Role of extracellular vesicles in nephrology. Prospective use in therapy of kidneys and urinary tract diseases

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Межклеточная коммуникация — это очень сложная и тонко регулируемая система, которая обеспечивает надлежащее взаимодействие между различными типами клеток в тканях. Сравнительно недавно внеклеточные везикулы (ВВ) как производные клеток были описаны в качестве особого механизма коммуникации между клетками [2, 47, 51]. В последние годы получены обширные доказательства, что ВВ придают стабильность внутривезикулярным белкам и нуклеиновым кислотам, защищая их от ферментативной деградации в межклеточной среде, опосредуя их внедрение в определенные типы клеток-реципиентов [104, 135, 201]. От момента открытия [227] до настоящего времени ВВ были идентифицированы не только во всех типах клеток млекопитающих и в их биожидкостях, но и в клетках низших эукариот, прокариотах и даже растениях [6, 245]. Таким образом, эти данные позволяют предположить, что опосредованная везикулами клеточная коммуникация возникла в ходе эволюции очень давно, именно как важный механизм клеточного взаимодействия [5].

Многочисленными исследованиями установлено, что ВВ вовлечены в патофизиологию различных органов [92]. Например, они принимают участие в опухолевом процессе. Показано, что ВВ могут модулировать межклеточную коммуникацию в микроокружении опухоли и играть существенную роль в лекарственной устойчивости, а мигрируя из опухоли в отдаленные тканевые ниши, могут способствовать образованию метастазов [21, 242]. В процессе исследования клеток мозга также показано, что ВВ переносят и распространяют через клетки мозга структурно неправильные белки, которые принимают участие в развитии нескольких нейродегенеративных заболеваний, таких как прионная патология, болезнь Альцгеймера и Паркинсона, а также боковой амиотрофический склероз [193]. Имеются данные, свидетельствующие об участии ВВ в патофизиологии ряда заболеваний печени [151] и аутоиммунных заболеваний, сопровождающих системную красную волчанку и рассеянный склероз [231].

С другой стороны, ВВ участвуют в различных физиологических процессах, связанных с функционированием адаптивного и врожденного иммунитета [30, 149], с дифференцировкой стволовых клеток [201], с кальцификацией костей, с процессами эмбриогенеза, с гомеостазом печени [247] и процессами коагуляции [57]. Кроме того, ВВ играют свою роль в репродуктивных процессах: при гаметогенезе, при оплодотворении и имплантации эмбриона [150]. В отдельных исследованиях показано, что ВВ опосредуют связь между нейронами в головном мозге, способствуя таким образом локальной и дистальной синаптической пластичности [35].

В ряде работ по исследованию почек было установлено, что ВВ участвуют в патофизиологических процессах путем опосредования межклеточной коммуникации, за счет передачи своего содержимого клеткам-реципиентам и последующей активации сигнальных путей в клетках-мишенях [28, 103, 122]. Впервые о наличии ВВ в мочевыводящих путях было сообщено в начале 1990-го года [228], впоследствии эти везикулы были полностью охарактеризованы лишь в 2004 г. [128]. В статье A. Ranghino et al. [199] отмечено, что ВВ активно высвобождаются почти всеми клетками почки вдоль нефрона и клетками урогенитального тракта, а также инфильтрирующими воспаленными клетками. ВВ могут восприниматься клетками вдоль восходящих и нисходящих канальцев и могут повлиять на функцию клеток-реципиентов [128]. Первоначально считали, что основная физиологическая роль ВВ заключается в выведении отработанного клеточного содержимого, в частности, балластных белков и липидов [235]. Значительное количество энергии, требуемое для выведения ВВ, а также участие в других физиологических функциях [128] предполагает участие ВВ в качестве потенциальных месенджеров клеточной коммуникации в почках. Следовательно, можно предположить, что изменения в количестве, происхождении или содержании ВВ, выделенных из мочи, могут сигнализировать об изменении физиологического состояния почек [199]. В работе S. Bruno et al. [33] было установлено, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обладают регенеративной активностью в почках, поэтому ВВ, производные этих МСК, вовлечены в качестве основных игроков клеточной коммуникации и могут быть применимы при лечении патологии почек.

БИОГЕНЕЗ И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ

ВВ представляют собой смешанную популяцию микрочастиц, которую обычно классифицируют по биогенезу, размерам и поверхностным маркерам [4]. Международным обществом по везикулам принято решение, что основными классами неапоптозных ВВ являются экзосомы и микровезикулы [69, 95, 120].

Установлено, что экзосомы высвобождаются из эндосомального компартмента и имеют размер от 40 до 150 нм [90]. Они хранятся в мультивезикулярных телах (MВТ) поздней эндосомы, которые впоследствии сливаются с клеточной мембраной и высвобождают свое содержимое [93, 153]. При этом точный механизм сборки и сортировки экзосом в деталях еще не установлен. Тем не менее за последнее время было представлено несколько механизмов биогенеза экзосом [17, 158, 194] (рис. 1). Выявлено, что для транспортировки экзосом необходим эндосомальный сортировочный комплекс (ЭСК), который образует спирали, которые, в свою очередь, индуцируют внутреннее почкование и деление комплекса, формируя внеклеточные экзосомы [45, 134, 154, 252]. Подобный механизм с участием ЭСК, по-видимому, используется вирусами для почкования на плазматической мембране клеток-хозяев и последующего высвобождения вирусных частиц [79, 137]. Малые ГТФазы (такие как RAB11, RAB27A, RAB31) участвуют в слиянии MВТ с клеточной мембраной [26, 178]. Ранее было показано, что активация цитоскелета при помощи белка р53 также регулирует экзоцитоз экзосом [249]. В ряде исследований установлено, что образование церамида тоже имеет важное значение в биогенезе экзосом [227]. Впоследствии было показано, что это происходит за счет модификации содержимого экзосом [82, 149].

 

Рис. 1. Схема образования внеклеточных везикул (ВВ) (экзосом и микровезикул). МВТ — мультифезикулярное тело; ЭТК — экзосомально-транспортный комплекс

 

Другой вид внеклеточных везикул — микровезикулы, крупнее экзосом и представляют собой более гетерогенную популяцию везикул (100–1000 нм), образующихся при почковании поверхности клеток (рис.1) [69, 90, 225]. Процесс везикуляции регулируется мембранными липидными микродоменами (рафтами) и динамическим сокращением плазматической мембраны, которое контролируется, в частности, фактором АДФ-рибозилирования (ARF6) [60, 166]. За счет изменения концентрации кальция активируются специфические ферменты: флиппаза, флоппаза и скрамблаза, которые преобразуют асимметрию мембранных фосфолипидов [108]. Этот процесс активирует скрамблазу и является АТФ-зависимым [63], при этом активированная скрамблаза осуществляет перемещение фосфатидилсерина с внутренней на внешнюю сторону клеточной мембраны [9]. Параллельно происходит активация кальцием цитозольных протеаз, гельсолина и кальпаина, что способствует отслоению плазматических мембранных выступов от структурного актина мембраны, процесс сопровождается выпячиванием мембраны с последующим образованием микровезикулы [47].

