材料和试剂

动物

双转基因 B6.Cg-Tg(APP SWE /PSEN1 ∆E9 )85Dbo/Mmjax 半合子 (AD + ) 小鼠品系 [RRID:MMRRC_034832-JAX]，最初购自杰克逊实验室的突变小鼠资源和研究中心 (MMRRC) ，然后在 Cedars-Sinai 医疗中心培育和维持。
非转基因野生型（WT）同窝仔（Jackson Laboratory，目录号：000664）

小鼠群被安置在湿度和温度控制 (21-22°C) 的饲养箱中，光照/黑暗周期为 12:12 小时（上午 8:00 亮灯；晚上 8:00 灭灯）免费获得食物和水。

测试了三组不同的小鼠，每组代表不同的年龄：8.5 个月大的 WT（n=13；9 只雄性和 4 只雌性）和 AD + （n=12；9 只雄性和 3 只雌性），13 个月-老 WT（n=11；6 男 5 女）和 AD + （n=11；4 男 7 女）和 18 个月大的 WT（n=19；11 男 8 女）和 AD + （ n = 9；5 男 4 女）。

注意：双转基因 APP SWE /PS1 ΔE9是一种成熟的小鼠品系，在海马和皮层具有早发性 AD 病理（β-淀粉样蛋白斑、严重星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生，以及脑可塑性缺陷和突触丢失）。我们和其他人还报告了这些小鼠视网膜中的 AD 表现（Ning 等人，2008 年；Koronyo 等人，2012 年；Mirzaei 等人，2019 年；Doustar 等人，2020 年；Shi 等人，2020a 和 2020b））。重要的是，这些小鼠的认知缺陷已被充分记录且可重复。我们开发了 ViS4M 以进一步表征视觉功能，尤其是色觉和对比敏感度。其他小鼠品系视网膜中的 AD 病理已得到证实，例如侵袭性表型 5xFAD 或三重转基因 3xTg 小鼠（Criscuolo 等人，2018 年；Grimaldi 等人，2018 年；Habiba 等人，2020 年）。该协议可以在不同的 AD 小鼠品系、正常衰老和其他神经退行性模型上实施，以评估视觉功能。

设备

视觉刺激四臂迷宫 (ViS4M) 装置

注意：我们在下面描述的视觉刺激四臂迷宫（ViS4M 或 Visual X 迷宫）是由我们的团队在内部构思和开发的。用于收集当前数据的原型与由 Maze Engineers 制造的现已商用的 ViS4M 具有相同的规格（包括彩色 LED 灯）（https://conductscience.com/maze/portfolio/visual-x-maze-vis4m/）。

仪器主干
1. 定制的 x 形外壳，内置 15 厘米高的黑色有机玻璃墙，连接到玻璃底座

每条手臂垂直于两个相邻的手臂，长 45 厘米，宽 10 厘米（图 1A-1B）。

可拆卸的透明底板，可安装在每个臂和 ViS4M 中心的两个不同高度（玻璃底座上方 6 厘米或 11 厘米）（图 1C）
白色半透明亚克力板，可以通过在有机玻璃制成的小轨道支架内滑动插入每个楼层下方（图 1C-1D）

注意：行为测试在较高级别（颜色模式）或较低级别（对比模式）上进行，但不会同时在两个级别上进行。

仪器的中心是一个中性区域，没有白色半透明板，其正下方没有光源（图1A-1C）
带有穿孔的塑料透明盖有助于呼吸

注意：色觉和对比敏感度是涉及不同光感受器的视觉的不同方面。对比度模式涉及杆的功能（下中间视范围），而颜色模式需要功能锥（中间和明视范围之间的过渡）。这两种测试方式是互补的，可以了解杆状和锥状光感受器的功能。

发光二极管 (LED) 灯（用于彩色模式）

每个 LED 灯条源由一系列表面贴装器件 (SMD) 3528 个 LED 芯片组成，它们均匀分布在四行中（每行 27 个 LED 芯片），并单独插入 ViS4M 的每个臂中，直接插入玻璃底座（图 1D））。使用 Ocean Optics USB2000 光谱仪确定光源的光谱，并使用 Sekonic C700-U 光谱仪进一步验证（图 1E）。

红色单色光：波长 (λ) = 628 nm，半高全宽 (FWHM) = 17 nm
绿色单色光：λ = 517 nm，FWHM = 31 nm
蓝色单色光：λ = 452 nm，FWHM = 22 nm
白光：λ1 = 441 nm，FWHM = 19 nm 和 λ2 = 533 nm，FWHM = 104 nm

白色 LED 由蓝色发光二极管制成，该二极管还激发嵌入环氧树脂圆顶中的黄色荧光粉 [掺铈钇铝石榴石 (Ce:YAG-Y3Al5O12) 晶体]。

注：选择 LED 颜色的标准如下：红灯作为暗区控制臂，具有低到无颜色刺激；绿光刺激 M-视锥中的小鼠视网膜 M-视蛋白，不刺激 S-视蛋白；除了 M-视蛋白外，蓝光还可以刺激 S 和 M 视锥细胞中的小鼠视网膜 S 视蛋白。

