材料和试剂
25号针头（Fisher Scientific，目录号：10442204）
1 ml注射器（Fisher Scientific，目录号：15849152）
Eppendorf管（Fisher Scientific，目录号：13094697 ）
包埋盒（Fisher Scientific，Simport 乙缩醛组织学盒，目录号：10420823）
载玻片（Fisher Scientific，目录号：12343138）
移液器和技巧
ErgoOne 单通道移液器20-200 µl （STARLAB（UK）Ltd，目录号：S7100-2200）
ErgoOne 单道移液器100-1 ，000 微升（STARLAB（英国）有限公司，目录编号：S7110-1000）
Yellow Tips（Sterile），Racked（STARLAB（UK）Ltd，目录号：S1111-0816-C ）
1 ，000微升蓝毕业提示（无菌），安装机架（STARLAB（英国）有限公司，目录号码：S1111-6811-C ）
疏水性隔离笔（Vector Laboratories，ImmEdge 疏水性隔离笔，目录号：H-4001 ）
加湿室，例如带密封盖的塑料盒（防止组织变干）。将湿纸巾放入盒子的底部。为了使幻灯片远离湿纸，请插入打孔的底座（可以通过将巴氏移液器切成相同大小的块并将其编成网格形式来制成。请确保其水平。）
卫生纸
带滑架的容器可容纳约400-500毫升
刷子（用于清洁样品之间的切片机刀片）
玻璃盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12343138）
8 - 瓦特伊克大，雄性C57BL / 6小鼠（n =每组6只）（查尔斯河，马盖特，UK）
20 Kg 腺嘌呤饮食（LBS-Biotech，Hookwood ，UK，SDS饮食，目录号：824534 ），RM1 + 0.15％腺嘌呤，储存温度4°C
注意：同时从SDS饮食中购买20 Kg 824534 RM1饮食（正常腺嘌呤浓度）以用作对照）。有关饮食的详细组成，请参见附件“腺嘌呤饮食组成” 。
氯胺酮100 mg / ml 溶液（Narketan ，MWI动物卫生，萨默塞特郡，英国，目录号：03120257 ），储存温度–室温（RTP）
盐酸赛拉嗪2％w / v溶液（Rompun ，MWI动物卫生，英国萨默塞特，目录号：02150569 ），储存温度–RTP
丁丙诺啡0.3 mg / ml 溶液（Vertegesic ，MWI动物卫生，萨默塞特郡，英国，目录号：01300258 ），储存温度–RTP
肝素钠5 ，000 U /米升（MWI动物健康，萨默塞特，UK，目录号：30394030 ），存储温度-rtp
乙醇（Fisher Scientific，目录号：10233962），储存温度–RTP
磷酸盐缓冲盐水（Fisher Scientific，PBS，目录号：10173433），储存温度4°C
福尔马林（Sigma - Aldrich，目录号：HT5014），储存温度–RTP
二甲苯（Fisher Scientific，目录号：10467270），储存温度–RTP
Parrafin （Fisher Scientific，Thermo Scientific理查德·艾伦·理查德·艾伦科学组织塑料石蜡，目录号：12683026），储存温度–RTP
过氧化氢（Fisher Scientific，H 2 O 2 ，目录号：10687022），储存温度4°C
Triton X-100（Sigma - Aldrich，目录号：T8787），储存温度–RTP
牛血清白蛋白（Fisher Scientific，BSA，目录号：11423164 ），储存温度4°C
一抗，抗α-平滑肌肌动蛋白抗体（Abcam，目录号：ab5694），储存温度-20°C
一抗，抗I型胶原蛋白抗体（Abcam，目录号：ab21286 ），储存温度4°C
一抗，抗胶原III抗体（Abcam，目录号：ab7778 ），储存温度4°C
二抗，山羊抗兔IgG H＆L（HRP）（Abcam，目录号：ab205718），储存温度4°C
正常山羊血清（Abcam，目录号：ab7481），储存温度4°C
DAB（Fisher Scientific，目录号：10006913 ），DAB的耐受温度为-20°C。DAB底物套件的耐受温度为4°C
冰醋酸（Sigma - Aldrich，目录号：A6283），储存温度–RTP
盐酸TRIS（Tris-HCl）（Sigma - Aldrich，目录号：RES3098T-B7 ），储存温度RTP
氯化钠（NaCl ）（Sigma - Aldrich，目录号：S9888 ），储存温度–RTP
氢氧化铵（NH 4 OH）30％溶液（Sigma - Aldrich，目录号：221228-1L-A），储存温度RTP
柠檬酸钠（Sigma - Aldrich，柠檬酸三钠（二水合物），目录号：W302600），储存温度RTP
Tween 20（Sigma - Aldrich，目录号：93773 ），储存温度RTP
苏木精（Vector Laboratories公司有限公司，VECTOR ® HEMATOXYLINNUCLEAR染液，目录号：H-3401），存储温度RTP
固定介质（Vector Laboratories，VectaMount 永久固定介质，目录号：H-5000），存储温度RTP
盐酸（Sigma - Aldrich，目录号：258148），储存温度RTP
蓝光解决方案（请参阅食谱）
酸漂洗液（请参阅配方）
柠檬酸钠缓冲液（请参见食谱）
TBS缓冲区（请参阅食谱）

