MET BEHULP VAN CRISPR/CAS9-TECHNOLOGIE

Zebravislarven maken met kenmerken van menselijk paraganglioom

  • 6 min.
  • Wetenschap

In het Radboudumc wordt met behulp van CRISPR/cas9-technologie een zebravismodel van maligne paragangliomen ontwikkeld. Eerdere pogingen met knock-out-muizen leverden geen bruikbaar model op om het ontstaan en de mogelijke behandeling te onderzoeken. Prof. dr. Henri Timmers en zijn postdoc dr. Margo Dona zijn optimistisch over de mogelijkheden.

Wat is de achtergrond van jullie onderzoek met zebravissen?

Timmers: ‘Succinaat-dehydrogenase (SDH) is een uit vier componenten bestaand enzymcomplex in het binnenste mitochondriële membraan. Het maakt deel uit van zowel de citroenzuurcyclus (omzetting van succinaat in fumaraat) als de ademhalingsketen (mitochondriaal complex II). Met name mutaties in het SDHB-gen, dat codeert voor de bèta-subunit van het complex, kunnen maligne woekering van (para)sympatische zenuwcellen veroorzaken: feochromocytomen in de bijnieren en paragangliomen elders in het lichaam, zoals glomustumoren in het hoofd-halsgebied. Ons zebravisproject valt binnen het onderzoeksthema Vascular Damage en is gebaseerd op een idee van celfysioloog prof. dr. Peter Deen, die tot voor kort op de afdeling Fysiologie van het Radboudumc werkte. Deen had een speciale belangstelling voor de rol van succinaat bij onder andere nierziekten; wij deden hier klinisch onderzoek bij patiënten met SDH-mutaties.
Op een gegeven moment hadden we behoefte aan een proefdiermodel voor maligne paraganglioom. Paragangliomen zijn zeldzaam, met in Nederland een incidentie van enkele honderden per jaar, waarvan een minderheid maligne. Een groot deel van de gemetastaseerde paragangliomen is gerelateerd aan SDHB-mutaties. Tumoren uit neuraal weefsel groeien meestal weinig agressief; het is nooit gelukt om menselijke paraglanglioomcellen langdurig in kweek te houden. Interacties tussen verschillende celtypen, vooral met de extracellulaire matrix, spelen bij dit soort tumoren een belangrijke rol.
In vitro-modellen voor SDH-deficiëntie ontberen belangrijke tumorkarakteristieken. In samenwerking met het Utrechtse Hubrecht Instituut experimenteren we met het kweken van organoïden, maar dat heeft nog geen relevant model voor paraganglioom opgeleverd. Het grootste probleem bij het ontwikkelen van een muizenmodel is, dat mutaties in beide allelen van SDHB embryonaal lethaal zijn – wat overigens ook bij de mens het geval is – en dat heterozygote muizen in tegenstelling tot mensen geen tumoren blijken te ontwikkelen.’

Waarom een tropisch aquariumvisje?

Dona: ‘Er zijn vergelijkbare problemen met het ontwikkelen van een muizenmodel voor het syndroom van Von Hippel-Lindau (VHL). Het lukte de groep van dr. Rachel Giles op de afdeling Nefrologie van het UMC Utrecht, om vhl-genen in zebravissen uit te schakelen. Deze vissen ontwikkelen uitgebreide bloedvatwoekeringen, kenmerkend voor humane VHL-gerelateerde tumoren. Dat succes, plus het feit dat ik tijdens mijn promotieonderzoek al uitgebreid met zebravissen had gewerkt, inspireerden ons deze weg verder te vervolgen. Mede dankzij de expertise van dr. Selma Waaijers zijn we erin geslaagd om met behulp van CRISPR-Cas9-technologie [zie kadertekst – red.] gericht het sdhb-gen te muteren. Heterozygote sdhb-mutanten blijken geen duidelijke morfologische afwijkingen te vertonen. Homozygote mutanten sterven in het larvale stadium, maar leven toch zo lang dat wij de functionele en metabole effecten van succinaatophoping kunnen bestuderen. Zo bleek op dag 6 dat deze larven vaak een onontwikkelde zwemblaas hebben. Ook hadden ze duidelijk veel minder energie ten gevolge van afgenomen oxidatieve fosforylering in hun mitochondria. De cellulaire succinaatspiegels zijn dan al zeer sterk verhoogd. De kracht van het model is dat het de metabole eigenschappen van SDHB-gerelateerde paragangliomen heel goed nabootst. Dat geeft ons inzicht in de pathofysiologie, en daarmee in mogelijke therapeutische targets.’

De homozygote larven ontwikkelen geen paragangliomen?

Timmers: ‘Nee, daar is hun levensduur te kort voor. Het metabolisme van deze larven is te vergelijken met het beeld van neurodegeneratie bij kinderen met het syndroom van Leigh, oftewel subacute necrotiserende encefalopathie. Ze hebben een mitochondriële dysfunctie vanwege een homozygote of “compound”-heterozygote mutatie in een van de SDH-genen. Van de mensen met een heterozygote kiembaanmutatie in SDHB ontwikkelt ongeveer 30 procent een tumor door een aanvullende verworven somatische mutatie in het gezonde allel, een zogeheten second hit. Dit betreft met name paragangliomen, maar soms ook niercelcarcinomen, gastrointestinale tumoren, hypofyse-adenomen of neuro-endocrine tumoren van de pancreas. Dat kan al gebeuren op kinderleeftijd, maar de gemiddelde leeftijd ligt rond 40 jaar.’

