用超微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司）检测DNA浓度与纯度。按照基因重排试剂盒（美国Invivoscribe公司产品）说明书进行操作。应用生物系统VeriTi热循环器（美国Applied Biosystems公司）对TCR Vβ、Dβ、Jβ、Vγ、Jγ片段进行PCR扩增，反应条件为：95 ℃反应7 min，95 ℃反应35 s，60 ℃反应45 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物与甲酰胺及GeneS-can-500 LIZ（美国Applied Biosystems公司）混合，经95 ℃反应2 min热变性，4 ℃反应5 min后采用3500 Dx基因扫描分析仪（美国Applied Biosystems公司）进行基因片段扫描分析。将已知TCR重排阳性参考品作为阳性对照，正常人单核细胞作为阴性对照[9]。
采用SPSS 19.0及GraphPad Prism 6.0统计分析软件进行数据分析，根据数据分布类型，正态分布资料采用"均数±标准差"表示，偏态分布资料采用"中位数（范围）"表示，正态分布资料比较采用t检验或单因素方差分析，偏态分布资料比较采用非参数检验。分类变量资料采用"率"或"构成比"表示，组间比较采用Kappa检验或χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
30例TCL患者中，男17例（56.7%），女13例（43.3%），中位年龄52（12~77）岁。其中外周T细胞淋巴瘤非特指型（PTCL-NOS）17例，T细胞大颗粒淋巴细胞白血病（T-LGLL）5例，T细胞幼淋巴细胞白血病（T-PLL）5例，结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤（ENKTCL）2例，ALK阴性间变大细胞T细胞淋巴瘤（ALK-ALCL）1例，骨髓浸润24例。50例非TCL患者中，男28例（56.0%），女22例（44.0%），中位年龄58（20~73）岁，其中巨幼细胞贫血1例，再生障碍性贫血（AA）2例，B淋巴细胞增殖性疾病（B-LPD）21例，多发性骨髓瘤（MM）7例，骨髓增生异常综合征（MDS）3例，急性髓系白血病（AML）16例。正常对照组中，男21例（52.5%），女19例（47.5%），中位年龄44（30~56）岁，既往无血液病病史。TCL组的WBC、HGB、PLT、淋巴细胞绝对计数（ALC）等临床特征与非TCL组相比差异均无统计学意义（P值均≥0.05），TCL组的WBC、HGB、PLT、ALC与正常对照组相比差异均有统计学意义（P值均<0.05）（表1）。
成熟T细胞淋巴瘤（TCL）组与非TCL组及正常对照组基线临床特征比较
成熟T细胞淋巴瘤（TCL）组与非TCL组及正常对照组基线临床特征比较
| 临床特征 | TCL组（30例） | 非TCL组（50例） | 正常对照组（40例） | P1值 | P2值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 性别（男/女，例） | 17/13 | 28/22 | 21/19 | 0.95 | 0.73 |
| 年龄[M（范围）] | 52（12~77） | 58（20~73） | 44（30~56） | 0.40 | 0.01 |
| WBC[×109/L，M（范围）] | 28.6（2.2~529.5） | 24.7（3.6~417.9） | 5.9（3.9~12.1） | 0.09 | 0.01 |
| HGB[g/L，M（范围）] | 108.0（43.0~157.0） | 95.0（34.0~140.0） | 132.0（129.0~155.0） | 0.07 | 0.01 |