以下组件控制光刺激的亮度。

采用脉宽调制 (PWM) 技术的 LED 单色调光器
用于控制调光器的单独远程设备

图 1. ViS4M 在彩色模式下的特性。

(A) 照片和 (B) 彩色模式下 x 形 ViS4M 的插图和仪器测量。(C) ViS4M 在彩色模式、E 条件下的照片，显示发光臂。(D) 带有红灯开口和白色半透明板插入上层的手臂照片。(E) 迷宫臂内透明地板和白色半透明扩散板的定位图示，并配以臂外前视图的照片。(F) 根据鼠标 M-和 S-视蛋白灵敏度的 LED 光源光谱分布，表格显示光刺激（波长，FWHM）的特性。

灰度对象（用于对比度模式）

四个对象具有以下特征（图 2A）。

直角三棱柱的相同形状
尺寸：底座（相邻侧）= 5 cm；高度（对面）= 1 cm
不同的色调（黑色、灰色、白色和透明）与迷宫的黑色墙壁和白色地板形成不同的对比（图 2B）

用测光表测量的物体与黑色墙壁和/或白色地板的亮度比如下所示。

黑色物体对着黑色墙壁 = 1.06（最小到没有对比度）
黑色墙壁上的灰色物体 = 6.00
黑色墙壁上的白色物体= 9.69（与黑色墙壁的对比度高，但与白色地板的对比度最小）
黑色墙壁上的透明物体 = 6.56
用于放置灰度对象的灵活定位和位置，以适应调查员的目标

图 2. ViS4M 在对比模式下的特性。

(A) ViS4M 在对比度模式下的照片，并带有灰度对象定位的测量值。(B) 从 ViS4M 中心看到的每个臂内物体的照片。物体、黑色墙壁和白色地板被描绘出来以更好地评估对比。(AB) B，黑色；C、清晰；G，灰色；W，怀特。

其他配件
1. Sekonic Flashmate L-308S 测光表（Sekonic，目录号：401-309）
2. 定时器
3. USB数码相机

注意：最好使用彩色相机来识别彩色手臂。但是，如果记录了屏幕上每条手臂的位置，则可以使用黑白相机。在每次测试之前，可以在打开房间的灯和按名称标识的手臂的情况下制作设备定位的简短剪辑。

USB 相机变焦镜头，焦距为 2.8-12 mm

软件

Rodent Toolbox V1（可在https://www.nd免费获得）cn.ox.ac.uk/team/stuart-peirson)
ANY-maze 行为追踪软件 6.3 ( www.stoeltingco.com/anymaze/video-tracking/software.html ) 或其他视频追踪软件，如 EthoVision XT (www.noldus.com/ethovision-xt
ViS4M Toolbox V1（补充文件：ViS4M Toolbox V1）
GraphPad棱镜9.0
ParallelSets V2（可在Parallel Sets (eagereyes.org)免费获得）
Circos 在线（可在mkweb.bcgsc.ca/tableviewer/免费获得）

程序

ViS4M 的配置

将透明地板放置在所选级别的手臂内，并在同一级别插入中心区域透明地板（颜色模式：上级；对比度模式：下级）（图 1C）。
将透明塑料盖放在臂的顶部。
在地板下方的支架内滑动半透明的白板（图 1D）。
设置视觉刺激。

仅限颜色模式：将 LED 光源直接安装在其各自手臂的玻璃底座顶部（图 1D）。

注意：LED 芯片与白色半透明板和透明盖板的组合经过优化，使光线在各个方向上均匀扩散，并产生空间均匀的刺激。没有可辨别的单个 LED 点。

仅对比模式：将灰度对象单独放置在它们各自手臂的中间，在它们的底座上，它们的另一侧面向手臂入口的 ½ 长度（22.5 厘米）（图 2A-2B）。

根据光照条件配置光强

将光源插入电源插座。
使用单独的遥控器打开灯，然后关闭房间的环境光。

以下步骤与使用 Sekonic Flashmate L-308S 测光表测量入射照度有关（操作手册第 19 页）。

将 Lumidisc 附件连接到测光表。
在设备上设置 EV（曝光值）模式和 ISO 100。
定位的光传感器计面向与约在位于臂的中间的轨迹2厘米地板（小鼠眼睛水平）以上的平坦表面。

注意：传感器的定位和测量轨迹的选择是为了一致性和实用性，假设来自每个 LED 光源的光在各个方向均匀地扩散到其各自的臂中。

进行测量。
如有必要，使用遥控器调整光刺激的亮度并进行新的测量。
记录 EV 并按照步骤 5 到 7 继续处理其他三个臂。
分别使用 lux = 2.5×2 EV和 cd/m 2 = 2 (EV-3)关系将记录的 EV 转换为照度单位 (lux) 和亮度单位 (cd/m 2 ) 。

注意：照度和亮度是光源感知亮度的光度测量，因为它根据光谱灵敏度函数与人眼相关。尽管它们为人类实验者提供了光源的信息特征，但它们与鼠标视觉系统无关。应使用辐照度的辐射测量，并可使用 Rodent Toolbox V1（可在https://www.ndcn.ox.ac.uk/team/stuart-peirson免费获得）进行估计。

在 Rodent Toolbox V1（在 Toolbox 选项卡下）中，选择光源类型。
输入光刺激的详细信息 ( λ, FWHM) 和照度 (lux)。
记录估计的辐照度(μW/cm 2 )。

