Über die Regulation der Calcium-Homöostase und den Einfluss von STIM-Proteinen auf die Alzheimer-Pathologie

Abstract

Weltweit erkrankt alle drei Sekunden ein Mensch an einer Demenzerkrankung. Morbus Alzheimer bildet hierbei in 50 bis 60 % der Fälle die Ursache und stellt somit die häufigste Demenzform dar. Makropathologisch ist die Krankheit durch eine gleichmäßige Hirnrindenatrophie mit Erweiterungen der Liquorräume gekennzeichnet. Das histopathologische Korrelat liegt in einer massiven Neuronendegeneration mit extrazellulären Ablagerungen von Aβ – Plaques und intrazellulären hyperphosphorylierten neurofibrillären Tau – Bündeln. Aβ entsteht im Zuge einer amyloidogenen APP – Prozessierung durch sequenzielle Schnitte der β – und γ – Sekretasen. Presenilin – Proteine stellen dabei das katalytische Zentrum der γ – Sekretase dar. Neben einem amyloidogenen APP – Prozessierungsweg wird durch den Schnitt der α – Sekretase der nicht – amyloidogene Weg eingeleitet. Das dabei anfallende sAPPα wird in den Extrazellulärraum freigesetzt und kann neuroprotektive Eigenschaften entfalten. Die Literatur berichtet von einer gestörten 𝐶𝑎2+ - Homöostase bei Morbus Alzheimer. Sowohl APP als auch Aβ, sAPPα und Preseniline greifen in die Regulation des 𝐶𝑎2+ - Haushaltes ein. Um die intrazelluläre 𝐶𝑎2+ - Konzentration ( [𝐶𝑎2+]𝑖) zu regulieren, sind viele Mechanismen erforderlich, die den 𝐶𝑎2+ - Transport über die Plasmamembran sowie zwischen dem Zytosol und den intrazellulären Zellkompartimenten ermöglichen. Dazu gehören u.a. die spannungsgesteuerten (VGCC) und die speichergesteuerten 𝐶𝑎2+ - Kanäle (CRAC), die den SOCE (engl. store operated 𝐶𝑎2+ - entry) aktivieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde folglich der Einfluss von APP, seinen Prozessierungsprodukten und von Presenilin – Proteinen auf CavB, CavD und CavG als Vertreter der VGCC – Familie sowie auf ORAI1, ORAI2, ORAI3, STIM1, STIM2, STIM2.1 und STIM2.2 als SOCE – Komponenten untersucht. Anschließend erfolgte die Analyse der reversen Regulation von den α -, β – und γ – Sekretasen durch STIM1 und STIM2. Schließlich wurden humane post mortem Hirnproben der Analyse der Genexpression von CavB, CavD, ORAI1, ORAI2, ORAI3, STIM1 und STIM2 unterzogen. Zunächst wurde der Einfluss von Presenilin - Proteinen auf das intrazelluläre 𝐶𝑎2+ - Signal in unterschiedlichen murinen und humanen Zelllinien untersucht. Während in Bezug auf Presenilin 1 keine eindeutige Aussage bzgl. der Regulation von SOCE gemacht werden konnte, schienen die Ergebnisse in Bezug auf Presenilin 2 für einen SOCE – aktivierenden Einfluss zu sprechen. Die Untersuchungen der [𝐶𝑎2+]𝑖 konnten keinen Einfluss von Presenilin1 auf die Aktivität von SOCE aufzeigen, jedoch sprachen die signifikanten Veränderungen der Genexpression von STIM – und ORAI – Proteinen in Presenilin1 – und Presenilin1/2 – defizienten Zellen für einen modulierenden Einfluss von Presenilin1 auf der Genebene. Presenilin2 scheint SOCE über eine forcierte Speicherentleerung des endoplasmatischen Retikulums potenzieren zu können. In der Literatur häufen sich die Belege für einen SOCE – hemmenden Einfluss von Presenilin2. Hierbei übt am ehesten Presenilin1 einen ihhibierenden Einfluss auf die Funktion von Presenilin2 aus, weswegen die gestörte Speicherentleerung des endoplasmatischen Retikulums zu seiner 𝐶𝑎2+ -Überladung führt und folglich der SOCE beeinträchtigt werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein SOCE – hemmender Einfluss sowohl auf der Gen – als auch auf der Aktivitätsebene durch AICD/AL2ICD nachgewiesen werden. AICD/AL2ICD sind hingegen Spaltprodukte, die im Zuge der APP – Prozessierung durch die γ – Sekretase anfallen. Demnach scheint Presenilin1 und/oder Presenilin2 zum einen direkt über die Regulation der Speicher des endoplasmatischen Retikulums und zum anderen indirekt über die Produktion von genregulatorischen AICD/AL2ICD den SOCE zu modulieren. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit ein Hinweis auf den SERCA – fördernden Einfluss von AICD/AL2ICD entdeckt. Die Literatur berichtet von einer Aktivierung der SERCA – Pumpe durch Presenilin1 und Presenilin2 im Zuge einer direkten Interaktion. In dieser Arbeit lagen Hinweise auf eine zusätzliche indirekte Aktivierung der SERCA über die Bildung von AICD/AL2ICD vor. Somit scheint AICD/AL2ICD einen wichtigen Regulator der 𝐶𝑎2+ - Homöostase darzustellen. AICD/AL2ICD schützt demnach vor einer 𝐶𝑎2+ - Überladung der Zelle, indem sie den 𝐶𝑎2+ - Influx aus dem Extrazellularraum durch die Hemmung von SOCE kontrolliert und über die Aktivierung der SERCA – Pumpe 𝐶𝑎2+ - Ionen in die intrazellulären Speicher bringt. Beides führt zu einer Senkung der [𝐶𝑎2+]𝑖 . Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem nachgewiesen werden, dass STIM – Proteine direkt, 𝐶𝑎2+ - unabhängig und indirekt über die Regulation der [𝐶𝑎2+]𝑖 die Funktion der α – Sekretase sowohl auf der Protein - als auch auf der Aktivitätsebene steigern, wohingegen die Funktion der γ – Sekretase auf der Gen -, Protein – und Aktivitätsebene herunterreguliert wird. Demnach übt STIM1 und STIM2.2 einen inhibierenden Einfluss auf die γ – Sekretase aus, wohingegen STIM2 diese fördert. Bezüglich der Funktion der β – Sekretase lagen nur indirekte Hinweise auf einen hemmenden Einfluss von STIM vor. Die Untersuchung der Genexpression von CavD wies auf eine mögliche Regulation sowohl durch Aβ als auch durch AICD hin. Während APP – defiziente Zellen, die folglich weder Aβ noch AICD exprimieren, sowie Zellen mit herunterreguliertem Fe65, einem Translokationspartner von AICD, eine Reduktion der Genexpression gezeigt haben, wiesen Zellen mit einer überschießenden Aβ – Produktion ebenfalls eine Reduktion der Genexpression auf. Presenilin1 – defiziente Zellen konnten keinen Unterschied verglichen zur Kontrolle zeigen. Somit scheint AICD die Genexpression von CavD zu fördern, wohingegen Aβ diese hemmt. Die Genexpression von CavB wird am ehesten durch Aβ reguliert, wobei es die Genexpression von CavB inhibiert. Im Fall von CavG bewirkt AICD ebenfalls am ehesten eine Reduktion der Genexpression. Zusätzlich wurde in humanen post mortem Hirnproben untersucht, inwiefern die Genexpression von den oben angeführten ORAI -, STIM – und VGCC – Proteinen in AD verändert ist. Gegenüber der Kontrollkohorte konnte eine signifikante Steigerung aller Gene nachgewiesen werden. Die Genexpression von CavB, CavD, ORAI1, ORAI3, STIM1 und vermutlich STIM2 erfährt mit steigendem Alter bei Vorliegen von AD eine Reduktion, wobei CavD unabhängig von AD mit dem Alter negativ korreliert. Außerdem konnte für CavB, ORAI1, ORAI3 und STIM1 eine positive Korrelation zwischen dem Braak – Stadium I und den Stadien V- VI ermittelt werden, wohingegen STIM2 nur zwischen den Stadien I und VI positiv korrelierte. In Bezug auf die Allelkonstellation von ApoE ergaben die Untersuchungen der Genexpression eine Steigerung der Gene CavB, CavD und ORAI1 bei zusätzlichem ε4 – Allel, wohingegen die Genexpression von CavD bei zusätzlichem ε3 – Allel abnahm. Es lagen keine Hinweise auf einen Zusammenhang mit dem Geschlecht vor.