| PLT[×109/L，M（范围）] | 155（28~219） | 190（19~344） | 188（109~320） | 0.05 | 0.01 |
| ALC[×109/L，M（范围）] | 21.9（0.2~151.5） | 18.6（1.0~390.3） | 2.5（0.9~5.1） | 0.65 | 0.01 |
| 标本类型（骨髓/外周血，例） | 23/7 | 27/23 | 0/40 | 0.04 | 0.01 |
| 骨髓浸润（例） | 24 | 17 | 0 | 0.01 | 0.01 |
注：ALC：淋巴细胞绝对计数；P 1：TCL组与非TCL组比较；P 2：TCL组与正常对照组比较
采用FCM评估非TCL组（50例）和正常对照组（40名）CD4+T和CD8+T细胞亚群中TRBC1的表达。两组研究样本的CD4+T或CD8+T细胞均显示出TRBC1双相表达模式，即TRBC1高表达和TRBC1低表达两种类型群体（图1、图2），高表达组间与低表达组间细胞分布比例的差异均无统计学意义（P值均>0.05）。正常对照组CD4+T和CD8+T细胞亚群TRBC1+表达率分别为（39.6±6.5）%和（39.3±4.4）%（P>0.05），非TCL组CD4+T和CD8+T细胞亚群TRBC1+表达率分别为（39.1±3.8）%和（36.0±8.4）%（P>0.05）。两组间CD4+和CD8+T细胞亚群的TRBC1+表达率非常接近（P>0.05），CD4+T细胞TRBC1+表达略高，CD2、CD5、CD7表达均在正常范围。
蓝色：CD4+细胞；绿色：CD8+细胞
蓝色：CD4+细胞；绿色：CD8+细胞
应用多参数FCM检测30例TCL患者的免疫表型，结果显示肿瘤T淋巴细胞均为CD3+TCRγδ-，TRBC1+表达率>92.3%或<12.7%，TCL组的TRBC1+表达率与正常对照组和非TCL组相比差异均有统计学意义（P值均<0.001）（图3）。
TCL：成熟T细胞淋巴瘤；aP<0.001
分析结果显示，克隆性T细胞呈TRBC1单相表达模式，高表达或低表达，灵敏性为100%。在30例TCL样本中，CD4+TCL 4例（13.3%），TRBC1表达率>95.7%或<12.7%（图4A、B）；CD4+CD8+TCL 4例（13.3%），TRBC1表达率<0.6%（图4C）；CD8+TCL 20例（66.7%），TRBC1表达率>92.3%或<8.5%（图4D、E）；CD4-CD8-TCL 2例（6.7%），TRBC1表达率<0.2%（图4F）。
A、B：CD4+TCL中TRBC1表达情况；C：CD4+CD8+TCL中TRBC1表达情况；D、E：CD8+TCL中TRBC1表达情况；F：CD4-CD8-TCL中TRBC1表达情况。红色：肿瘤T细胞；蓝色：CD4+细胞；绿色：CD8+细胞
28例TCL中（其中2例未做TCR基因重排检测），TCRβ和TCRγ的阳性检出率分别为85.7%和78.6%，两者联合阳性检出率为92.8%，16例非TCL TCR基因重排均为阴性。17例TCL患者应用TCRVβ流式试剂盒进行检测，24种TCRVβ亚家族中呈限制性表达或阴性表达者16例，其中克隆性T淋巴细胞发生率最高的亚家族成员是TCRVβ13.2和TCRVβ5.2，TCRVβ亚家族呈均态表达者1例，敏感性为94.1%（图5）。
A：TCRVβ在对照管中呈正常表达模式；B：TCL组中TCRVβ13.2阳性率为85.1%，显著高于对照管（P<0.01）；C：TCL组中TCRVβ5.2阳性率为98.4%，显著高于对照管（P<0.01）
使用Kappa检验判断TRBC1检测、TCRVβ检测和TCR基因重排检测的结果是否一致。结果显示，Kappa值分别为0.86和0.95（P<0.01），说明三种方法的诊断结果存在一致性（表2）。在检测克隆性T细胞方面，三种方法具有相似的诊断效能。
TRBC1检测、TCRVβ检测和TCR基因重排检测的一致性