注意：在我们的原始科学报告手稿（Vit 等人，2021 年）中，我们描述了五种不同的照明条件。出于本协议的目的，我们提供了这五种配置中的两种配置的数据分析：红色高 (RH) 和相等 (E) 条件。这两种条件的光度和辐射特性如表 1 所示。

表 1. 光刺激的光度和辐射测量和估计

	红色高				平等的
	电阻	乙	G	宽	电阻	乙	G	宽
电动汽车	5.4	1.9	4.7	6.0	4.9	4.9	4.9	4.7
照度（勒克斯）	103	9	66	164	76	75	73	67
亮度 (cd/m 2 )	4.4	0.4	3.2	8.1	3.7	3.6	3.7	3.3
辐照度 (μW/cm 2 )	52	29	14	40	38	244	17	16

从 EV 的测量（使用 Sekonic L-308S 测光表）到计算四种光源在 RH 和 E 照明条件下的估计光度（照度、亮度）和辐射特性（辐照度）

配置摄像头进行视频录制

将带有变焦镜头的相机放置在 ViS4M 上方。
通过 USB 端口将相机连接到笔记本电脑并打开任何迷宫行为跟踪软件。

注意：我们不会实时跟踪动物轨迹。但是，我们使用 ANY-maze 行为跟踪软件来记录和保存所有测试会话的视频文件，以供以后分析。该软件的免费版本可用于此目的。

使用变焦镜头，使整个设备适合图像。
调整曝光以获得可接受的鼠标在背景上的对比度以进行跟踪

注意：与手臂中间相比，手臂末端的一小部分在照明时明显更暗。为了设置曝光，我们在手臂上使用小的黑色物体（遥控器）来验证整个设备的对比度是否足够。

在每种照明条件之间重新调整曝光。

视频 1. 鼠标在彩色模式下探索 ViS4M 的视频。

显示了彩色手臂条目和交替的顺序（速度×2）。

行为测试（视频 1）

关闭房间的环境光。
（仅限对比度模式）打开昏暗的红光照明（中观，~0.1 cd/m 2 ）。

注意：所有测试均在光照周期的最后三分之一（下午 4:00 至晚上 8:00）在黑暗中进行。唯一的光源由 ViS4M 的发光臂提供。小鼠每天只测试一次。连续几天进行不同的测试条件（颜色和对比度模式）。

把老鼠带到测试室。
让动物在短短 30 分钟内不受干扰，以适应暗室。
在适应期结束时，继续测试第一只鼠标。

注意：我们建议在测试前一天对小鼠进行尾部标记，以便于快速识别。由于考场的灯是关闭的，必要时可以使用手电筒。

开始视频录制并将鼠标 ID 呈现给摄像机。
识别其家笼中的鼠标，并通过打开的顶部将其放置在迷宫的中心。
用透明塑料或有机玻璃板盖住设备的开放中心并启动计时器。
让鼠标自由探索迷宫 5 分钟。

注意：我们建议在测试期间计算条目数。至少需要八个条目以确保适当数量的四臂交替（请参阅数据分析以了解参数的定义）。在对比模式下，物体的存在不会阻止小鼠完全探索 ViS4M 的手臂。大多数小鼠会毫不犹豫地跳过物体到达手臂的远端。

5 分钟后，将鼠标返回其家笼并暂停视频录制。
用 70% 的异丙醇溶液擦拭地板和墙壁，然后用干布彻底擦去多余的酒精。

注意：到下一个鼠标按照此程序（~3 分钟，步骤 6-7）放入设备时，任何残留的酒精痕迹都将蒸发。

按照步骤 6 到 10 继续使用下一个鼠标。

数据分析

ViS4M 中行为测试生成的数据涵盖多个行为领域。参数、行为和分析工具的列表如表 2 所示。

表 2. 分析参数列表

范围	行为	分析工具
行驶距离	运动，一般活动	任何迷宫
平均速度	运动，一般活动	任何迷宫
条目总数	运动，一般活动	ViS4M 工具箱 V1
%自发交替	认知、颜色/对比度辨别	ViS4M 工具箱 V1
每个彩色手臂的时间百分比	颜色/对比度偏好	任何迷宫
每个彩色臂中的 % 条目	颜色/对比度偏好	ViS4M 工具箱 V1
% 单向转换	颜色/对比度辨别	ViS4M 工具箱 V1
% 双向转换	颜色/对比度辨别	ViS4M 工具箱 V1

我们创建了ViS4M 工具箱 V1，两个 Excel 电子表格可通过该协议免费获得。在输入从视频文件（见视频 1）记录的臂条目序列后，ViS4M 工具箱 V1 计算条目总数、自发交替百分比、每个彩色臂中条目的百分比以及单向的百分比和手臂之间的双向转换。

电子表格中与研究识别、小鼠和测试条件（A 列到 F 列）有关的所有单元格都已解锁，可以根据用户的实验进行填充。

arm 条目的文本序列以小写形式输入到 G 列中。两个电子表格中的键不同：“r”代表“红色”，“b”代表“蓝色”，“g”代表“绿色”，“w”代表颜色工具箱中的“白色”，“c”代表“在对比度工具箱中，“清除”、“b”代表“黑色”、“g”代表“灰色”、“w”代表“白色”。所有具有计算参数的单元格都被锁定以防止包含错误。