设备
解剖钳（哈佛仪器，珠宝商钳，第7号，目录号：72-8685）
剪刀（哈佛仪器，眼用剪刀，笔直，锋利/锋利的产品，目录号：2-8438）
用于识别小鼠的耳模（哈佛仪器，型号4.7.2镊子式打孔器，2.0毫米孔，货号：34-0137）
通风柜（Fisher Scientific，Thermo Scientific Hyperclean TruAir 无管通风柜，目录号：15613136）
轨道振动器（Fisher Scientific，Stuart轨道振动器，目录号：10759145）
真空烤箱（Fisher Scientific，Technico ，目录号：13025703）
切片机和刀片，Fisher Scientific，HM 325旋转切片机，目录号：12052999）
水浴（Fisher Scientific，克利夫顿无搅拌数字水浴，目录号：15700619）
家用不锈钢压力锅（例如Argos，Tower Compact 4 升压力锅，目录号：711/5008）
热板（Fisher Scientific，带搅拌器的Stuart热板，目录号：11966558）
离心机（Fisher Scientific，Thermo Scientific Heraeus Megafuge 8，目录号：15211026）
显微镜（匈牙利布达佩斯3D Histech Ltd，全景扫描250显微镜）
冰箱（Fisher Scientific，英国拉夫堡，利勃海尔，12088281）
包含多个容器的染色套件（Tissue Tek Slide染色皿，Sakura Finetek Europe，Alphen aan den Rijn，荷兰，S76316）

软件
Panoramic Viewer软件（匈牙利布达佩斯的3D Histech Ltd）
ImageJ软件（https://imagej.nih.gov）
Excel（https://products.office.com/en-gb/excel）
GraphPad Prism（https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）