Поскольку микровезикулы секретируются совместно с экзосомами и разделяют некоторые из их функций и характеристик, было предложено обозначать их общим термином как ВВ [84]. Показано, что внутривезикулярное содержимое разнообразно и включает цитоплазматические белки, поверхностные рецепторы, некоторые липидные рафт-взаимодействующие белки, ДНК и несколько видов РНК [135, 225]. Установлено, что мембраны ВВ обогащены липидами, состоящими из гликосфинголипидов, сфингомиелинов, холестерина и фосфатидилсерина [33, 140]. Поскольку ВВ высвобождаются клетками, то их образование регулируется биохимической машиной клетки. Производство экзосом, например, зависит от экспрессии и активности клеточно-специфичных Rab ГТФaз, а также от взаимодействия между ними и сетью микротрубочек клетки [235]. Показано также, что секреция ВВ повышается в условиях клеточного стресса, при гипоксии, голодании, изменении рН, изменении напряжения сдвига мембраны, при окислительном стрессе, термических воздействиях, при облучении, воспалении [126, 204], а также при активации сигнального каскада и деполяризации мембраны [200].

Механизм захвата клетками-реципиентами внутривезикулярных компонентов внеклеточных везикул

В настоящее время общепризнано, что ВВ являются важными информационными векторами, взаимодействующими с клетками для регуляции экспрессии генов и модуляции фенотипов соседних или удаленных клеток-реципиентов [2, 5, 230].

Было установлено, что ВВ захватываются клетками-реципиентами несколькими способами или механизмами (рис. 2).

 

Рис. 2. Механизмы участия внеклеточных везикул в клеточной коммуникации

 

Во-первых, они могут внедриться в клетку-реципиент путем взаимодействия с поверхностными лигандами [143, 230]. Например, ВВ из дендритных клеток несут на своей поверхности молекулу межклеточной адгезии 1, которая специфически связывается с функционально-ассоциированным антигеном 1 лимфоцитов [173]. А ВВ, на мембране которых присутствуют интегрины α4, β1 и L-селектин, полученные из клеток проангиогенных предшественников, взаимодействуют с клетками эндотелия реципиента [61].

Во-вторых, ВВ могут быть захвачены клатрин-зависимыми эндоцитарными механизмами: макропиноцитозом (эндоцитозом), кавеолин-опосредованным захватом, фагоцитозом и липидным рафт-опосредованным поглощением [165]. В последнее время появились доказательства, что внутривезикулярные компоненты и условия микроокружения также играют существенную роль при поглощении ВВ. Установлено, что высокое содержание липидных рафтов в мембране ВВ способствует их слиянию с клетками-реципиентами [149, 165], а в работе J.J. Gildea et al. [82] доказано, что липидные рафты ВВ участвуют в поглощении их клетками почки. Кроме того, другими исследователями продемонстрировано, что изменение рН окружающей среды существенно для поглощения ВВ. Так, уровень рН менее 5,0 во внеклеточной среде значительно усиливает слияние ВВ с мембранами клеток реципиентов [149, 182], причем кислое микроокружение способствует высвобождению из злокачественных опухолей ВВ с более высокой способностью к слиянию с клетками-мишенями [182]. Однако до сих пор неясно, существуют ли различные механизмы взаимодействия в одной и той же клетке, или они изменяются в зависимости от типа клеток реципиента и происхождения ВВ. В работе С. Yang et al. [246] показано, что поглощение ВВ из Т-лимфоцитов эндотелиальными клетками сетчатки человека регулируется не только температурой и количеством внеклеточного кальция, но и уровнем экспрессии рецептора липопротеидов низкой плотности.

Установлено, что специфическим свойством ВВ является способность защищать свое содержимое от деградации и облегчать его внутриклеточное поглощение [14, 132]. При этом показано, что ВВ могут переносить разнообразные компоненты: функциональные белки, биологически активные липиды, факторы транскрипции, мРНК, микроРНК, ДНК [61, 201, 218, 250]. Впоследствии было продемонстрировано, что белки и определенное количество микроРНК избирательно сортируются в ВВ [27, 42, 49, 61, 130, 161]. А ЭСК, необходимый для транспорта предшественников ВВ, как оказалось, связан с белком запрограммированной клеточной смерти (PDCD6IP или Alix) и белком опухолевой восприимчивости (TSG101), которые, в свою очередь, регулируют сортировку содержимого в экзосомах [17, 168, 194]. Позже в работе A. Iavello et al. [109] было показано, что Alix, как многофункциональный белок комплекса ЭСК, взаимодействует с белком Ago2, участвующим в биогенезе микроРНК, в то время как сам комплекс осуществляет перемещение микроРНК во внутреннем пространстве ВВ.

В ряде работ установлено, что количество микроРНК внутри ВВ играет ключевую роль в биологической активности этих ВВ, модулируя уровни белков целевых генов [85]. Было показано, что опухоль-супрессивные микроРНК, переносимые ВВ из стволовых клеток, ингибируют рост опухоли [30, 31, 74]. Кроме того, исследованиями ВВ из МСК продемонстрировано, что такие ВВ индуцируют восстановление функций почек после острого повреждения почек in vivo именно за счет переноса микроРНК [48]. С другой стороны, ВВ из мочевыводящих путей являются почечными ВВ, а их содержимое включает, в основном, рибосомальные и некодирующие РНК, а также микроРНК и небольшое количество ДНК и мРНК белков, специфичных для нефрона и всей мочеполовой системы [158, 218]. Отметим, что эти ВВ из мочи имеют профиль РНК, сопоставимый с профилем РНК почечной ткани, включая наличие 18S и 28S рРНК, которые практически не присутствуют в клеточных ВВ других органов [55, 56].

РОЛЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ В ПАТОФИЗИОЛОГИИ ПОЧЕК

Почка является жизненно важным органом, который, среди многих своих функций, обеспечивает фильтрацию крови. Причем аппарат клубочковой фильтрации предотвращает попадание ВВ, содержащихся в крови, в просвет почечного нефрона [187]. Таким образом, вполне вероятно, что ВВ, секретируемые во внеклеточные жидкости, играют роль в почечной сигнализации исключительно за счет стимуляции определенных типов клеток, которые сталкиваются с сосудистыми компартментами и клетками иммунной системы [234]. Таким образом, возможно, что внутрипеченочные ВВ, происходящие исключительно из мочевыводящих путей, могут играть важную роль в почечных процессах [187]. Недавно было впервые показано, что мВВ также участвуют во внутрипочечной коммуникации, при этом экзосомы из клеток собирательной трубки индуцируют экспрессию аквапорина-2 (AQP2) в клетках-реципиентах [221] (рис. 3).

 

Рис. 3. Роль везикул почек и мочевыделительной системы в норме и патологии. МНС — главный комплекс гистосовместимости; ВВ — внеклеточные везикулы; Na⁺ — ионы натрия; H₂O — функционально активная вода

 

Содержимое ВВ (мВВ), циркулирующих в моче, отражает их клеточное происхождение со своими специфическими белками [65], мРНК [158] и микроРНК [11] и, соответственно, отражает уровни экспрессии белков донорских клеток [79]. Кроме того, анализ таких мВВ показал, что они содержат белки-транспортеры, специфичные для эпителиоцитов почек и клеток урогенитального тракта [44, 70].

Установлено, что ВВ из клубочковых подоцитов содержат подоцин и подокаликсин [102], ВВ из клеток проксимальных канальцев содержат мегалин, кубилин, аминопептидазу и аквапорин-1 (AQP1) [8, 162], ВВ из клеток толстого восходящего канальца петли Генле несут антиген CD9, белок котранспортера (NKCC2) и белок Tamm Horsfall (THP) [198], а экзосомы, производные клеток собирательной трубки, содержат AQP2 и муцин-1 [7, 83]. Наконец, CD133, презентованный на мембране мВВ, также является маркером почечных клеток [66, 86]. Однако в работе R. Sabaratnam et al. [208] показано, что спектр белков в биоптате почек не всегда соответствует спектру белков экзосомальных мВВ.