ViS4M 工具箱 V1 中特定于这些参数及其计算的其他信息在下面以及表 3 中详述。

注意：或者，用户可以选择直接在视频跟踪软件中计算这些参数。但是，使用除以下描述之外的定义将导致与 ViS4M Toolbox V1 中生成的数据不一致。

表 3. 参数和计算说明

参数	wrbwgrgrwrbgrwbgrgwbr	n	计算
字符 ( )	xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx	21

条目 ( )	_eeeeeeeeeeeeeeeeeeee			20

四臂序列 ( )	---ssssssssssssssss			18

交替 ( )	-rbwg --bwgr --------wbg ----------bgrw -----------gwb ------------rwbg -------------wbgr ----------------rgwb -----------------gwbr	9		50%

红色条目 ( )	-r---rrr--r---r---r	7		35%
蓝色条目 ( )	--b-------b---b----b-	4		20%
绿色条目 ( )	----gg----g---gg---	5		25%
白色条目 ( )	_----w----w----w----w--	4		20%

2 臂过渡 ( )	-tttttttttttttttttttt			20

红到蓝 ( ) 蓝到红 ( ) 双向 ( )	-rb------rb----------- -------------------br	2 1 3		10% 5% 15%

红到绿 ( ) 绿色到红色 ( ) 双向 ( )	-----rg---------rg--- ----grgr---gr--gr----	2 4 6		10% 20% 30%

红到白 ( ) 白到红 ( ) 双向 ( )	-------rw---rw------- wr------wr -----------	2 2 4		10% 10% 20%

蓝到绿 ( ) 绿色到蓝色 ( ) 双向 ( )	----------bg--bg----- ---------------------	2 0 2		10% 0% 10%

蓝变白 ( ) 白到蓝 ( ) 双向 ( )	--bw----------------- -------------wb---wb-	1 2 3		5% 10% 15%

绿色到白色 ( ) 白到绿 ( ) 双向 ( )	------------------gw-- ---wg----------------	1 1 2		5% 5% 10%

从文本序列到条目、交替和转换：在 ViS4M 工具箱 V1 中输入的示例。

总条目

获得准确手臂序列的工具是手臂入口的定义。我们在记录 arm 条目时实施以下规则：

一般来说，在探索迷宫时，老鼠会进入一条手臂，然后在手臂内行走，直到它们到达另一端（死胡同），转身，离开手臂，然后访问另一只手臂（参见视频 1）。在这种情况下，这很简单，我们将一个条目视为鼠标的整个身体（不包括尾巴）穿过方形中心和手臂开口端之间的虚拟边界。
会发生小鼠如上所述进入手臂但未到达手臂末端的情况（参见视频 1）。这些事件是否应该算作条目很难推广到整个群体或特定的小鼠组。在仔细查看视频文件后，我们是否包含这些条目。为保持一致性，我们不会在入门级别做出选择；因此，对于特定的鼠标，我们要么计算所有此类条目，要么不计算任何此类条目。
同一组中的两个或多个连续条目计为一个条目。（或者：帐户作为多个条目重新输入，但要确保同一实验中的一致性。）

注意：我们将同一组中的连续条目计算为单个条目的原因有多种。首先，它们是偶发事件（5%）。其次，据我们所知，习惯性地将重新访问同一臂作为具有类似迷宫（例如 Y 迷宫）的单个条目进行分析。第三，它不会改变颜色或对比度线索方面的探索顺序。最后，考虑到它们使成功和不成功交替的组合变得相当复杂，需要分析 5 臂序列（例如，序列 'brgw' 和 'brrgw' 都是 4 种颜色之间的成功交替），因此增加了计算错误。

不计算序列的第一个条目。事实上，当鼠标在测试开始时在迷宫中心释放时，它经常在它所面对的手臂内部运行，这不被认为是故意的选择。

注意：虽然序列中的第一个臂不计为一个条目，但它被考虑用于第一次交替和第一次转换。

条目总数可用作运动活动的指标，因为它可以高保真地预测动物的行进距离（R 2 = 0.8275，P < 0001）和平均速度（R 2 = 0.8317，P < 0001）用跟踪软件 ANY-maze 估计（图 3A）。条目和距离之间的系数因子 1.1 对应于手臂长度和迷宫中心长度之和的两倍 [ ]。

注意：行驶距离和平均速度是大多数跟踪软件的两个基本特征；因此，本协议中没有描述他们使用任何迷宫的估计。

交替

也许 ViS4M 的主要特点是它能够评估认知和视觉功能。自发交替被定义为连续访问四个不同的手臂，而不返回到在四臂序列中已经访问过的手臂（见视频 1）。在 Y 迷宫或 T 迷宫等标准三臂模型中，自发交替的百分比（测试期间三臂序列总数中的交替次数）代表空间导航和工作记忆（Kraeuter等al ., 2019)。

以下是四臂 ViS4M 中四臂序列和交替的特征（另见表 3）。

第一个四臂序列在第三个臂条目处计数，随后的每个条目添加一个新的四臂序列。
从一个特定的起始臂，有 27 个四臂序列可能性中的 6 个交替序列（整个装置中的总数：108 个可能序列中的 24 个交替）。因此，在四臂序列中执行交替的机会约为 22%。

