INTESTINAL MICROBIOTA AND OXIDATIVE STRESS IN PATIENTS WITH METABOLIC SYNDROME

Full Text

Научные исследования дают все больше оснований считать, что микробиота желудочно-кишечного тракта вносит значительный вклад в физиологию человека, в частности играет существенную роль в процессах пищеварения, метаболизма эндогенных и экзогенных соединений, участвует в реализации иммунологических защитных механизмов и предотвращении колонизации желудочно-кишечного тракта патогенными микроорганизмами. Микрофлора кишечника характеризуется определенным стабильным составом, которая называется ядром микробиоты [30]. Микробиом кишечника является своеобразным индикатором макроорганизма, реагируя на физиологические, диетические, климатогеографические факторы изменением его качественного и количественного состава. По мнению многих исследователей, не умаляя роли факторов наследственности и окружающей среды, именно кишечная микробиота вносит существенный вклад в развитие метаболических нарушений и ожирение, моделируя каскад ферментативных реакции макроорганизма, взаимодействуя с рецепторами непосредственно и/или при помощи собственных метаболитов и сигнальных молекул [2]. В работе [20] отмечено активное участие микробиома кишечника в регулировании энергетического баланса организма человека и сделан вывод о возможности формирования метаболического синдрома в случае микробиологических нарушений. К аналогичному выводу пришли авторы, изучающие микрофлору кишечника у тучных людей [23]. Это нашло подтверждение в работе [19], авторы которой установили сопровождение метаболического синдрома микро-экологическим дисбалансом. Способствовать развитию дисбаланса и/или усугублять его может оксидативный стресс, вызывающий, в свою очередь, нарушения качественного и количественного состава микробиоценоза кишечника вследствие размножения условно-патогенных бактерий (синдром избыточного бактериального роста). Ему отводится значительная роль в патогенезе, например, неалкогольной жировой болезни печени и гиперхолестеринемии. Современная трактовка механизмов развития неалкогольного стеатогепатита рассматривается в рамках метаболического синдрома и оксидативного стресса [16]. Наблюдающееся при этом снижение численности и видового разнообразия многих полезных микроорганизмов, таких как бак-териоиды, бифидобактерии, изменения со стороны доминирующих представителей кишечной микрофлоры дают понимание ограничения функциональности микрофлоры у лиц с подобными симптомами. Цель исследования - изучить состояние пристеночной микробиоты кишечника и параметры ок-сидативного стресса у пациентов с метаболическим синдромом. Методы Пятьдесят пациентов с метаболическим синдромом (согласно критериям диагностики, предписанным рекомендациями экспертов Всероссийского научного общества кардиологов по диагностике и лечению метаболического синдрома от 2009 г.), проживающие в г. Санкт-Петербурге, прошли амбулаторное обследование в научно-исследовательской лаборатории токсикологии и лекарственного мониторинга ВЦЭРМ им. А. М. Никифорова МЧС России. Возраст обследованных 55-65 лет. Средний индекс массы тела составил 35,47 кг/м2. Из гастроэнтерологических жалоб у 42 пациентов наблюдался абдоминальный болевой синдром, преимущественно в нижних отделах живота; 20 больных беспокоили поносы; 18 - запоры; 38 обследованных отмечали вздутие живота; 47 - урчание в животе; 9 - снижение аппетита. Группой сравнения послужили 129 пациентов аналогичного возраста без признаков метаболического синдрома по результатам обследования пристеночной микробиоты кишечника. Проведение данного исследования одобрено локальным независимым этическим комитетом. О качественном и количественном составе пристеночной микробиоты кишечника можно судить по микробным маркерам в крови [10]. Кровь в количестве 6 мл отбиралась из локтевой вены в пробирки-ва-кутейнеры с К3ЕДТА. Промежуток времени между взятием крови и ее центрифугированием не превышал 30 мин. Плазму крови отделяли центрифугированием на 3 000 об./мин в течение 10 мин. Оценку состава пристеночной микробиоты кишечника по микробным маркерам в крови определяли на газовом хроматографе «Agilent 7890» с масс-селективным детектором «Agilent 5975С» («AgilentTechnologies», США). Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms (фирма «Agilent Technologies», США) длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм. В 2010 году Рос-здравнадзором разрешено его применение в качестве новой медицинской технологии «Оценки микроэко-логического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» на территории Российской Федерации (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010). Объединенные статистические показатели пристеночной микробиоты кишечника (общее количество клеток, полезная микрофлора, условно-патогенная микрофлора) базировались на данных публикаций [10]. С целью определения проявлений оксидативного стресса у всех пациентов с метаболическим синдромом (50 человек) и у 26 пациентов без метаболического синдрома дополнительно проведены исследования конечных продуктов окисления белковых молекул и липидов (8-гидрокси-2-дезоксигуанозин и малоновый диальдегид) [13] и естественных антиоксидантов, содержащихся в пищевых продуктах (витамин Е, ненасыщенные жирные кислоты, биоэлементы). Концентрацию 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в утренней порции мочи, малонового диальдегида и витамина Е в плазме крови определяли на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Agilent 24 Экология человека 2019.06 Эндоэкология 1200» масс-спектрометром с тройным квадруполем «Agilent 6460» («Agilent Technologies», США) на колонке Zorbax Eclips Plus C18 Rapid Resolution 100 мм x 4,6 мм x 3,5 мкм по разработанным нами методикам на основе публикаций [18, 24, 28]. Уровень ненасыщенных жирных кислот в плазме крови определяли на газовом хроматографе «Agilent 7890» с масс-селективным детектором («Agilent Technologies», США). Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой DB-5ms (фирма «Agilent Technologies», США) длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм по разработанной нами методике на основе публикации [27]. Для выяснения возможного влияния недостаточного обеспечения организма биоэлементами, активно участвующими в антиоксидантной защите, провели исследование содержания в сыворотке крови железа, меди, селена и цинка на квадрупольном масс-спектрометре с аргоновой плазмой (Agilent 7900, США) в соответствии с методическими указаниями, утвержденными главным государственным санитарным врачом Российской Федерации [11]. Статистическую обработку всех полученных результатов осуществляли с помощью пакета статистических программ Статистика 6.0, включающего описательную статистику, непараметрическое сравнение с использованием критериев Краскела -Уоллеса и Манна - Уитни, многомерные регрессии и корреляции. Значимыми считали различия при уровне p < 0,05. Результаты В табл. 1 представлены медианы (Ме) и 25-75 центильные интервалы (Q1-Q3) объединенных показателей пристеночной микробиоты кишечника в группах сравнения, которые наглядно демонстрируют ее статистически значимые различия. В пристеночном слое кишечника у лиц с метаболическим синдромом Таблица 1 Объединенные статистические показатели пристеночной микробиоты кишечника у обследуемых групп пациентов, клеток/гх 105 Показатель микрофлоры Пациенты без метаболического синдрома (n=129) Пациенты с метаболическим синдромом (n=50) Р (Манна -Уитни) Ме Q1-Q3 Ме Q1-Q3 Полезная (ПолФ) 17873 13196 23891 13630 9855 18006 < 0,05 Условно-патогенная (УПатФ) 20734 17230 25967 33856 26965 43895 < 0,05 ПолФ/УПатФ 0,81 0,64 1,06 0,40 0,37 0,43 < 0,05 Анаэробы 20582 14079 28874 26631 21098 35768 < 0,05 Аэробы 18155 13805 23328 20560 16257 27282 > 0,05 Анаэробы/ Аэробы 1,01 0,81 1,47 1,30 1,21 1,44 < 0,05 Общее количество 42150 31876 53860 57671 44633 77104 < 0,05 в среднем повышено общее количество микробных маркеров на 37 %, условно-патогенной флоры на 64 %, за счет анаэробов на 30 %. При этом количество микробных маркеров полезной микрофлоры снижено на 23 %. Эти данные подтверждают уменьшение коэффициента отношения полезной микрофлоры к условно-патогенной в 2 раза и увеличение коэффициента анаэробной флоры к аэробной на 30 % у пациентов с метаболическим синдромом. Между пациентами с метаболическим синдромом и группой сравнения выявлены различия в количественном и качественном составе отдельных представителей условно-патогенной флоры кишечника. Так, в группе лиц с метаболическим синдромом повышено количество микробных маркеров Eubacterium lentum в 12 раз, Clostridium hystolyticum