Участие внеклеточных везикул в регуляции иммунного ответа

Известно, что анатомическое строение мочевыделительной системы приводит к ее постоянному контакту с бактериальными инфекциями [196] и сопровождается высокоэффективными защитными иммунными реакциями [99]. Недавно была выявлена новая важная роль ВВ [72]. Было показано, что ВВ, выпускаемые клетками эпителия канальцев почек, содержат большое количество белков естественного иммунитета, которые ингибируют рост агрессивных бактерий E. сoli, наиболее распространенных в моче человека [99]. Этот факт подчеркивает важность роли ВВ в иммунном механизме мочевыделительной системы. Указанный вывод согласуется с ранее опубликованными экспериментальными данными о защите от вирусной инфекции гриппа А при помощи ВВ, полученных из клеток респираторного эпителия почек собаки [123]. Кроме того, ВВ, содержащие тканевой фактор, могут поставлять дополнительные источники тканевых факторов, которые поддерживают гемостаз и свертывание крови. Таким образом, ВВ могут уменьшить опасность проникновения микроорганизмов в организм человека через клетки эпителия мочевыделительной системы, способствуя тем самым защите хозяина [127]. Следует также отметить работу, в которой продемонстрировано, что накопление антибактериальных белков в мВВ носит активный характер, сопровождаемый аэробным синтезом АТФ [34].

Последовательная регуляция клеточной коммуникации в канальцах и собирательной трубке нефрона

Коммуникативную роль мВВ можно определить как обратную регуляцию, влияющую на функцию клеток-реципиентов (рис. 3) [65]. Примечательно, что ВВ из клеток канальцев и подоцитов почки обильно экспрессируют антиген CD24, небольшую гликозилфосфатидилинозитол-якоревую молекулу [121], которая участвует в клеточной адгезии и коммуникации [65]. Кроме того, ВВ, по-видимому, специфически взаимодействуют с клетками-реципиентами через первичные реснички клеток эпителия [103]. Это наблюдение подтверждается данными билиарной модели, демонстрирующей, что сигналы экзосомы влияют на экспрессию микроРНК и пролиферацию клеток [152]. Отметим, что отдельные молекулы, присутствующие в моче, также могут влиять на поглощение ВВ клетками реципиента. Было высказано предположение, что в нижележащих сегментах нефрона слияние ВВ с клетками может быть ограничено THP, обильным полимерным белком, присутствующим в нормальной моче [235]. Действительно, ВВ могут обеспечить путь для проксимально-дистальной коммуникации, причем ВВ из подоцитов могут пройти через ренальную тубулу и передать информацию к клеткам эпителия собирательной трубки [192, 211]. Было продемонстрировано, что как дистальные канальцы, так и клетки собирательной трубки могут захватывать и хранить в MВТ ВВ, высвобождаемые клетками проксимальных канальцев [82]. Этот факт может объяснить, почему белки, обычно экспрессируемые клетками канальцев, были обнаружены в нисходящих канальцах нефрона, включая водоспецифичный AQP1 [8, 207] и аммонийобразующий фермент глутаминазу [243, 245].

Управление переносом ионов в канальцах нефрона при помощи внеклеточных везикул

ВВ может также посредничать сообщению между проксимальными и дистальными канальцами и собирательной трубкой для того, чтобы регулировать перемещение натрия. На самом деле, K.K. Jella et al. [113] показали, что ВВ из клеток проксимальных канальцев несут активный GAPDH, который снижает активность ионов Na⁺ за счет уменьшения вероятности открытия канала в дистальных канальцах и собирательных каналах (рис. 3, H). ВВ также может опосредовать перенос AQP2 между кортикальными клетками собирательной трубки, увеличивая экспрессию AQP2 и транспорт воды в клетках-реципиентах (рис. 3, B) [221]. В исследовании J.M. Street et al. [221] десмопрессин использовали для стимуляции увеличения содержания AQP2. Позже в работе W. Oosthuyzen et al. [176] было продемонстрировано, что десмопрессин как аналог вазопрессина избирательно стимулировал поглощение мВВ трубчатыми клетками, в то время как антагонист вазопрессина уменьшал поглощение введенных in vivo ВВ в почечной ткани. Это говорит о том, что коммуникация при помощи мВВ является физиологически регулируемым процессом. Кроме того, эти исследователи установили, что такой механизм может быть использован для доставки микроРНК в клетки собирательной трубки, что приводит к понижению регуляции целевых транскриптов. В отдельных работах показано, что ВВ обогащены ангиотензинпревращающим ферментом [83, 187], который может играть определенную роль в системе ренин – ангиотензин, участвуя тем самым в контроле водного баланса [169].

Влияние внеклеточных везикул на клетки эндотелия

ВВ могут оказывать различное воздействие на клетки эндотелия в зависимости от их происхождения и, следовательно, от их содержимого. В физиологических условиях спокойные клетки эндотелия секретируют ВВ, которые ингибируют активацию моноцитов и подавляют активацию эндотелиальных клеток [172], тогда как при воспалении ВВ, высвобождаемые клетками эндотелия, могут проявлять ангиогенные свойства, приводя к активации окружающих клеток [141]. Действительно, G. Lombardo et al. [141] продемонстрировали, что ИЛ-3 усиливает высвобождение ВВ и их проангиогенную активность, увеличивая содержание в них miR-126-3p и STAT5. Таким образом, горизонтальный перенос STAT5 в клетки эндотелия приводит к транскрипции циклина D1 и образованию клеточной трехмерной трубчатой структуры in vitro.

При патологических состояниях, особенно при нескольких воспалительных, ВВ могут способствовать изменению ангиогенеза. Установлено, что у пациентов с септическим шоком в сочетании с повышенным уровнем тромбоксана А₂ повышается содержание тромбоцитарных и эндотелиальных микрочастиц. Эти ВВ проявляли защитный эффект от гипотензии, вызванной сосудистой гипореактивностью [163]. Кроме того, ВВ, секретируемые из клеток-предшественников почечной артерии, полученных после радикальной нефрэктомии человека H.A. Mostefai et al. [163], усиливали миграцию эндотелиальных клеток при совместном культивировании с поврежденными клетками эндотелия. Таким образом, данное исследование показало целесообразность использования ВВ, полученных из проангиогенных клеток-предшественников пациента, для потенциальной терапевтической трансплантации аутологичных клеток при повреждении клеток эндотелия микроциркуляторного русла [179]. Кроме того, выяснили, что роль микроРНК при этом является решающей, а B.W. van Balkom et al. [233] еще раньше показали, что связь между клетками сосудистого эндотелия опосредуется ВВ, которые стимулируют ангиогенез, по крайней мере частично, через mir-214. В частности, ВВ, обогащенные этой микроРНК, способствовали миграции эндотелиальных клеток и ангиогенезу как in vitro, так и in vivo, предотвращая остановку клеточного цикла в клетках реципиентах [233]. Возможность использования подобного процесса для спасения стареющих клеток, имеющих пониженный уровень miR-214 при помощи переноса ВВ, полученных из клеток, продуцирующих miR-214, является перспективным методом применения ВВ для эндотелий-ассоциированных заболеваний.