当引入统一配置的 ViS4M（NS，无刺激）时，WT 小鼠的交替几率高出约 10%（图 3B）。然而，当四个臂设置有预定义的光模式或灰度对象时，与 NS（刺激，F (2.599, 38.98) = 5.007, P = 0.0069）相比，交替百分比显着增加到约 50%。小鼠 (图 3B)。这一结果表明，认知和视觉完整的小鼠使用 ViS4M 的视觉刺激作为在迷宫中导航的线索，因此能够根据色度、亮度和/或对比度的差异区分部分或全部手臂。

AD +小鼠在很大程度上是无能到备用早8.5个月长达18个月的年龄时相比，在彩色模式的WT同窝出生仔畜（图3C），RH下（基因型，F （1，69）= 35.31，P <0.0001）和 E 条件（基因型，F (1, 67) = 38.14，P < 0.0001）和对比模式（基因型，F (1, 71) = 57.90，P < 0.0001），表明视觉和/或认知缺陷（见Vit等人的讨论，2021 年）。在 RH、E 和 CT 条件下，任何年龄的每个基因型中的男性和女性之间的交替没有显着差异（图 3D）。然而，在颜色模式下，虽然与性别匹配的 WT 小鼠相比，AD +小鼠的男性（8.5 个月）比女性（13-18 个月）的损伤出现得更早（图 3D），但随着年龄的增长在女性中更为明显AD +小鼠，8.5 和 18 个月之间的交替显着下降，尤其是在 E 条件下（年龄，F (2, 26) = 4.312，P = 0.0241）.在对比模式下，早期缺陷出现在雄性和雌性 AD +小鼠中（图 3D）。在 8.5 到 18.5 个月之间，对比敏感度的下降在 WT 小鼠中最为明显（基因型×年龄，F (2, 71) = 3.869，P = 0.0254），与性别无关（图 3C-3D）。

图 3. 有和没有彩色照明的自发交替。

(A) 在 5 分钟的测试期间，手臂条目总数的线性回归，以及在 ViS4M 中行驶的距离和小鼠的平均速度。(B) ViS4M 在没有刺激 (NS, 无刺激)、彩色照明 (RH, 红色高; E, 相等) 或年轻成人 (8.5 个月) 的灰度物体 (CT, 对比度) 中的交替百分比WT小鼠。✱ P < 0.05，NS 与 RH、E、CT 模式。(C) 8.5、13 和 18 个月大的 WT 和 AD +小鼠在 RH、E 和 CT 条件下的交替百分比。✱ P <0.05，✱✱ P <0.01，✱✱✱ P <0.001，✱✱✱✱ P <0.0001，WT相对于AD +小鼠。(D) 8.5、13 和 18 个月大的雄性和雌性 WT 和 AD +小鼠在 RH、E 和 CT 条件下的交替百分比。✱ P <0.05，✱✱ P <0.01，性别匹配的WT相对于AD +小鼠; # (WT) 或# (AD + ) P < 0.05，8.5 与 18 个月。

下面列出了交替的其他特性。

交替序列可以分为三种途径，如表 4 所示和图 4A-4B 所示。
在每个通路中，交替序列可以从四个臂中的每一个和两个方向开始，导致八种组合（图 4C）。从特定臂开始的交替序列的缺乏或丰富可以表明交替路径内不连续性的位置。
在 ViS4M 中，路径是：❶、❷和❸ （表 4 和图 4B）。

表 4 交替通路和四臂序列的分类

参数	wrbwgrgrwrbgrwbgrgwbr	n	计算
条目 ( )	_eeeeeeeeeeeeeeeeeeee			20

四臂序列 ( )	---ssssssssssssssss			18

四臂交替 ( )	-rbwg --bwgr --------wbg ----------bgrw -----------gwb ------------rwbg -------------wbgr ----------------rgwb -----------------gwbr	9		50%

路径❶	--------wbg	1		12%

路径❷	----------bgrw -----------gwb ------------rwbg -------------wbgr	4		44%

路径❸	-rbwg --bwgr ----------------rgwb -----------------gwbr	4		44%

三臂交替 ( )	小白 ---------rgr	2		11%

2/3 臂交替 ( )	---wgrg -----rgrw ------grwr -------rwrb --------------bgrg ---------------grgw	6		33%

两臂交替 ( )	----grgr	1		6%

类别（4 臂、3 臂、2/3 臂和 2 臂交替）和子类别（路径❶ 、❷和❸交替）：与表 3 中的示例相同。

图 4B 和 4C 显示了 8.5 个月大的 WT 和 AD +小鼠在 RH 条件下的交替序列的详细分析。图 4B 中具有单个数据点的堆积条形图 [路径❶ ( ○ ), 路径❷ ( □ ), 路径❸ ( ▽ )] 显示 WT 小鼠更频繁地在路径❸中交替，而不是路径❶和❷ ，而AD +小鼠主要在路径❶和❷ 中交替（基因型 × 路径，F (2, 44) = 14.50，P < 0.0001）。在路径❸内，与 WT 小鼠相比，AD +小鼠在从红色或蓝色手臂开始时不能或很少能够完成交替（基因型，F (1, 22) = 30.34，P < 0.0001）。

我们使用并行集图表来可视化交替序列。图 4C 说明了在 RH 条件下WT 和 AD +小鼠的交替途径❸ 。WT 小鼠（绿色丝带）显示八个等比例的丝带，对应于该通路中的八种可能的交替。 AD +小鼠（紫色丝带）仅表现出有限的交替序列，表明有色手臂之间的区分不足。总体而言，这些数据表明 AD +小鼠无法依次访问绿色、白色和蓝色手臂，表明难以区分这三个手臂。