и Nocardia в 2 раза, а микробных маркеров Propionibacterium jensenii снижено 3 раза. Помимо этого обнаружены микробные маркеры Clostridium propionicum, Bacillus cereus, Prevotella, сем. Enterobacteriaceae, содержание которых в группе сравнения было ниже порога обнаружения используемого метода анализа (клеток/гх 105). В табл. 2 отражены результаты анализа количества отдельных представителей полезной микрофлоры. У пациентов с метаболическим синдромом количество микробных маркеров Eubacterium/Cl. Coccoides было уменьшено в 6 раз, Bifidobacterium в 1,5 раза, на фоне увеличения количества маркеров Propionibacterium/Cl. Subterminale в 1,5 раза. При этом количество микробных маркеров Lactobacillus менялось незначительно. Таблица 2 Количество представителей микробных маркеров полезной микрофлоры у обследуемых групп пациентов, клеток/гх 105 Группа и таксон микроорганизмов Пациенты без метаболического синдрома (n=129) Пациенты с метаболическим синдромом (n=50) Р (Манна -Уит ни) Ме (Q1-Q3) Ме (Q1-Q3) Lactobacillus 7380 4856 10058 7984 6711 11183 > 0,05 Eubacterium/Cl. Coccoides 5203 2995 9525 837 698 1168 < 0,05 Bifidobacterium 2349 1305 4568 1578 1130 2457 < 0,05 Propionibacterium/Cl. subterm. 1321 675 2077 2040 1503 3191 < 0,05 Выявлено различие во взаимоотношении между отдельными представителями нормофлоры. В группе пациентов с метаболическим синдромом доля Eubacterium/Cl. Coccoides была ниже в 4 раза, а доля Propionibacterium/Cl. Subterminale и Lactobacillus выше в 2 и 1,5 раза соответственно (рисунок). На фоне выраженных количественных и качественных различий состава пристеночной микробиоты кишечника в группе пациентов с метаболическим синдромом статистически значимо выше уровень малонового диальдегида в среднем на 48 % и уровень 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина на 39 % 25 Эндоэкология Экология человека 2019.06 А Б А) Доля отдельных представителей микроорганизмов в структуре нормобиоты кишечника у пациентов без метаболического синдрома; Б) Доля отдельных представителей микроорганизмов в структуре нормобиоты кишечника у пациентов с метаболическим синдромом (табл. 3). Следовательно, антиоксидантная защита у лиц с метаболическим синдромом не справляется с прооксидантной активностью, что дополнительно подтверждается значимым снижением концентрации витамина Е в плазме крови в среднем на 42 % на фоне относительно равнозначных концентраций по-линенасыщенных жирных кислот (табл. 4). Таблица 3 Содержание конечных продуктов окисления молекул ДНК и липидов у обследуемых групп пациентов Показатель Пациенты без метаболического синдрома (n = 26) Пациенты с метаболическим синдромом (n = 50) Р (Манна - Уитни) Ме (Q1-Q3) Ме (Q1-Q3) 8-гидрокси-2дезоксигуанозин, нг/мл 6,4 5,1-7,6 8,9 7,2-10,7 < 0,05 Малоновый диальдегид, мкг/ мл 0,190 0,164 - 0,244 0,282 0,226- 0,351 < 0,05 Таблица 4 Содержание полиненасыщенных жирных кислот и витамина Е в плазме крови у обследуемых групп пациентов, мкг/мл Показатель Пациенты без метаболического синдрома (n = 26) Пациенты с метаболическим синдромом (n = 50) Р (Манна - Уитни) Ме 3) Q 1 (Q1 Ме 3) Q 1 (Q1 Докозагексаено-вая кислота 12,6 8,2-17,0 14,4 8,7-28,8 > 0,05 а-линоленовая кислота 9,4 7,2-14,9 10,2 7,8-14,7 > 0,05 Линолевая кислота 530,4 382,0 - 705,5 457,9 327,8 - 590,2 > 0,05 Арахидоновая кислота 29,8 17,2 - 39,2 32,6 21,2- 51,7 > 0,05 Витамин Е 6,9 5, 9 1 5 4,0 3,8-4,7 < 0,05 Содержание всех анализируемых биоэлементов, активно участвующих в антиоксидантной защите, у пациентов групп сравнения не показала значимых различий. Исключение составляет значимое сниженное содержание цинка в сыворотке крови пациентов с метаболическим синдромом в среднем в 1,8 раза (табл. 5). Таблица 5 Статистические показатели содержания отдельных эссенциальных биоэлементов в сыворотке крови у обследуемых групп пациентов, мкг/мл Биоэлемент Пациенты без метаболического синдрома (n = 26) Пациенты с метаболическим синдромом (n = 50) Р (Манна - Уитни) Ме Q1 Q ) Ме Q1 Q ) Железо 7,23 3,83 - 12,80 8,18 4,61 - 18,20 > 0,05 Медь 1,03 0,80-1,23 1,09 0,64 - 1,87 > 0,05 Селен 0,14 2 ,2 0, 1 7 ,0 0, 0,14 0, 0 О) 1 2 О > 0,05 Цинк 2,90 1,20-4,20 1,63 7 ,6 2, 1 5 ,4 0, < 0,05 Обсуждение результатов Согласно литературным данным [6], у лиц старшей возрастной группы, к которым относятся все