TRBC1检测、TCRVβ检测和TCR基因重排检测的一致性
| TRBC1表达 | TCRVβ检测 | TCR基因重排 | ||
|---|---|---|---|---|
| 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | |
| 单克隆 | 16 | 1 | 27 | 1 |
| 多克隆 | 0 | 4 | 0 | 16 |
| Kappa值 | 0.86 | 0.95 | ||
| P值 | 0.01 | 0.01 | ||
TCL的诊断主要依赖细胞形态学、免疫表型和分子特征，如通过PCR检测TCR基因重排和FCM检测TCRVβ受体库等。由于上述方法价格昂贵且检测费时费力，很难推广，且需特殊试剂盒及仪器，难以在常规实验室开展，因此临床迫切需要一种快速准确的检测方法以优化当前诊断模式。TCR是成熟T细胞表面可识别并结合抗原的分子结构，TCRβ链恒定区域包括TRBC1和TRBC2两种基因[10]。正常细胞同时表达TRBC1+T细胞和TRBC2+ T细胞亚群，而TCL由于T细胞亚群克隆性增殖，仅表现为TRBC1+ T细胞或TRBC2+ T细胞单一亚型。由于目前尚无商品化TRBC2抗体，实际临床工作中通过检测TRBC1表达特点可判断是否存在表达异常，如检测TRBC1蛋白出现单型性或限制性表达，可作为诊断TCL的重要依据[11]。
在本研究中，我们采用包括TRBC1和T细胞相关9色抗体组合方案进行检测，发现TRBC1在肿瘤T细胞和正常T细胞中的表达存在显著差异，在非TCL组和正常对照组中CD4+T和CD8+T细胞亚群均显示出TRBC1双相表达模式，而在30例TCL中克隆性T细胞呈TRBC1单相表达模式。本研究表明，通过FCM检测肿瘤T细胞免疫表型是一种准确、可靠、简单的方法，可用于评估多种成熟T细胞肿瘤的克隆性。不仅是外周血和骨髓标本，还可通过检测淋巴结标本中的TRBC1免疫表型区分肿瘤T细胞和非肿瘤T细胞。TRBC1仅需一个抗体就能够覆盖所有CD3+TCL克隆性筛查，联合多个T系相关抗原进行设门和分析不仅更加灵活简便且节约标本和成本，更加适合临床推广。
临床工作中，TCR基因重排检测在T细胞克隆性检测中应用较为广泛。本研究采用TCR基因重排检测TCL克隆性的敏感性和特异性分别为89%和100%。基因扫描技术是TCR基因重排的一种分子学方法，相对简单灵敏，可检测0.5%~1%的单克隆T细胞，但该方法价格昂贵且假阳性率高[12]。另外，利用TCRβ或TCRγ重排阳性无法判断是αβ型还是γδ型TCL[9]。目前FCM检测TCRVβ受体库虽然可以能够检测24种TCRVβ亚家族，但也仅覆盖了70%左右的TCR受体亚家族。TRBC1检测TCR恒定区，因此稳定性更好，可以作为诊断T细胞克隆性的有效证据。需要注意的是，无论是TRBC1还是TCRVβ受体库检测方法，均限于检测TCRαβ亚型，不适用于TCRγδ+T细胞或CD3-细胞（如正常胸腺细胞、CD3阴性肿瘤和非常罕见的CD3阴性小反应亚群）的克隆性评估。在本研究中，1例外周T细胞淋巴瘤患者在有效治疗后TRBC1阳性率接近正常范围，提示TRBC1可用于αβTCL的治疗监测。有文献报道TRBC1抗体对成熟T细胞肿瘤的敏感性和特异性分别为97%和91%[13]。但在我们的研究中，TRBC1检测克隆性αβTCR亚群的敏感性为100%，我们认为是由于本研究采用9色抗体组合方案进行检测，因此更为敏感。本研究建议，通过TRBC1表达模式评估克隆性应采用定量和定性相结合的分析策略，需要更多更全面的含有TRBC1的T细胞抗体组合方案识别异常T细胞。值得一提的是，由于近期T细胞意义不明的克隆受到越来越多的关注[14]，需要更多色组合以利用不同免疫表型的表达特点综合分析，采用设门和反设门结合策略以发现可能隐藏在正常T细胞中的微小T细胞克隆。
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