Роль внеклеточных везикул в ангиогенезе

Как уже упоминалось выше, ВВ могут способствовать ангиогенезу за счет переноса проангиогенных факторов [142], включая факторы ММР-2 и ММР-9, которые поддерживают ухудшение матрицы и появление новообразований кровеносных сосудов [210, 224]. Как оказалось, ВВ, полученные из клеток проангиогенных предшественников, способствуют образованию проангиогенного фенотипа в клетках эндотелия микро- и макрососудов человека. Их эффект обусловлен переносом микроРНК, связанных с синтазой оксида азота и сигнальными путями PI3K/AKT [61]. Кроме того, на модели ишемии задней конечности мышей было показано, что ВВ клеток-предшественников эндотелия улучшают васкуляризацию и ограничивают ишемическое повреждение [198].

РОЛЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Известно, что раковые опухоли имеют сложное клеточное микроокружение, поэтому требуют активного обмена информацией с соседними клетками, в том числе с эндотелиальными клетками, фибробластами, перицитами и инфильтрирующими иммунными клетками [93]. Поэтому несколько типов клеток взаимодействуют синхронно, чтобы способствовать или подавлять прогрессирование ракового заболевания [129], следовательно ВВ необходимы для участия в этих коммуникациях [139, 257]. В настоящее время общепризнано, что опухолевые клетки высвобождают ВВ, которые способны организовывать опухолевую прогрессию, стимулируя основные физиологические процессы, такие как пролиферация, ангиогенез, образование метастазов и иммунный ответ [142, 157].

Роль и функции внеклеточных везикул при раке почки

Общепризнано, что основополагающим этапом для прогрессирования развития опухоли является ингибирование иммунного надзора. Установлено, что ВВ из опухолевых клеток почки индуцируют толерантность к неповрежденным клеткам различными механизмами [131]. Например, группа M.A.C. Pomato et al. недавно продемонстрировала, что ВВ, полученные из стволовых клеток рака почки, нарушают дифференцировку моноцитов и их превращение в дендритные клетки, сильно снижая при этом экспрессию антигенов HLA-DR и молекул адгезии [90, 191]. Эта их иммуномодулирующая роль коррелировала с наличием антигена HLA-G, который, как известно, подавляет иммунный ответ и способствует тем самым иммунной маскировке рака. Кроме того, другие исследователи установили, что опухолевые ВВ могут непосредственно способствовать увеличению количества Т-регуляторных клеток и гибель противоопухолевых CD8⁺ эффекторных Т-клеток. Опухолевые ВВ могут также индуцировать апоптоз в лимфоцитах, перенося лиганды для рецепторов смерти TRAIL и FasL [12, 109]. Наряду с этим, такие ВВ могут регулировать дифференцировку моноцитов, поддерживая миелоидный иммуносупрессивный фенотип этих клеток [59, 232], а также иммуносупрессивный фенотип макрофагов [62].

Помимо влияния на иммунные клетки, ВВ раковых клеток могут изменять функции невоспаленных клеток внутри опухолевой стромы и участвовать в дифференцировке фибробластов в миофибробласты, которые секретируют компоненты этих ВВ и могут тем самым поддерживать прогрессирование опухоли [93]. Исследователи S.S. Sidhu et al. [215] продемонстрировали, что ВВ, полученные из клеток карциномы легких, переносят трансмембранный гликопротеин (EMMPRIN) к фибробластам, индуцируя продукцию матриксных металлопротеиназ, способствуя инвазии опухоли и метастазированию. J. Webber et al. [240] показали, что опухолевые ВВ экспрессируют белок TGF-β1 на своей наружной поверхности и запускают активацию миофибробластов. Во время роста опухоли гипоксия способствует выживанию и размножению опухолевых клеток, воздействуя на строму [73] и индуцирует высвобождение неоваскулярных стимулирующих факторов [149]. Было также установлено, что гипоксическое микроокружение может влиять на состав опухолевых ВВ [22] и тем самым повышать их ангиогенетический и метастатический потенциал [181]. При этом показано, что гипоксия усиливает компартментизацию проангиогенных микроРНК, таких как miR-210 в Тевс [126], или miR-126 и miR-296 внутри ВВ, полученных из клеток, проангиогенных предшественников [40].

Еще раньше было установлено, что измененная васкуляризация, стимулируемая раковыми клетками, может зависеть от секреции не только известных ангиогенных цитокинов и факторов роста, но и от количества ВВ [111, 112, 217]. Впоследствии группа M.A. Pomato et al. показала, что ВВ, высвобождаемые стволовыми клетками рака почки, специфически проявляют проангиогенные свойства, что способствует васкуляризации опухоли [189]. Эти везикулы, как было установлено, обогащены проангиогенными мРНК, микроРНК и белками (MMP2/9, ангиопоэтином-1, эфрином А3, факторами FGF и VEGF), которые способствуют васкуляризации и метастазированию опухоли путем прайминга белков эндотелиальных клеток. Кроме того, уровни микроРНК (miR-200С, miR-92, miR-141) в опухолевых ВВ значительно выше у пациентов колоректального рака и РПЖ, связаны с инвазией опухоли и метастазов (miR-29а, miR-650, miR-151), а также напрямую связаны с раком почки (miR-19b, miR-29c, miR-151) [87]. Опухолевые ВВ могут также стимулировать миграцию эндотелиальных клеток и ангиогенез in vivo через мембранный сфингомиелин [125]. Кроме того, такие ВВ обогащены металлопротеиназой [224], а также имеют на своей поверхности CD147-индуктор металлопротеиназы [157], способствуя тем самым деградации белков внеклеточного матрикса, необходимых для ангиогенного процесса. Опухолевые ВВ также содержат и обеспечивают уровень мРНК и белков, проангиогенных модуляторов: сосудистый эндотелиальный фактор роста (СЭФР), фактор роста фибробластов (ФРФ), рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР-Р), интерлейкин 6 (ИЛ-6), интерлейкин 8 (ИЛ-8), ангиогенин и антиангиогенные факторы, такие как ТIМР-1 и ТIМР-2 [217]. Имея перечисленное содержимое, такие ВВ могут изменить судьбу здоровых клеток. В частности, ВВ, полученные из стволовых клеток рака почки, могут индуцировать проопухолевый фенотип в МСК-реципиентах, повышая экспрессию генов, связанных с ремоделированием матрикса (COL4A3), миграцией клеток (CXCR4, CXCR7), ростом опухоли (ИЛ-8, остеопонтин и миелопероксидаза) и с ангиогенезом. Важно отметить, что ВВ из стимулированных МСК имели повышенную способность индуцировать миграцию опухолевых клеток почек и образование сосудов in vitro, а также поддерживали развитие опухоли и васкуляризацию in vivo [138]. Этот вывод согласуется с данными других исследований, в которых показано, что ВВ могут способствовать местному и отдаленному распространению опухолевых клеток, способствуя тем самым миграции и инвазии опухоли. Было отмечено, что опухолевые ВВ способствуют рекрутированию различных типов клеток (фибробласты, эндотелиальные клетки, макрофаги и различные популяции клеток, полученных из костного мозга) в предметастатическую нишу [52, 184] и могут быть важными праймирующими факторами, которые помогают установить метастатические ниши, как правило, взаимодействуя со здоровыми клетками хозяина [149]. Сравнение ВВ из стволовых клеток рака почки с таковыми из объемной опухоли показало селективную картину микроРНК, которые могут способствовать местной инвазии и формированию предметастатической ниши за счет миграции фибробластов [212]. С другой стороны, высокие уровни экзосомальных микроРНК (miR-100-5p, miR-21-5p, miR-139-5p) увеличивали экспрессию металлопротеиназ 2, 9 и 13, экспрессию RANKL и миграцию фибробластов при трансфекции в фибробласты простаты [212].