程序
小鼠肾性心脏病综合征的诱导和组织样品的收集
允许至少8周大的C57BL / 6 品系小鼠在具有12小时光照/黑暗周期的房间内的动物设施中适应7天，可以自由获取食物和水。
在第8天，给小鼠称重并更换笼子/饮食，使一半的小鼠正常食物，另一半的食物包含0.15％腺嘌呤。
继续对小鼠进行20 周的饮食管理，每周称重一次。
在第20周：
制备anaesthe 抽动氯胺酮：甲苯噻嗪为2：1倍的比例。用PBS稀释1:10。称重小鼠，并以1.5 ml / kg的剂量腹膜内给药。
当小鼠为3分钟后anaestheti ž ED （检查捏反射即，捏脚，应该没有响应）。
腹膜内给予丁丙诺啡（0.03 ml / Kg）。等待3分钟
通过心脏穿刺去除血液，方法是将附着在1 ml注射器上的25针肝素化针插入左心室（参见视频链接，Stewart和Schroeder ，2020年），通过短暂地吸出并从管中排出肝素来使肝素化针，可以重复使用肝素用于多针。
大约应收集0.5 毫升血液。进行剖腹手术，然后进行开胸手术。移开心脏并称重。血液应在17离心，000 X 克/ 3分钟为分离血浆并储存在冰箱中。
取出左右肾脏。短暂地在冷PBS中洗涤，然后纵向切割并放入福尔马林进行固定。
24小时后，制成70％乙醇的溶液，将肾脏从福尔马林转移到70％乙醇中。
24小时后，用PBS冲洗组织。
将血液送至服务实验室（IDEXX，Bioresearch，德国路德维希堡），以进行生化测定（血浆肌酐和尿素）以确定肾功能衰竭的程度。
组织石蜡化
脱水组织
在室温（RTP）中于50％乙醇中孵育10分钟。
然后加入70％乙醇10分钟（RTP）。
然后在80％的乙醇中放置10分钟（RTP）。
然后在95％乙醇中放置10分钟（RTP）。
然后100％乙醇浸泡10分钟（RTP）。重复此步骤2次。
然后以2：1的比例混合乙醇：二甲苯10分钟（RTP）。
然后用1：1的比例Ë THANOL：二甲苯10分钟（RTP）。
然后以1：2的比例混合乙醇：二甲苯10分钟（RTP）。
然后100％二甲苯10分钟（RTP）。重复此步骤2次。
将样品转移到设置为56的真空烘箱中 ℃。
然后在56 °C下以2：1的比例混合二甲苯：石蜡30分钟。
然后在56 °C下以1：1的比例混合二甲苯：石蜡30分钟。
然后在56 °C下以1：2的比例混合二甲苯：石蜡30分钟。
然后在56 °C下100％石蜡干燥2 h 。
然后100％石蜡在56 °C 过夜。
将纵向切开的肾脏以新的石蜡方向包埋，使包埋盒的蜡内侧朝上。
Sectio 宁
将带有样品的包埋盒在冰上放置约2小时，或最好在冰箱中放置过夜，以冷却并便于切割。
使用切片机切开5μm 的肾脏切片。
放入设定为42 °C的水浴中。
将各个部分收集到幻灯片上。
放入滑架，并在37 °C的烤箱中干燥过夜。
Deparaffini ž Ë 和幻灯片补充水分
将玻片放在架子上，并在室温（RTP）中于二甲苯中孵育3分钟。重复此步骤2次。
然后以二甲苯：100％乙醇1：1的比例混合3分钟（RTP）。
然后加入100％乙醇3分钟（RTP）。重复此步骤。
然后在95％乙醇中放置3分钟（RTP）。
然后加入70％的乙醇3分钟（RTP）。
然后加入50％乙醇3分钟（RTP）。
最后用冷自来水冲洗掉多余的乙醇。让载玻片在自来水下冲洗，直到准备好抗原回收方案（防止变干）。
抗原回收
将足够的柠檬酸钠pH 6.0缓冲液倒入玻片容器中，以覆盖玻片并放入高压锅中。
将压力锅放在电炉上，将其打开至全功率。将压力锅盖放在顶部（未拧紧）。
锅煮沸后，用镊子将载玻片从自来水中小心地转移到锅中。按照制造商的说明拧紧盖子。
让炊具达到最大压力，然后等待3分钟。
3分钟后，关闭电热板，小心地从电热板上取下电磁炉，然后将压力锅放入水槽中。
启动压力释放阀，并在电磁炉上注入冷自来水。减压后，取下盖子，将冷自来水倒入锅中10分钟。
载玻片现在可以染色了。
染色
将Triton X-100以0.025％的最终浓度添加到TBS缓冲液中。
在TBS Triton X-100缓冲液中轻轻旋转的轨道振荡器上洗涤载玻片2 x 5分钟。
准备封闭缓冲液（TBS + 1％BSA + 10％正常血清）。
在RTP振荡器上，在封闭缓冲液中将载玻片封闭2小时。
取出幻灯片并用纸巾擦拭（在各个部分周围）。
使用疏水性隔离笔在各部分周围绘制。
准备一抗：
抗SMA抗体（在TBS缓冲液/ 1％BSA中以1：250稀释的ab5694）
要么
抗胶原蛋白I（在TBS缓冲液/ 1％BSA中以1：200稀释的ab21286）
要么
抗胶原蛋白III（ab7778在TBS缓冲液/ 1％BSA中以1：400稀释）。
准备加湿室中（PLAS 抽动盒托盘用湿纸巾内衬，粘贴在一起而形成的凸起的平台下巴斯德移液管，参见图URE 低于1）。将幻灯片平放在顶部，部分朝上。将抗体涂在幻灯片上的切片上。关上盖子。