图 4. 颜色模式测试中交替的手臂序列分析。

(A) ViS4M 中 3 条交替途径的图示。(B) RH 条件下8.5 个月大的 WT 和 AD +小鼠中三种途径及其起始臂的比例。交替序列路径显示为带有单个数据点的堆叠条。路径❶（○ ）、路径❷ （□ ）、路径❸ （▽ ）。 ## P < 0.01，#### P < 0.0001，WT 小鼠，路径❶和❷与路径❸ ；✱ P <0.05，✱✱✱✱ P <0.0001，路径❷和❸ ，WT相对于AD +小鼠; ✱✱✱ P < 0.001，路径❸ ，红臂开始，WT vs AD +小鼠；✱ P < 0.05，路径❸ ，蓝色手臂开始，WT 与 AD +小鼠。(C) 8.5 个月大的 WT（绿色丝带）和 AD +小鼠（紫色丝带）在 RH 条件（路径❸ ）下使用平行组图的交替序列的可视化。

由于交替仅分别占 WT 和 AD +小鼠所有四臂序列的大约 50% 和 20% ，我们进一步分析了四臂序列。除了 4 臂交替，我们将中止的交替分类如下（见表 4）：

3-arm 交替对应于 3 个不同的 arm 的连续探索，然后在序列的第一个 arm 中重新进入，例如。
2/3 臂交替对应于 3 个不同臂的访问，但不是以连续的方式，例如。
2 臂交替是对 4 臂序列中仅 2 臂的探索，例如.

相反模式，8.5个月大的AD +相比，年龄匹配的野生型小鼠（基因型当小鼠显示的4臂替换和2/3-臂和2-臂交替（图5A）同时增加一个显著减少×序列，F (3, 69) = 14.38，P < 0.0001）。我们将中止的交替（3 臂和 2/3 臂交替）进一步分类为交替通路（图 4A），就像我们对完整的 4 臂交替所做的那样。

三臂交替包含来自两个途径的序列，对应于探索过程中的路径变化。
2/3 臂交替表示路径内的方向变化。

虽然 AD +小鼠表现出 4 臂交替的所有三种途径普遍减少，2/3 臂交替增加，但 3 臂交替的变化特定于路径❸ （基因型× 路径，F (8, 184) = 2.770，P = 0.0065）。平行集图表显示了8.5 个月大的 WT 和 AD +小鼠在对比模式下 4 臂和 2/3 臂交替的路径❸中的详细序列（图 5B）。

图 5. 对比模式测试中的四臂序列分析。

(A)对比模式下8.5 个月大的 WT 和 AD +小鼠的四种 4 臂序列的比例和三种通路的分布。4臂交替（○ ）、3臂交替（□ ）、2/3臂交替（◇ ）、2臂交替（△ ）。✱ P <0.05，✱✱✱ P <0.001，相对于WT AD +小鼠。(B) 8.5 个月大的 WT 和 AD +小鼠的 4 臂（WT：红色丝带；AD + ：绿色丝带）和 2/3 臂交替（WT：蓝色丝带；AD + ：橙色丝带）的可视化在对比模式（路径❸ ）中使用平行集图表。

彩色臂中时间和条目的百分比

手臂偏好以时间百分比和不同配置手臂中的条目来衡量。如图 6A-6C 所示，在具有不同辐照度水平的 RH 和 E 条件之间，WT 小鼠的手臂访问比例不同。总的来说，被视为暗区的红色臂在所有照明条件下都是首选（图 6B-6C 并参见 Vit等人，2021 年）。条件之间的差异主要出现在对蓝色、绿色和白色手臂的探索中（图 6B-6C）。而在 RH 条件下，这三个臂被平等访问，在 E 条件下，当蓝色源的强度急剧增加时，蓝色成为最少访问的（时间：条件 × 颜色，F (1.876, 20.63) = 6.069, P = 0.0094；条目：条件 × 颜色，F (1.730, 52.49) = 6.826，P = 0.0035)。这些结果进一步验证了小鼠使用灯光作为导航 ViS4M 的提示。

图 6. 彩色臂中的时间和条目。

(A) RH 和 E 条件的图示，以μ W/cm 2为单位测量辐照度。(B) 在 RH 和 E 条件下，年轻成年（8.5 个月）WT 小鼠在每个有色手臂上花费的时间百分比。(C) 在 RH 和 E 条件下，年轻成年（8.5 个月）WT 小鼠每个有色手臂的条目百分比。（BC）✱ P <0.05，✱✱ P <0.01，✱✱✱ P <0.001，✱✱✱✱ P <0.0001，与红色与蓝色绿色相对于白色臂; # P < 0.05，RH 与 E 条件。(D)在 E 条件下，8.5、13 和 18 个月大的 WT 和 AD +小鼠在白臂上花费的时间百分比。(E)在 E 条件下，8.5、13 和 18 个月大的 WT 和 AD +小鼠的红色和蓝色臂中的条目百分比。(DE) ✱ P < 0.05，WT 与 AD +小鼠；# P < 0.05，## P < 0.01，8.5 与 13 和 18 个月。