There is one person every three seconds who get dementia worldwide. There are 50 – 60 % of all cases of dementia that go to the Alzheimer’s disease, therefore Alzheimer’s disease makes up the most common cause of dementia. Macroscopic hallmarks are the equally distributed atrophy of the cortices and the widening of the liquor spaces, whereas the histopathological changes are represented by a massive neurodegeneration accompanied by extracellular amyloid (Aβ) deposits and intracellular hyperphosphorylated neurofibrillary tau tangles. Aβ arises as a product of the amyloidogenic APP processing by sequential cleavage of β – and γ – secretases. Presenilins as one of the subunits of the γ – secretase exert hereby the catalytic activity. α – secretase is the next enzyme that processes the non – amyloidogenic APP proteolysis with sAPPα being secreted in the extracellular space and having neuroprotective properties. There is evidence of a disturbed 𝐶𝑎2+ - homeostasis in AD. APP as well as Aβ, sAPPα and presenilins seem to be involved in the regulation of the 𝐶𝑎2+ - household. To balance the intracellular 𝐶𝑎2+ concentration ([𝐶𝑎2+]𝑖) plenty of agents are required to mediate the 𝐶𝑎2+ transport across the plasma membrane and between the cytosol and intracellular cell compartments. The voltage gated 𝐶𝑎2+ - channels (VGCC) and the 𝐶𝑎2+ release – activated channels (CRAC) mediating the store operated 𝐶𝑎2+ entry (SOCE) are some of them. In scope of this work the influence of APP, it’s cleavage products and presenilins was analyzed on CavB, CavD and CavG being representatives of the VGCC family and on ORAI1, ORAI2, ORAI3, STIM1, STIM2, STIM2.1 and STIM2.2 as SOCE components. Subsequently the reverse regulation of the α -, β – and γ – secretases by STIM1 and STIM2 was analyzed. In the end the gene expression of CavB, CavD, ORAI1, ORAI2, ORAI3, STIM1 and STIM2 was investigated in the humane post mortem cerebral samples. First of all the influence of presenilins on the 𝐶𝑎2+ signaling has been tested in different mouse and humane cell lines. While no exact conclusions could be made regarding presenilin 1, the results concerning presenilin 2 indicated a SOCE activating effect. Presenilin1 seems to be not involved in the regulation of the acitivity of SOCE, however there is a clue that presenilin1 interfere with the gene regulation as it was seen in presenilin1 – and presenilin1/2 – deficient cell lines. Presenilin2 seems to facilitate SOCE by intensifying the emptying of the endoplasmatic reticulum – storages. There is a body of evidence that presenilin1 inhibits SOCE. So presenilin1 seems to have an inhibitory effect on the functioning of presenilin2 leading to a 𝐶𝑎2+ overload in endoplasmatic reticulum by minimizing its storage emptying. Next discovered was the SOCE inhibitory effect of AICD/AL2ICD that was confirmed at the gene and the acitivity level. In turn AICD/AL2ICD are cleavage products of APP that arise in the course of proteolysis by γ – secretase. Therefore presenilin 1 and 2 apparently modulate SOCE directly by regulating the storages of endoplasmatic reticulum and indirectly by producing the gene regulatory AICD/AL2ICD. Furthermore a SERCA pump activating effect of AICD/AL2ICD could be shown in the course of the work. The literature reports about the SERCA activating effect of presenilins by direct interaction. So presenilins can activate the SERCA pump by producing AICD/AL2ICD additionally. Consequently, AICD/AL2ICD play an important role in the regulation of the 𝐶𝑎2+ - homeostasis by preveting the cell against a 𝐶𝑎2+ overload. Firstly, AICD/AL2ICD controls the 𝐶𝑎2+ influx across the plasma membrane by inhibiting SOCE and secondly it stores 𝐶𝑎2+ in the intracellular cell compartiments by activating the SERCA pump. Investigating the protein and acitivity level it could be shown that STIM proteins are able to activate the α – secretase both directly, 𝐶𝑎2+ - independently as well as indirectly, 𝐶𝑎 2+ - dependetly, whereas the functioning of the γ – secretase as shown on the gene, protein and activity level could be down regulated. Furthermore STIM1 and STIM2.2 seem to inhibit, whereas STIM2 seems to facilitate the γ –secretase. Referring to β – secretase only some clues were given for STIMs to inhbit it’s functioning. Analyzing the gene expression of CavD evidence was given of Aβ and AICD being involved in its regulation. While APP – deficient cells being avoid of Aβ and AICD as well as cells with down regulated AICD translocation partner Fe65 has shown a reduction of the gene expression, cells with exaggerated Aβ production presented a reduction of the gene expression as well. In addition, cells not expressing presenilin1 couldn’t show any difference compared to the control cells. So it seems AICD potentiates the gene expression of CavD, whereas Aβ is likely to reduce it. CavB seems to be regulated rather by Aβ, whereas there is an inhibitory effect being observed. Regarding CavG there is a clue, AICD reduces it’s gene expression, as well. Furthermore the gene expression of mentioned above ORAI -, STIM – and VGCC – proteins was analyzed in the humane post mortem cerebral samples of patients with Alzheimer’s disease. In comparison to the control cohort all of genes showed a significant elevation. CavB, CavD, ORAI1, ORAI3, STIM1 and most likely STIM2 are experiencing a reduction by aging when having Alheimer’s disease, whereas CavD is getting reduced with growing age independently of Alzheimer’s disease. Besides that a positive correlation could be shown for CavB, ORAI1, ORAI3 and STIM1 regarding the Braak stage I and V - VI, whereas STIM2 proved a positive correlation between the stages I and VI. Analyzing the importance of the ApoE allels combination, an increase of the gene expression of CavB, CavD and ORAI1 could be proved in case of an additional ε4 – allel. In case of an additional ε3 - allel the gene expression of CavD is getting reduced. No correlation between the gender and gene expression of the investigated genes could be detected.