图URE 1.加湿室中。一。巴斯德移液器用胶带粘在一起。乙。W¯¯ 箱等生活用纸。Ç 。小号大环内酯类奠定之上。d 。我的身子紧闭。

在4 °C下孵育过夜。
在TBS / 0.025％Triton X-100中将载玻片洗涤5分钟，轻轻摇动，RTP。
重复洗涤。
在TBS中准备0.3％H 2 O 2 。
涂在切片上，孵育15分钟，轻轻摇动，RTP。
检测步骤
准备在TBS / 1％BSA中以1：1,000稀释的二抗山羊抗兔IgG H＆L（HRP）（ab205718）。
涂在玻片上，温育1小时，轻轻摇动，RTP。
将DAB 色原加到玻片上，轻摇10分钟，RTP。
在流动的自来水下冲洗载玻片5分钟。
用苏木精染色。将Vector苏木精加到玻片上，轻轻摇动5分钟，RTP。
用自来水冲洗幻灯片，直到水无色。
将玻片浸入酸洗液中10次。
浸入自来水中10次。
将Bluing解决方案添加到幻灯片上，轻轻摇动1分钟，RTP。
浸入自来水中10次。
使组织脱水，清除并固定
在室温（RTP）下于95％乙醇中孵育玻片10分钟。
然后100％乙醇浸泡10分钟（RTP）。重复此步骤2次。
然后100％二甲苯10分钟（RTP）。重复此步骤2次。
通过排水滑轨安装
在部分上滴一滴安装介质。
盖上盖玻片以确保没有气泡。

影像采集
使用Panoramic Scanning 250显微镜（匈牙利布达佩斯3D Histech Ltd）以20倍的放大倍率记录图像（图2 ）。

数据分析
使用GraphPad Prism 5软件（GraphPad Software Inc，CA，美国）进行统计分析。值表示为n个观测值的平均值±SEM。使用未配对的t 检验计算经腺嘌呤治疗的小鼠和对照组之间的差异。P <0.05被认为具有统计学意义。
要计算样品之间的α-SMA染色增加，请使用ImageJ中的对照样品玻片打开文件。我。e。，单击“文件”，然后选择“打开”。通过单击“编辑”反转图像，然后选择“反转”。通过在图像周围的黑暗区域绘制一个约0.5 cm 2 的矩形进行背景测量。单击“分析”，然后选择“测量”。值将出现在名为“结果” 的数据文件中，该文件将自动打开。接下来，将相同的矩形拖到肾脏上，对肾脏进行6次随机测量（每次单击“测量”）。重复2个对照玻片，然后再用3个经腺嘌呤治疗的肾脏玻片（确保矩形与所有玻片的大小完全相同）。
保存所有图片和结果文件。最后，单击“结果”文件中的“复制”，将数据传输到Excel文件。从所有测量值中减去背景值。计算每个滑块e的平均值（表2 ）。

表2 。Excel电子表格中的数据

将结果输入到Gra phPad Prism中，以转换为柱形图（表3 ）。

表3 。GraphPad Prism中的数据

单击“图形”图标以获取图形。编辑图（图2 ）。

图2 。通过α- SMA，胶原蛋白I和胶原蛋白III的免疫染色来证明肾脏肥大。对照组（n = 6）接受标准食物20周。腺嘌呤治疗组（n = 10）接受标准食物加0.15％腺嘌呤治疗20周。与对照组（A）相比，肾脏的免疫染色显示腺嘌呤组（B）的α- SMA染色显着增加（P <0.0001）。与对照组（C）相比，腺嘌呤组（D）的胶原蛋白I染色显着增加（P <0.0001）。与对照组（E）相比，腺嘌呤组（F）的胶原蛋白III染色显着增加（P <0.0001），平均值±SEM未配对t 检验。代表性图像（每组3只小鼠）。

笔记

必须根据国家动物研究法律准则并获得当地伦理委员会的批准进行动物实验。
请勿对9周以下的动物进行饮食控制。
不要在福尔马林中固定组织超过24 小时，因为过度固定可能会抑制抗原：抗体结合。
CKD的确认感应从血液生化结果与继续之前P ROC edure B. Paraffinisation 组织。
使用二甲苯的步骤应在通风橱内进行。

菜谱
蓝光解决方案
1.5 ml NH 4 OH（储备液为30％）+ 98.5 ml的70％乙醇。在RTP上存储长达3个月
酸洗液
2毫升冰醋酸+ 98毫升去离子或蒸馏水H 2 O
在RTP上存储长达3个月
柠檬酸钠缓冲液
10 mM柠檬酸钠，0.05％Tween 20，pH 6.0。将2.94 g 柠檬酸三钠（二水合物）溶于1 L蒸馏水中，并用1 N HCl将pH调节至6.0
加入0.5 ml吐温20并混合均匀
在RTP中储存长达3个月，或在4 °C下储存更长时间
TBS缓冲区
50 mM Tris-Cl，pH 7.5，150 mM NaCl
将6.05 g Tris和8.76 g NaCl溶解在800 ml H 2 O中
用1 M HCl将pH调节至7.5，并用H 2 O 调节至1 L
TBS在4°C下稳定3个月