ViS4M 允许在 E 条件下检测 AD +小鼠对白色和蓝色手臂的回避，如在白色手臂上花费的时间百分比所示（基因型，F (1, 67) = 13.28，P = 0.0005 ;与 WT 小鼠相比，年龄，F (2, 67) = 5.004，P = 0.0094) 和蓝色臂的条目百分比（基因型 × 年龄，F (2, 57) = 3.541，P = 0.0355）（图6D-6E)。这些结果可能表明 AD +小鼠对光的年龄依赖性超敏反应与其波长而非绝对辐照度有关。在人类中，AD 与含有内在光敏性黑视蛋白的视网膜神经节细胞 (ipRGC) 的退化和瞳孔光反射 (PLR) 的丧失有关，这可能会导致更高的光敏感性。

手臂之间的过渡

由于 WT 小鼠倾向于在存在光刺激的情况下在 ViS4M 的四个臂之间交替，我们推测臂之间的转换可能表明它们对颜色、光强度和/或对比度的区分。

以下是单向和双向转换的定义（参见表 3 中的示例和计算）。

单向转换被定义为按顺序从一个手臂到下一个手臂的运动。
每个臂有 3 个可能的目的地，总共提供 12 个单向转换。

根据交替序列分析推测，整体单向转换的综合研究突出了 AD +小鼠在区分白、蓝和绿光刺激方面的视觉缺陷（基因型 × 转换，F (3, 89) = 9.469，P < 0.0001 ) 在 RH 条件下 (图 7)。AD +小鼠不太可能在两个方向的蓝色和白色手臂之间以及绿色和白色手臂之间过渡，尤其是与 WT 小鼠相比时，从绿色到白色（图 7A）。然而，他们喜欢蓝色和绿色手臂之间的直线过渡（图 7A），可能反映了重复/冲动行为。这些结果支持优先使用WT 小鼠中的交替路径❸和AD +小鼠中的路径❶和❷ （图 4B-4C）。

我们使用和弦图来可视化彩色臂之间的单向转换。这些图表是使用免费提供的 Circos 在线软件创建的。以下规则描述了我们的单向转换和弦图（图 7B）：

这些段对应于 ViS4M 的四个臂并用颜色表示。
段之间的色带代表单向过渡，并被着色为起始臂。
在开始时添加了丝带帽，以更好地了解他们的目的地。
最频繁（第四四分位数）和最不频繁（第一四分位数）转换显示在单独的图表中，以防止色带过载。

图 7. RH 条件下8.5 个月大的 WT 和 AD +小鼠的单向转变。

(A) B→W、W→B、G→W 和 G→B 转换的百分比。✱ P <0.05，✱✱✱ P <0.001，相对于WT AD +小鼠。(B) 最频繁（顶部）和最不频繁（底部）单向转换的和弦图。

下面是关于双向转换的描述。

双向转换是两个臂之间在两个方向上的转换。
两个方向上的两个臂之间的转换不需要连续计算为双向（见表 3 中的红绿色转换）。
总共有 6 个双向转换。
双向转换不考虑在一个特定方向上转换的偏好。
它们不太可能代表基于绝对辐照度差异的选择。

对于双向转换，所有色带都进行了颜色编码，以对应于热图图表（图 8A-8B），如下所示：

黑色 = 第一个四分位数（最不常见）
灰色 = 第二个四分位数
白色 = 第三个四分位数
橙色 = 第四个四分位数（最常见）

图 8. RH 条件下8.5 个月大的 WT 和 AD +小鼠的双向转换。

(A) R↔B、R↔G、R↔W、B↔G、B↔W和G↔W转变的热图。✱ P <0.05，✱✱ P <0.01，相对于WT AD +小鼠。(B) 从最频繁（橙色）到最不频繁（黑色）双向转换的热图编码和弦图。

双向转换确认了交替序列和单向转换分析的结果。由于这两个臂之间的辐照度差异很小，预计 WT 小鼠中蓝色和绿色臂之间的转换百分比较低（表 2）。这也意味着 WT 小鼠无法根据色度区分蓝色和绿色手臂，这表明在 RH 条件下，蓝光刺激强度低于颜色对抗所需的“真实”S 锥体的激活阈值在老鼠身上。然而，WT小鼠完全能够在蓝白臂和绿白臂之间过渡，白臂仅比蓝绿臂稍亮（蓝白臂之间的绝对辐照度差异甚至小于蓝色和绿色臂），表明歧视可能基于色度，并表明白光刺激的强度足以激活“真正的”S 锥而不是蓝光。

相关性

我们使用线性回归来确定交替和转换的密切关系，这可以表明认知和视觉功能对 ViS4M 中所见行为的贡献。

如先前所示（Vit等人，2021 年），在 RH 条件下，8.5 个月大的 WT 和 AD +小鼠中的交替和绿白转变密切相关（图 9A）。此外，在 WT 而不是 AD +小鼠中，交替与红白转变成反比（图 9B）。这与路径的优先级相一致❸在WT小鼠和路径❶在AD +小鼠。在这里，我们通过绿白转换与AD +和 WT 小鼠的交替路径❶和❸的直接正相关关系来证明这一点（图 9C）。此外，正如预期的那样，绿白过渡增加与两组小鼠中路径❷的减少相关（图 9D），表明这种过渡的重要性，至少在 RH 光照条件下是这样。有趣的是，蓝白转变与 AD +小鼠的交替没有任何关系，表明它们在 RH 条件下对颜色辨别的影响有限。在 RH 条件下，8.5 个月大的 WT 和 AD +小鼠的路径❶的平行组图进一步证明了这一点（图 9E）。