Роль внеклеточных везикул при раке мочевого пузыря

Рак мочевого пузыря является частой злокачественной опухолью в развитых странах, уступая только раку почки среди злокачественных новообразований мочеполового тракта [170]. Несколько белков, связанных с раком мочевого пузыря, были обнаружены в мочевых пузырях пациентов и могут быть использованы в качестве диагностических и прогностических маркеров. Компоненты эпидермального фактора роста (ЭФР), α-субъединицы G-белка, белка ретиноевой кислоты 3 и резистина в большом количестве представлены в ВВ онкопациентов и потенциально вовлечены в опухолевую прогрессию [117, 218]. Опухоль-ассоциированный сигнальный кальций (TACSTD2) высоко экспрессирован в опухолевых ВВ больных раком мочевого пузыря и был предложен в качестве биомаркера [43]. Повтор ЭФР-подобного белка и дискоидин I, как доменсодержащий белок 3 (EDIL 3), лиганд интегрина, вовлеченный в ангиогенез, поставляется опухолевыми ВВ, полученными из клеток рака мочевого пузыря, и может способствовать прогрессированию рака [22]. Кроме того, в ВВ от больных раком мочевого пузыря обнаружены транскрипты для LASS2 и GALNT1, участвующих в прогрессии рака и метастазировании [186], а также микроРНК (miR-1224-3p, miR-15b, miR-135b), которые коррелировали с положительным диагнозом рака мочевого пузыря, включая соотношение miR-126/miR-152 [106]. Наконец, в работе Lin et al. [136] показано, что опухолевые ВВ от пациентов с высокодифференцированным раком мочевого пузыря экспрессируют два белка (α1-антитрипсин и гистон H2B1K), уровни которых хорошо коррелируют с градациями заболевания. Эти белки также участвуют в развитии опухоли и опухолевые ВВ с ними являются потенциальными биомаркерами, предсказывающими прогрессирование рака и риски рецидива. В более ранних экспериментах было выявлено, что опухолевые ВВ из культивированных клеток рака мочевого пузыря, инкубированные с опухолевыми клетками, активируют сигнальные пути, ведущие к ингибированию апоптоза клеток. Исследователи предположили, что усиление коммуникации может играть определенную роль в прогрессии опухоли [247].

Функции внеклеточных везикул при раке простаты

Рак предстательной железы (РПЖ) обычно возникает у мужчин старше 50–60 лет. У лиц молодого возраста он встречается редко. Исключение составляет саркома предстательной железы. Это редко встречающееся заболевание поражает молодых людей и даже встречается в детском и юношеском возрасте, что связывают с эмбриональной этиологией опухоли. Вероятность обнаружения РПЖ у мужчин в возрасте от 40 до 59 лет составляет 1,28 %, в возрасте от 60 до 79 лет — 15,6 %. В целом же около 3 % мужчин имеют шанс умереть от РПЖ.

В структуре онкологических заболеваний ряда развитых стран РПЖ занимает 2–3-е место, а в США — вышел на первое. В Великобритании — 2-е место среди всех онкозаболеваний у мужчин. РПЖ стоит на 2-м месте после меланомы кожи, значительно превосходя злокачественные заболевания легкого и желудка.

Рак предстательной железы является наиболее частым раком у мужчин [53]. Современные исследования указывают на полезность опухолевых ВВ для диагностики РПЖ, подчеркивая тот факт, что их анализ может представлять собой неинвазивный метод для оценки и мониторинга изменений РПЖ [155, 238]. Действительно, опухолевые ВВ, высвобождаемые клетками простаты, могут быть обнаружены в моче после их секреции через эякуляционные протоки простаты [35]. В исследованиях ряда ученых было изучено протеомное содержимое ВВ клеток простаты [145, 188, 256]. Были обнаружены повышенные уровни β1- и α1-интегрина в ВВ больных метастатическим РПЖ, по сравнению с пациентами с неметастатическим заболеванием или доброкачественной гиперплазией предстательной железы [24]. Антиген стволовых клеток простаты и простатспецифический мембранный антиген также были идентифицированы в опухолевых ВВ у пациентов с РПЖ [67, 174, 191]. P.J. Mitchell et al. [159] обнаружили маркеры РПЖ в ВВ из образцов простаты больных раком пациентов, что отличало их от здоровых мужчин. J.L. Welton et al. [241] показали, что возможно идентифицировать определенные белки ВВ из крови или мочи больных РПЖ, указывающие на неэффективность лечения и прогрессирующее заболевание, и отличать вновь диагностированный от прогрессирующего РПЖ. С помощью методов протеомного анализа эти исследователи обнаружили белки с известными ассоциациями с РПЖ, включая инсулиноподобные факторы роста, связывающие белки и кининоген-1, а также идентифицировали новые биомаркеры, которые были повышены во время прогрессирования болезни, в том числе афамин, кардиотрофин-1, легумайн и др. [241]. В дополнение к этому, J. Nilsson et al. продемонстрировали, что гены, связанные с простатой, могут быть успешно обнаружены в опухолевых ВВ, при этом были выявлены определенные изменения, влияющие на экспрессию генов TMPRSS2 и PCA-3 [64, 171]. Интересно, что в пионерском исследовании P. Motamedinia et al. [164] использовали ВВ-маркерный анализ для дифференцировки пациентов с биопсией доказанного РПЖ от пациентов с отрицательной биопсией предстательной железы (точность диагноза составила 81 %). В частности, наличие в ВВ простатспецифической мутации (TMPRSS2:ERG) между геном трансмембранной протеазы серина 2 (TMPRSS2) и геном, связанным с онкогеном (ERG), коррелировало с экспрессией гена в ткани после радикальной простатэктомии [164]. В настоящее время доступен клинически валидированный диагностический тест для РПЖ при помощи жидкостной биопсии, он позволяет различать низкоагрессивный и высокоагрессивный РПЖ на основе измерения уровней экспрессии белка PCA-3 и ERG в ВВ [155]. F. Royo et al. [206] показали, что ВВ от РПЖ проявляют различные физические и биологические свойства по сравнению с раком почки. Анализ транскриптома выявил снижение уровня кадгерина-3 типа 1 (CDH3) в ВВ от больных РПЖ, что отражает экспрессию этого кадгерина в опухоли предстательной железы и свидетельствует о его опухолесупрессивной активности в РПЖ [206].

В других исследованиях была проанализирована микроРНК, находящаяся в ВВ. Профили микроРНК в ВВ, полученные из раковых клеток и нормальных клеток эпителия простаты, позволили составить панель из 80 микроРНК в опухолевых ВВ [98]. C. Corcoran et al. [50] определили группу микроРНК как потенциальных биомаркеров метастазов РПЖ. В соответствии с результатами ранее опубликованной работы [98], экспрессия miR-34а была уменьшена в РПЖ, и авторы предположили, что ее уровень может быть использован для того, чтобы дифференцировать РПЖ от рака почки. Кроме того, BCL-2, известный антиапоптозный ген, был описан в качестве мишени для miR-34a [50]. Наконец, по содержимому ВВ из клеток РПЖ видно, что они играют существенную роль в прогрессировании и развитии рака. A.A. Babiker et al. [16] обнаружили, что такие ВВ несут протеинкиназу А, которая инактивирует каскад комплемента, защищая таким образом раковые клетки от комплемент-опосредованного лизиса клеток, а также клетки CD59, которые защищают раковые клетки РПЖ от разрушения [15].