致谢
我们感谢以下资助机构使这项研究成为可能：
Julius Kieswich – 巴特斯和伦敦皇家医院糖尿病肾病中心。
建民陈- 中国国家留学基金委（授权号201206240146）。
Samira Alliouachene – 巴茨和伦敦皇家医院糖尿病肾病中心。
保罗·卡顿（Paul Caton）– 巴茨和伦敦皇家医院糖尿病肾病中心。
基兰·麦卡菲蒂（Kieran McCafferty）– 巴特斯和伦敦皇家医院糖尿病肾病中心。
C. Thiemermann – 威廉·哈维研究基金会。
Muhammad Yaqoob – 巴特斯和伦敦皇家医院糖尿病肾病中心。
资助机构在研究的设计，数据的收集，分析或解释以及手稿的撰写中均不起作用。该协议的简短版本出现在BMC Nephrology（Kieswich et al。，2018）中。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理
根据英国内政部动物（科学程序）法1986进行动物实验，并得到当地伦理委员会的批准。根据内政部项目许可证编号：70/8350，该许可证是由伦敦玛丽皇后大学动物福利和道德审查机构（AWERB）审查后授予的。

参考文献
Bursac ，N.（2014年）。心脏成纤维细胞在压力超负荷肥大中：敌人在哪里？J临床投资124（7）：2850-2853。
de Jager，DJ，Grootendorst，DC，Jager，KJ，van Dijk，PC，Tomas，LM，Ansell，D.，Collart ，F.，Finne ，P.，Heaf ，JG，De Meester ，J.，Wetzels ，JF ，Rosendaal ，FR和Dekker，FW（2009）。开始透析的患者的心血管和非心血管死亡率。JAMA 302（16）：1782-1789。
休伊森（Hewitson），道明（2012）。肾脏纤维化：共享的问题减半吗？纤维发生组织修复5（Suppl 1）：S14。
休伊特森（Hewitson），TD，霍尔特（SG）和史密斯（ER）（2015）。用于研究心血管疾病和肾衰竭之间的联系及其与人类病理学相关性的动物模型。正面免疫6：465。
Jia T.，Olauson H.，Lindberg K.，Amin R.，Edvardsson K.，Lindholm B.，Andersson G.，Wernerson A.，Sabbagh Y.，Schiavi S.拉尔森（TE）（2013）。小鼠腺嘌呤诱导的肾小管间质性肾病的新型模型。BMC Nephrol 14：116。
Kieswich ，JE，Chen，J.，Alliouachene ，S.，Caton，PW，McCafferty，K.，Thiemermann ，C.和Yaqoob，MM（2018）。C57BL / 6小鼠品系中的一种新的雷诺-心脏综合征模型。BMC Nephrol 19（1）：346。
Kren ，S。和Hostetter，TH（1999）。小鼠残余肾脏模型的过程。肾脏国际56（1）：333-337。
Kumar，S.，Bogle，R.和Banerjee，D.（2014年）。为什么患有慢性肾脏病的年轻人早死？World J Nephrol 3（4）：143-155。
莫里森，AB（1962）。实验性诱导大鼠慢性肾功能不全。实验室投资11：321-332。
Ronco ，C.，Haapio ，M.，House，AA，Anavekar ，N。和Bellomo ，R。（2008）。心肾综合征。J Am Coll Cardiol 52（19）：1527-1539。
Seong ，E.，Saunders，TL，Stewart，CL和Burmeister，M。（2004）。要在129或C57BL / 6中进行剔除：这就是问题所在。趋势遗传20（2）：59-62。
Steenkamp，R.，Shaw，C.和Feest ，T.（2013）。英国肾脏登记处第15次年度报告：第5章：2011年接受肾脏替代治疗的英国成年患者的生存和死亡原因：国家和中心特定分析。Nephron Clin Pract 123增刊1：93-123。
Stewart K. and Schroeder V A.（2020年）。JoVE 科学教育数据库。实验动物研究。抽血I. JoVE ，马萨诸塞州剑桥。
横泽，T。，欧拉，H。和冈田，T。（1982）。日粮嘌呤在大鼠中的代谢作用。Ĵ 营养学科学Vitaminol （东京）28（5）：519-526。