图 9. RH 条件下8.5 个月大的 WT 和 AD +小鼠交替表现的相关性。

(AB) 自发交替的线性回归，在绿色和白色臂 (A) 之间或在红色和白色臂 (B) 之间具有双向转换。(CD) 交替路径❶和❸ (C) 或交替路径❷ (D ) 的线性回归，在绿色和白色臂之间具有双向转换。(E) 8.5 个月大的 WT 和 AD +小鼠在 RH 条件下的交替序列的可视化（路径❶ R↔B↔G↔W）使用平行集图表。

笔记

在本手稿中，我们试图对我们的数据和共享工具进行详细但非详尽的分析，我们发现这些工具有助于发现 AD +小鼠的视力缺陷。我们强调 ViS4M 的多功能性。事实上，我们展示了视觉 x 迷宫可用于测量：

与视觉功能直接相关的认知能力和工作记忆：不同光照条件下的自发交替。ViS4M 可以提供比其他认知测试更大的优势，这些测试也依赖于视觉线索，并且运动活动可能是一种偏见，例如巴恩斯迷宫。事实上，在 ViS4M 中，自发交替不太可能受到动物一般活动的影响。此外，条目总数为活动提供了内部控制；因此，没有必要为自发活动添加另一种行为测试，例如旷场测试。
颜色和对比度辨别：手臂过渡、交替序列分析。我们在研究中选择的光刺激不允许我们区分 S-视蛋白和 M-视蛋白的贡献。出于对实验者和小鼠的明显安全考虑，我们决定在我们的研究中不使用紫外线灯。然而，未来的研究可能会利用 ViS4M 的调节功能，并用 UV LED 代替蓝色，以确认与 S 锥激活和颜色辨别直接相关的行为。尽管亮度是一个混杂因素，但我们的研究结果支持颜色（波长）歧视在小鼠视觉行为和 AD +小鼠缺陷中起着关键作用。虽然我们的照明条件可以为实验设计提供一个有用的起点，但 ViS4M 的使用并不限于这些设置。我们鼓励研究人员根据他们的研究目标配置光的强度。
光敏性：在不同臂中花费/进入的时间百分比。我们提供的证据表明 ViS4M 能够检测到对黑暗（总体偏爱红色手臂）和明亮光线（避免蓝色手臂）的简单先天反应。ViS4M 可以在畏光和焦虑模型中提供一种替代明暗盒测试的方法，可以控制每个刺激的亮度。
即使在我们的研究中没有进行测试，ViS4M 也提供了将光刺激与厌恶的足震配对的可能性。因此，可以使用该装置想象条件学习和被动/主动回避的范式。

总体而言，视觉刺激四臂迷宫测试与此处描述的分析工具相结合，可以灵活地探索啮齿类动物的多个行为域，这可能有利于调查广泛的神经、精神和眼部疾病。

致谢

我们感谢 Samuel Fuchs 对图 1A 的原始插图、Sarah Fuchs 对补充视频 1 的视频编辑以及 Mia Oviatt 对手稿的编辑。作者将手稿献给死于阿尔茨海默病的 Salomon Moni Hamaoui 博士和 Lillian Jones Black 博士。

这份手稿得到了美国国立卫生研究院国家老龄化研究所的支持，奖励 R01 AG055865 和 R01 AG056478 (MKH)，以及海姆萨班和汤姆戈登基金会 (MKH)。我们承认该协议源自的原始研究论文：Vit JP、Fuchs DT、Angel A、Levy A、Lamensdorf I、Black KL、Koronyo Y、Koronyo-Hamaoui M。衰老和阿尔茨海默病小鼠模型中的颜色和对比度视觉使用新型视觉刺激四臂迷宫研究疾病。Sci Rep. 2021 年 1 月 13 日；11(1):1255。doi：10.1038/s41598-021-80988-0。PMID：33441984；PMCID：PMC7806734 （Vit等，2021）。

利益争夺

MKH、YK 和 KLB 是 NeuroVision Imaging, Inc. 的联合创始人和股东，地址为 1395 Garden Highway, Suite 250, Sacramento, CA 95833, USA。MKH、YK 和 KLB 是专利“用于检测前驱阿尔茨海默病和阿尔茨海默病视觉异常的视觉刺激迷宫测试”专利的共同发明人，申请号 US16/301,585，提交日期 6/2/2017，授权给 Maze Engineers，5250 Old Orchard Rd., Skokie, Illinois. Ariel Angel、Aharon Levy 和 Itschak Lamensdorf 是 Pharmaseed Ltd., Ness Ziona 74047, Israel 的前任或现任员工。Jean-Philippe Vit 和 Dieu-Trang Fuchs 没有竞争利益。

伦理

所有实验均遵循 NIH 实验动物护理和使用指南，并获得 Cedars-Sinai 医学中心机构动物护理和使用委员会的批准（IACUC 协议 6617 和 8475，有效期为 2016 年 2 月至 2022 年 2 月）。该研究是按照 ARRIVE 指南进行的。

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