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ В МЕЖКЛЕТОЧНОЙ КОММУНИКАЦИИ ПРИ НЕРАКОВЫХ ПОЧЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Помимо исследований роли ВВ в опухолях, значительный интерес у ученых вызывают функции ВВ при ряде других патологических состояний, таких как эндотелиальные дисфункции, изменения иммунной системы, фиброз и воспаление [76, 190]. В отдельных работах показано, что мВВ играют значимую роль в модуляции микроокружения и в усилении повреждения или восстановлении почек, в том числе на примере вовлечения ВВ крови в артериальную гипертензию, отторжение трансплантата и при ряде гломерулопатий [234].

Роль внеклеточных везикул при фиброзе почек

Показано, что ВВ, полученные из клеток нефрона, могут опосредовать передачу провоспалительных или профиброзных сигналов от клеток трубчатого эпителия, фибробластов и инфильтрирующих иммунных клеток, опосредуя общие пути, ведущие к почечному фиброзу [76, 175]. В 2013 г. F.T. Borges et al. [28] установили, что поврежденные эпителиальные клетки продуцируют повышенное количество ВВ с определенной генетической информацией, необходимой для активации фибробластов. На самом деле ВВ производные TЭК подвергаются in vitro воздействию гипоксического повреждения, что способствует пролиферации, экспрессии α-гладкомышечного актина, экспрессии F-актина и продукции коллагена I типа в фибробластах. Авторы этой работы выделили среди общего содержания компонентов в ВВ определенное количество мРНК и профиброзного фактора роста (TGF-β1), предполагая их ключевую роль в активации фибробластов и репаративных/регенерационных реакциях тканей. После повреждения клеток неполный репаративный ответ может привести к стойкому тубулоинтерстициальному воспалению и гипоксии тканей, что в итоге приводит к острому повреждению почек (ОПП) [28].

Обобщая данные этих исследований, можно сказать, что ВВ вовлечены в процесс заболевания почек через множественные эффекты, в зависимости от их клеточного происхождения [146]. Авторы обсуждаемых работ отмечают, что ВВ участвуют в физиологических процессах, прежде всего необходимых для гомеостаза почек, таких как клеточная коммуникация, иммунный ответ, транспорт ионов и ангиогенез (рис. 4).

 

Рис. 4. Схема взаимодействий внеклеточных везикул в качестве месенджеров между клетками в норме и при фиброзе почек. ТЭК — тубулярная эндотелиальная клетка; МСК — мезенхимальная стволовая клетка; ВВ — внеклеточная везикула; ГЭК — гломерулярная эндотелиальная клетка

 

Кроме того, мВВ могут быть также связаны с прогрессированием заболевания при раке или почечной недостаточности. Таким образом, ВВ могут способствовать дефектному ангиогенезу, воспалению и профиброзным процессам. Эти противоположные функции ВВ, как полезные, так и вредные, являются следствием окружающей среды, в которой производятся мВВ, а также целевых клеток-реципиентов, с которыми они взаимодействуют [76].

Внеклеточные везикулы при гломерулонефрите

Исследуя экспериментальный гломерулонефрит Thy1.1 у крыс, V. Cantaluppi et al. [40] продемонстрировали протективный эффект ВВ при индуцированном комплемент-опосредованном мезангиальном повреждении. При этом, после внутривенной инъекции ВВ, полученных из клеток-предшественников эндотелия, они локализуются внутри поврежденных клубочков и ингибируют активацию мезангиальных клеток, лейкоцитарную инфильтрацию и апоптоз. Кроме того, лечебное применение ВВ уменьшает протеинурию, повышает гемолитическую активность сывороточного комплемента, улучшает функцию почек, сохраняет подоцитозный маркер синаптоподин и антиген RECA-1 эндотелия. Благоприятное влияние ВВ на мезангиальные клетки было обусловлено ингибированием анти-Thy1.1 антител/комплемент-индуцированного апоптоза и отложением мезангиальных клеток C5b-9/C3 [40].

Внеклеточные везикулы в процессе регенерации тубулярных клеток эпителия

Некоторые повреждения почек характеризуются повреждением тубулярных клеток эндотелия (ТЭК) [28, 156]. Было показано, что ВВ может индуцировать восстановление ОПП за счет уменьшения кальций-индуцированного апоптоза [32]. В ряде исследований было продемонстрировано благотворное влияние на восстановление повреждений клеток почек ВВ, полученных из резидентных и экзогенных предшественников стволовых клеток почек, после токсического или ишемического ОПП [13, 38, 86, 96, 133, 209]. В эксперименте показано, что ВВ, полученные из клеток-предшественников эндотелия, предотвращали функциональное повреждение клеток почек на модели ишемии-реперфузии (ИРИ) у крыс [40]. Нарушение ИРИ является основной причиной ОПП у человека и связано с некрозом трубчатых клеток и их дисфункцией, а также потерей эндотелиальных клеток [20]. ВВ индуцируют функциональную и морфологическую защиту от ОПП за счет уменьшения инфильтрации лейкоцитов и апоптоза, а также за счет усиления пролиферации TEК. ВВ эндотелиальных клеток-предшественников также защищают от прогрессирования хронической болезни почек после ИРИ путем ингибирования сокращения сети капилляров, гломерулосклероза и тубуло-интерстициального фиброза [40]. Терапевтическая функция ВВ опосредована переносом микроРНК [48]. Действительно, заживляющие и защищающие эффекты ВВ были в основном связаны с переносом проангиогенных микроРНК (miR-126, miR-296) в гипоксические резидентные почечные клетки, что вызывало изменение их фенотипа. Отмечают, что снижение содержания микроРНК в ВВ происходит за счет снижения содержания РНК в проангиогенных предшественниках, либо за счет использования специфических антагонистов совместно с инактивирующими РНК, либо за счет обработки везикул повышенными концентрациями РНКаз [41]. Используя модель мышей с ишемическим ОПП, D. Burger et al. [37] в эксперименте обнаружили, что внутривенное введение ВВ, полученных из эндотелиальных колониеобразующих клеток пуповинной крови человека, клеток-предшественников эндотелия с высокой пролиферативной способностью и проангиогенным потенциалом, ослабляет повреждение почек, индуцируя повышение уровня креатинина плазмы, тубулярный некроз и апоптоз. Примечательно, что эти ВВ обогащены miR-486-5p и защищают мышей от ИРИ почки путем передачи микроРНК к ВВ через PTEN/Akt. Обнаруженные в эксперименте in vivo мощные защитные эффекты были связаны со снижением уровня PTEN в почках и активацией Akt. Эти эффекты блокировались ингибированием микроРНК, что позволяет предположить, что перенос miR-486–5p в ВВ играет важную роль в предотвращении клеточного апоптоза [236]. В частности, в работе A. Ranghino et al. [197] продемонстрировано, что ВВ, полученные из резидентной популяции МСК (Gl-МСК), оказывают регенеративный эффект на ОПП, индуцированной ИРИ у мышей [29, 54]. Эти ВВ улучшают функцию почек и уменьшают ишемическое повреждение через активацию пролиферации TEК. Такое их действие было опосредовано внутривезикулярными микроРНК, включая группу микроРНК, чьи предсказанные ранее целевые гены участвуют в различных биологических процессах, включая клеточную коммуникацию, метаболизм нуклеиновых кислот, регуляцию роста клеток, экспрессию генов и транспорт микроРНК. Эти микроРНК могут влиять на прорегенеративный процесс, инициируемый ВВ, полученными из Gl-МСК [197]. Результаты этой работы подтверждают предыдущие данные о том, что ВВ из почечных МСК участвуют в восстановлении ОПП после ИРИ, способствуя пролиферации перитонеальных капилляров и уменьшению перитубулярного микроваскулярного разрежения, действуя, по-видимому, в качестве носителей проангиогенных сигналов [46]. В ряде других работ показано, что терапевтический эффект при ОПП и других поражениях почек оказывают ВВ из МСК [32, 96], что было, в основном, связано с переносом содержащихся в них микроРНК [48]. Кроме того, ВВ, полученные из других стволовых клеток, например из стволовых клеток печени человека, также показали in vivo свою эффективность в восстановлении ОПП [97].