обследованные нами пациенты, наблюдается рост общего содержания микробных клеток в кишечнике. В пристеночном слое кишечника людей с мета-боличесим синдромом увеличено количество микроорганизмов условно-патогенной флоры, прежде всего Eubacterium lentum, Clostridium hystolyticum и propionicum, Nocardia, Bacillus cereus, Prevotella, сем. Enterobacteriaceae. Полученные результаты нашли отражение в работах ряда авторов [21, 25]. У лиц с метаболическим синдромом в данном исследовании выявлено общее суммарное повышение микробных маркеров за счет увеличения условнопатогенной микрофлоры на фоне уменьшения количества полезной. Выраженное снижение количества микробных маркеров нормобиоты Eubacterium/Cl. Coccoides на фоне компенсированного увеличения микробных маркеров Propionibacterium/Cl. subterm. и Lactobacillus в группе лиц с метаболичесим синдромом согласуется с данными других авторов [29]. М. В. Маевский, 2000, и G. R. Gibson, 1995 [4] отмечают, что именно Eubacterium и Bifidobacterium участвуют в синтезе витаминов, стимулируют иммунные функции, снижают уровень холестерина и подавляют рост экзогенных и/ или вредных бактерий, а их снижение у обследованных нами пациентов, вероятно, и обуславливает развитие метаболического синдрома, несмотря на некоторую компенсацию функции указанной нормобиоты со стороны Lactobacillus. 26 Экология человека 2019.06 Эндоэкология Результаты оценки конечных продуктов окислительного стресса у пациентов с метаболическим синдромом однозначно свидетельствуют о наличии у них дисбаланса между уровнем образования кислородных радикалов и потенциалом антиоксидантной системы организма, что может служить объяснением причин развития различных патологических состояний [3, 9]. Имеются работы, показывающие роль оксидатив-ного стресса в развитии воспаления жировой ткани, которое является связующим звеном между ожирением и сахарным диабетом 2 типа. На внутриклеточном уровне воспаление жировой ткани нарушает функциональное состояние в-клеток поджелудочной железы и способствует прогрессированию снижения секреции инсулина, что играет ключевую роль в развитии инсулинорезистентности [17]. По данным ряда исследователей [7, 12], оксидатив-ный стресс нарушает качественный и количественный состав микробиоценоза кишечника вследствие размножения условно-патогенных бактерий в количестве, превышающем норму, что играет значительную роль в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени, гиперхолестеринемии, запоров и наблюдается у пациентов с метаболическим синдромом. Жирорастворимые антиоксиданты (альфа-токоферол и каротиноиды) играют главную роль в защите основных структурных компонентов биомембран клеток, таких как фосфолипиды и погруженные в липидный слой белки. Витамин Е способен гасить активные формы кислорода [8], взаимодействовать с гидроксильным радикалом и восстанавливать липидные радикалы структуры и ROO • [22]. Наиболее активно в липидном бислое а-токоферол восстанавливает пероксильные радикалы [26]. Установленное статистически значимое снижение уровня витамина Е в плазме крови у пациентов с метаболическим синдромом указывает либо на его повышенный расход для компенсации свободно-радикальных реакций организма, либо на недостаточное поступление в организм с пищей, либо на нарушение всасывания и усвоения в желудочно-кишечном тракте, что, в свою очередь, может быть обусловлено изменениями в составе пристеночной микробиоты кишечника, обнаруженными в ходе исследования. Вопреки ожидаемому нами не выявлено значимых различий в сравниваемых группах концентрации эссенциальных биоэлементов, активно участвующих окислительно-восстановительных реакциях. Исключение составляет только цинк, концентрация которого у пациентов с метаболическим синдромом значимо ниже. Вероятно, это можно объяснить тем, что элементный состав крови находится под жестким влиянием систем, регулирующих гомеостаз организма, и при дефиците длительное время поддерживается за счет их вымывания из депо [5]. Исключение составляет содержание цинка, запасы которого в организме практически отсутствуют, чем и объясняется необходимость его систематического поступления с пищей для поддержания гомеостаза. Цинк как биоэлемент обладает сильным антиокси-дантным действием за счет нескольких механизмов. Цинк защищает сульфгидрильные группы белков и ферментов от «атак» свободных радикалов и противодействует окислительно-восстановительным реакциям с участием переходных металлов. Цинк является одним из важных внутриклеточных медиаторов апоптоза благодаря цито- и иммунопротективным свойствам: индукции меди, цинк-зависимой супероксиддисмутазы, защите ДНК и многочисленных транскрипционных факторов от свободнорадикального повреждения, ингибиции протеиназ. Механизм действия цинка заключается в его способности индуцировать синтез металлопротеинов, которые могут повышать клеточную выживаемость путем предотвращения апоптоза [5, 15]. Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) являются наиболее важными питательными веществами человеческого рациона и имеют особое значение для структур клеточной оболочки (формируют клеточную мембрану), ее функционирования и для местной «гормональной» передачи сигналов. Незаменимые жирные кислоты, полученные только из пищи, преобразуются в местные гормональные медиаторы, которые принимают участие в регуляции работы сердечно-сосудистой системы, процессе свертывания крови, всех стадий воспаления и др. Полученные в нашем исследовании данные о незначимых различиях в концентрациях ПНЖК и большинства биоэлементов в сравниваемых группах, по нашему мнению, можно объяснить особенностями питания и курсовыми приемами лицами пожилого возраста препаратов, содержащих витамины, биоэлементы и ПНЖК, что и было подтверждено при их дополнительном опросе. Выявленный характер изменения количественного и качественного состава микробиоты кишечника у лиц с метаболическим синдромом указывает на развитие у них изменений, соответствующих дисбиозу кишечника 3 степени [1, 14], о чем свидетельствует увеличение общего количества микробных маркеров и условно-патогенной флоры на фоне значительного снижения содержания Eubacterium и Bifidobacterium при выраженных клинических проявлениях дисфункции кишечника. Диагностированный дисбиоз кишечника сопровождается окислительным стрессом, на что указывает повышение уровня малонового диальдегида в плазме крови и 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в моче на фоне снижения уровня витамина Е и биоэлемента цинка в плазме крови. Авторство Шантырь И. И. внес существенный вклад в разработку концепции исследования, интерпретацию полученных данных, составил первый вариант статьи и утвердил присланную в редакцию рукопись; Родионов Г. Г. внес значительный вклад в планирование исследования, интерпретацию полученных данных, работу с рукописью статьи и утвердил присланную в редакцию рукопись; Фоминых Ю. А. внесла существенный вклад в получение и анализ данных, работу с рукописью статьи и утвердила присланную в редакцию рукопись; Бацков С. С. внес существенный вклад в разра 27 Эндоэкология Экология человека 2019.06 ботку дизайна исследования, работу с рукописью статьи и утвердил присланную в редакцию рукопись; Ушал И. Э.внесла существенный вклад в получение, анализ и интерпретацию данных, работу с рукописью статьи и утвердила присланную в редакцию рукопись; Колобова Е. А. внесла существенный вклад в получение лабораторных данных, их статистический анализ, работу с рукописью статьи и утвердила присланную в редакцию рукопись; Светкина Е. В. внесла существенный вклад в получение лабораторных данных, их статистический анализ, работу с рукописью статьи и утвердила присланную в редакцию рукопись; Санников М. В. внес существенный вклад в интерпретацию данных исследования, работу с рукописью статьи и утвердил присланную в редакцию рукопись.

About the authors

I. I. Shantir'

Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, EMERCOM of Russia

G. G. Rodionov

Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, EMERCOM of Russia

Email: rodgengeor@yandex.ru

Yu. A. Fominykh

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

S. S. Batskov

Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, EMERCOM of Russia

I. E. Ushal

Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, EMERCOM of Russia

E. A. Kolobova

Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, EMERCOM of Russia

E. V. Svetkina

Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, EMERCOM of Russia

M. V. Sannikov

Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, EMERCOM of Russia

References

Supplementary files