Wat zijn belangrijke voordelen van zebravissen?

Dona: ‘Een grote kracht van dit model is de snelheid en efficiëntie. Volwassen vissen leggen honderden eitjes, die evenzovele identieke larven opleveren. Die zijn vrijwel doorschijnend, waardoor ze bij uitstek geschikt zijn om de morfologie te bestuderen. Ook hun levensduur en zwemgedrag zijn belangrijke parameters. Dit alles maakt het buitengewoon gemakkelijk om het effect van allerlei stoffen te screenen: die kun je vaak gewoon aan het water toevoegen van het welletje waarin ze zwemmen.’

Timmers: ‘Zo kunnen we bijvoorbeeld nu al testen of het fenotype dat zo kenmerkend is voor Leigh-tumoren, kan worden genormaliseerd door antioxidanten toe te voegen. Een mogelijk belangrijke factor waardoor tumoren ontstaan bij sdh-mutaties is namelijk dat er in de mitochondria meer vrije zuurstofradicalen worden gegenereerd. Je kunt dan bijvoorbeeld kijken of het zwemgedrag verbetert bij verschillende doseringen vitamine C.’

De geringe levensduur zal de onderzoeksmogelijkheden beperken?

Dona : ‘Ja, het is een nadeel dat we alle testen in een korte periode moeten uitvoeren. Ook blijft het een vraag in hoeverre de bevindingen in dit organisme te extrapoleren valt naar patiënten – het DNA van de zebravis is ongeveer voor 80 procent homoloog aan dat van de mens.’
Timmers: ‘Helaas is de levensduur van de zebravis sowieso te kort om het ontstaan van tumoren te kunnen volgen; maar we hebben nog wel diverse strategieën achter de hand om tot een mogelijk tumormodel te komen. Je kunt dan denken aan de toepassing van SDH-remmers of het blootstellen van de larven aan hypoxie: dit laatste lijkt een cruciale stap te zijn in de pathofysiologie. Een andere optie is de CRISPR-Cas9-techiek naar een hoger niveau te tillen.’

Kun je ook weefselspecifieke mutaties ontwikkelen?

Dona: ‘Normaal gesproken induceer je met CRISPR-Cas9 in elke cel van het organisme een mutatie in het sdh-gen, maar het is inderdaad ook mogelijk om dit weefselspecifiek te doen. Je zet dan vóór het gids-RNA een promotor die alleen in bepaalde weefsels tot expressie komt. In ons geval hebben we gekozen voor de promotor van het gen voor tyrosinehydroxylase. Dat is een sleutelenzym in de productie van catecholamines, de stresshormonen die door paragangliomen worden geproduceerd. De analyse van deze weefselspecifieke mutanten is in volle gang.’


DNA knippen en plakken met CRISPR-Cas9

Clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR) werden in de jaren 1980 voor het eerst aangetroffen in bacteriën. Later bleken ze afkomstig van virus-DNA’s en een rol te spelen in de afweer tegen allerlei bacteriële virussen (bacteriofagen). Dit afweersysteem zet fragmenten van virus-DNA’s tussen specifieke (palindromische) sequenties van het bacteriegenoom. Ze worden omgezet in zogeheten gids-RNA’s, die een complex vormen met het bacteriële DNA-knippende enzym CRISPR-associated sequence 9 (Cas9). Zodra een faag de bacteriecel “injecteert” met DNA, wordt dit veelal herkend door een van de vele gids-RNA’s. Het hieraan gebonden Cas9 knipt dit virus-DNA dan prompt doormidden. Sinds 2015 wordt Cas9 gebruikt om met gesynthetiseerde gids-RNA’s op specifieke plaatsen in het genoom van eukaryotische cellen een dubbelstrengs knip te induceren.
‘Men is bij de term CRISP-Cas9 geneigd te denken aan designerbaby’s; vandaar dat medisch-ethische commissies buitengewoon streng kijken naar het potentiële nut van dit soort experimenten’, aldus Timmers. ‘Dat er voor SDHB-gerelateerde tumoren nog geen goede behandelopties zijn, is een relevante motivatie.’

Afbeelding (kleur) RNA
Figuur. Dankzij gids-RNA kan het Cas9-enzymsysteem zeer specifiek binden aan dubbelstrengs DNA en de herkende sequentie doorknippen.

Prof. dr. H.J.L.M. (Henri) Timmers werkt sinds 2006 als internist-endocrinoloog in het Radboudumc en is sinds 2017 universitair hoofddocent bijnierziekten. Per 1 mei 2020 is hij hier benoemd tot hoogleraar Interne geneeskunde, in het bijzonder endocriene ziekten. Hij is hoofd van de onderzoeksgroep Feochromocytotoom & Paraganglioom en het Expertisecentrum voor Bijnierziekten.


Dr. M.A. (Margo) Dona studeerde in Nijmegen medische biologie. In 2018 promoveerde ze bij prof. dr. Erwin van Wijk en prof. dr. Hannie Kremer op gentherapieontwikkeling voor het Usher-syndroom met behulp van een zebravis als model. Momenteel werkt ze als postdoc in het interfacultaire Institute for Water & Wetland Research van de Radboud Universiteit.