Внеклеточные везикулы при диабетической нефропатии

Всемирной организацией здравоохранения признано, что сахарный диабет является главным фактором развития хронической болезни почек в западном мире [203]. При этом почти у 40 % больных сахарным диабетом развивается диабетическая нефропатия, одно из самых тяжелых осложнений сахарного диабета [58]. Из данных работы Z.Z. Jiang et al. [115] следует, что ВВ, полученные из стволовых клеток кондиционированной среды мочи, могут предотвратить повреждение почек при диабете, способствуя выживанию клеток и сосудистой регенерации, предотвращая при этом апоптоз подоцитов. В эксперименте эти исследователи оценили влияние еженедельного введения в хвостовую вену крысам ВВ на модели Спрэга — Доули с индуцированным повреждением почек и ангиогенеза. Они обнаружили, что введение ВВ уменьшает объем мочи и микроальбуминурию и приводит к подавлению апоптоза подоцитов и ТЭК. Кроме того, ВВ подавляли сверхэкспрессию каспазы-3 и увеличивали пролиферацию гломерулярных клеток эндотелия. Более того, последующий анализ in vitro показал, что такие ВВ могут уменьшить апоптоз подоцитов, индуцированный повышенными концентрациями глюкозы. Авторы этой работы предположили, что TGF-β1, ангиогенин и морфогенетический белок-7 фактора роста костного мозга, переносимые ВВ, могут оказывать лечебные эффекты [115]. В эксперименте было показано, что мочевые ВВ, обогащенные микроРНК-451-5p, могут быть потенциальными биомаркерами диабетической нефропатии [161]. Это предположение было подтверждено в работе S. Eissa et al. [68], которые обнаружили, что экзосомальные miR-15b, miR-34a и miR-636 весьма важны в диагностике и патогенезе диабетической нефропатии.

Ранее было установлено [75], что патологические особенности ранней стадии диабетической нефропатии включают повреждение/потерю подоцитов и гипертрофию мезангиальных клеток, которые отличались от признаков обструктивной нефропатии [229]. Показано, что ВВ МСК и ВВ, производные костного мозга, способствуют сохранению мезангиальных клеток от гипергликемической продукции при коллаген/гипергликемическом повреждении [77]. Этот эффект достигается за счет горизонтального переноса функционального miR-222, что приводит к понижению регуляции STAT5 и снижению содержания miR-21, экспрессии TGF-β1 и синтеза матричного белка. В дальнейшем было показано, что некодируемые экзосомальные мРНК могут быть новыми биомаркерами для хронических нефропатий и при трансплантации почки [124, 183].

Резюмируя, отметим, что результаты этих исследований подчеркивают полезное защитное действие ВВ, полученных из клеток-предшественников и стволовых клеток при патологических процессах почек, путем модуляции фиброза, регенерации повреждений канальцев и клубочков, а также при ангиогенезе.

Внеклеточные везикулы и острая почечная недостаточность

A.C. Souza et al. [219] продемонстрировали, что мВВ вовлечены в мультиорганную дисфункцию, которая характеризует сепсис и септический шок. Повреждение микрососудов, вызванное сепсисом, индуцирует высвобождение ВВ в системный кровоток [180, 202]. L. Zafrani et al. [251] показали, что такие ВВ играют непосредственную роль в патогенезе сепсиса и связанной с ним острой почечной недостаточности, воздействуя как на коагуляционные, так и на воспалительные сигналы, модулируя количество действующих ВВ через кальпаиновую сигнализацию [1]. У септических пациентов с ОПП ВВ, секретируемые эндотелиальными предшественниками и вводимые внутривенно, могут достигать эндотелиальных клеток и ТЭК и оказывать прямое воздействие на гипоксические ТЭК [25].

Были опубликованы данные, что ВВ способствуют развитию ОПП, связанной с гемолитическим уремическим синдромом, индуцированным инфекцией агрессивной кишечной палочки. Также ВВ могут обеспечить путь избежать иммунной системы хозяина и перенести бактериальный токсин Shiga до органов-мишеней. Используя модель мыши, зараженной токсином Shiga E. coli, A.L. Ståhl et al. [220] показали, что токсин циркулирует внутри ВВ, связанных с клетками крови, которые достигают почки и переносятся в клубочковые и перитубулярные капиллярные эндотелиальные клетки. Затем такие ВВ проходят последовательно через базальную мембрану и поступают в подоциты и ТЭК. После эндоцитоза ВВ выбрасывают токсин и ингибируют синтез белка и приводят к гибели гломерулярных клеток эндотелия [220].

Внеклеточные везикулы как биомаркеры почечной недостаточности

ВВ секретируются клетками почек и урологического тракта и выбрасываются в мочу, принося важную информацию о патофизиологическом состоянии мочеполовой системы [167, 195]. Важно отметить, что ВВ можно легко и неинвазивно изолировать от пациентов, обеспечивая полезный исходный материал для многократных анализов для обнаружения биомаркеров. Существует несколько протоколов для выделения и изоляции ВВ [205], включая ультрацентрифугирование, фильтрацию, иммуноаффинные и микрофлюидные методы, высокоэффективную жидкостную хроматографию и осаждение [62, 80, 256]. Эти методы могут различаться по чистоте получаемых ВВ и по сложности протокола, а следовательно, и по их возможному клиническому применению. Чтобы избежать анализа мочевых загрязнений, таких как остаточные клетки или несвязанные белки, необходимы некоторые технические меры предосторожности, включая центрифугирование или фильтрацию, добавление ингибиторов протеаз и контроль кислотности среды [255, 257]. Преимуществом мВВ как биомаркера является возможность получения различных наборов информации. Действительно, мВВ могут быть проанализированы либо на содержание белка с помощью жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и иммуноферментного анализа, либо на экспрессию мРНК и микроРНК с помощью методов ПЦР [234, 238]. Выбранный анализ ВВ является выгодным в отношении общего исследования белка или мРНК в биожидкостях, поскольку он может улучшить чувствительность и точность обнаружения биомаркеров. Например, J. Skog et al. [217] выявили опухолевые ВВ, несущие мРНК со специфическим рецептором (VEGFvIII), позволяющим прогнозировать ответ на терапию при глиобластоме. Рядом исследователей было уставлено, что содержание белка в ВВ составляет около 3 % общего количества белков нормальной мочи [170, 195]. Таким образом, их протеом может лучше отражать клеточные процессы, связанные с патогенезом мочеполовой системы по сравнению с нативной мочой [195].

В оригинальном исследовании P. Tangtanatakul et al. [223] установлено, что уровень белка let-7a и РНК miR-21 в мочевых экзосомах может отражать степень разгара волчаночного нефрита при системной красной волчанке.

Следовательно, моча представляет собой идеальную жидкость для последующего анализа. Дальнейшее изучение мВВ может улучшить понимание биологических механизмов, которые возникают при раке или других патологиях почки и потенциально могут быть использованы в нефрологии для контроля лечения пациентов.

Внеклеточные везикулы и нефротический синдром почек

В отдельных работах показана связь повреждения подоцитов с изменениями опухолевых белков Вильма (WT-1) в мочевых экзосомах [118], а также у пациентов, страдающих хронической гломерулярной патологией [254]. Концентрация белка WT-1 была повышена у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа, отягощенных протеинурией, по сравнению с пациентами без протеинурии, и высокие уровни его коррелировали с функцией почек [118]. При этом снижение содержания WT-1 и других маркеров повреждения подоцитов у онкопациентов может свидетельствовать о ремиссии заболевания или как ответ на противоопухолевую терапию [255]. Недавно были опубликованы данные [148], что количество ВВ, полученных из подоцитов, выше у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа, независимо от других биомаркеров (альбуминурия, нефрит), и эти ВВ могут помочь обнаружить повреждение клубочков при неосложненном сахарном диабете 1-го типа. Кроме того, у пациентов с нефротическим синдромом были обнаружены повышенные количества ВВ, высвобождаемые микроворсинками клубочковых подоцитов, а также повышение уровня подокаликсина, маркера подоцитов [94].

В пробах ВВ, полученных от пациентов с хронической почечной недостаточностью, была обнаружена экспрессия более низких уровней мРНК CD2AP, другого маркера подоцитов, коррелирующего с почечной дисфункцией, уровнем протеинурии и стадией почечного фиброза [147]. В другом исследовании сообщалось об увеличении уровня остеопротегерина, рецептора семейства проапоптозных цитокинов и ɑ-ФНО, маркера воспаления у больных хронической почечной недостаточностью [23]. Изменение количества микроРНК также было зарегистрировано у больных сахарным диабетом 1-го типа с диабетической нефропатией или без нее [100]. ВВ, полученные от больных микроальбуминурией, были обогащены miR-130a и miR-145, гломерулярным маркером мезангиальных клеток, индуцированных TGF-β1. Такие ВВ характеризовались пониженным содержанием miR-155 и miR-424, которые, как известно, экспрессируются подоцитами и отрицательно модулируют сигнализацию ангиотензина II, факторов TGF-β1 и VEGF [19]. При анализе мочи взрослых и педиатрических пациентов с изолированной микроскопической гематурией было показано, что по уровню мВВ можно дифференцировать раннюю IgA-нефропатию и тонкую базальную мембранную нефропатию. Такие мВВ по-разному экспрессируют четыре биомаркера, причем α-1-антитрипсин и церулоплазмин маркируют группу IgA, в то время как аминопептидаза N и предшественник вазорина обогащены тонкой базальной мембраной при нефропатии [162].

Были обнаружены в мВВ несколько микроРНК, которые позволяли дифференцировать пациентов при волчаночном нефрите и нефропатии. Например, экспрессия miR-26a снижается в клубочках нефропатических больных и, наоборот, повышается в их мВВ, что свидетельствует о важности такого показателя в качестве предполагаемого биомаркера повреждения клубочков [110]. Аналогично, фактор ADAM10, который обычно экспрессируется в дифференцированных подоцитах, может быть найден у пациентов с волчаночным нефритом и IgA-нефропатическими заболеваниями, но не у здоровых людей [91].

Роль внеклеточных везикул при наследственных почечных патологиях

Известно, что поликистоз почек (ПКП) является наследственной болезнью почек, очень распространенной во всем мире [3, 105]. Основными причинами патологии являются мутации в генах, кодирующих белки, необходимые для функционирования первичных ресничек: полицистин-1 (ПЦ1), полицистин-2 (ПЦ2) и фиброцистин [249]. Эти и другие белки, включая цистин, фактор 6 АДФ-рибозилирования, плакины и комплемент, были экспрессированы в мВВ у таких пациентов [83, 187, 211]. Кроме того, в ВВ пациентов с ПКП и здоровых людей контрольной группы были обнаружены различные лектиновые профили [81]. У ВВ пациентов с ПКП обнаружена аномальная экспрессия цистина и фактора 6 АДФ-рибозилирования [103]. Недавно та же группа исследователей [101] наблюдала двукратное увеличение количества трансмембранного белка 2 (TMEM2) в мВВ у пациентов с ПКП1 по сравнению с контролем. Интересно, что соотношение ПЦ1/TMEM2 и ПЦ2/TMEM2 показало обратную корреляцию с объемом почки, обеспечивая таким образом неинвазивный и не требующий визуализации инструмент для мониторинга объема почки во время прогрессирования заболевания. Кроме того, функция TЭК во время прогрессирования аутосомно-доминантной поликистозной болезни почек может контролироваться через мВВ. G. Pocsfalvi et al. [188] сообщили, что половина из спектра протеинов, определенных в мВВ, дифференциально выражена среди пациентов с поликистозом и здоровых людей. Некоторые белки, такие как цитоскелет-регулирующие и Ca²⁺-связывающие белки, коррелируют с патогенетическим состоянием ТЭК у больных аутосомно-доминантной поликистозной болезнью почек. В частности, уровни белка S100-A8 и аннексина A1 (Ca²⁺-связывающие белки) уменьшаются после лечения антагонистом рецептора вазопрессина 2 [188].

Кроме того, растворимые котранспортеры nakcl и NaCl обычно экспрессируются в мВВ но, как было показано, отсутствуют в моче у пациентов с синдромом Бартера типа 1 и синдромом Гиттельмана. Этот факт указывает на то, что анализ мВВ может быть полезен в диагностике этих генетических нарушений [83, 116].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возросший за последние 2 года поток данных свидетельствует об существенной роли ВВ в физиологических процессах почек. Кроме того, новые открытия в патофизиологии ВВ подтверждают их значимость в регенерации почек и течении заболеваний мочеполовой системы, в том числе онкологических, а также при сепсисе и генетических заболеваниях, при повреждении клубочков и канальцев и во многих других. Таким образом, основываясь на данных этих работ, можно утверждать, что ВВ выполняют ряд сложных функций в патофизиологии почек и, по-видимому, отражают состояние здоровья почек, хотя еще многое предстоит выяснить. Всесторонний анализ мВВ, собранных в моче, несущих специфические для болезни маркеры, может помочь понять метаболические и патофизиологические механизмы почек, которые до сих пор все еще изучены недостаточно. Важно отметить, что мВВ, передаваемые с мочой, представляют собой весьма подходящий источник биомаркеров для улучшения диагностики, прогноза и клинического мониторинга заболеваний почек. Регистрация мВВ может позволить быстро и точно неинвазивным методом диагностировать заболевания почек, прежде чем произойдет значительное их повреждение. Наконец, методологический консенсус по выделению, количественному и качественному анализу мВВ мог бы разрешить имеющиеся в настоящее время в литературе разночтения относительно диагностической значимости ВВ [35].

Наконец, окончательное возможное терапевтическое применение включает использование мВВ в качестве носителя лекарств. Лекарственные препараты, также как отдельные белки или РНК, могут быть загружены в ВВ несколькими методами, такими как электропортация, коинкубация, трансфекция. После этой процедуры препараты могут быть доставлены в клетки-реципиенты для лечения рака и регенеративной терапии [18, 145].

Всестороннее осмысление данных в процитированных экспериментальных и обзорных работах подчеркивает многогранность функций ВВ и подтверждает растущий интерес биологов и медиков к дальнейшим исследованиям этой проблемы в нефрологии.

About the authors

Vladimir I. Vashchenko

S.M. Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: vladimir-vaschenko@yandex.ru

Dr. Biol. Sci., Senior Researcher, Centre of Blood and Tissues

Russian Federation, Saint Petersburg

Petr D. Shabanov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: pdshabanov@mail.ru

Head, Department of Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

References