За время пандемии новой коронавирусной инфекции (COVID-19), продолжающейся до сих пор, по состоянию на 11 августа 2021 г. зарегистрировано более 200 млн новых случаев инфицирования SARS-CoV-2 и более 4,3 млн смертей от этой болезни во всем мире, в том числе более 74 тыс. выявлено и почти 2 тыс. умерли в Волгоградской области [1]. Вызывающий это заболевание вирус является представителем коронавирусов — оболочечных одноцепочечных вирусов с большой РНК-позитивной полярностью, которые инфицируют людей, а также широкий круг животных [2—10]. Способы распространения нового возбудителя аналогичны таковым при других респираторных коронавирусах и включают аэрозольный механизм передачи (воздушно-капельный и воздушно-пылевой путь), также рассматриваются алиментарный и контактный механизм [7, 10]. При этом происходит передача как от симптомных больных, так и от бессимптомных носителей и пациентов в инкубационном периоде.
Инфицирование вирусом у мужчин выявляется несколько чаще, чем у женщин, а средний возраст госпитализированных пациентов в большинстве работ превышает 60 лет, при этом у женщин он выше, чем у мужчин [2, 7, 8, 11]. Наиболее характерной клинической формой при тяжелом течении болезни является двусторонняя интерстициальная пневмония, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) взрослых с диффузным альвеолярным поражением, а также различные варианты экстрапульмональных поражений, особенно миокардитов, васкулитов, тромбозов и тромбоэмболий [2, 3, 7, 8, 11—13].
Опасность заболевания заключается в том, что коморбидный фон, характерный для возрастных пациентов, является предиктором неблагоприятного прогноза. При этом артериальная гипертензия (АГ), заболевания сердца и сахарный диабет (СД) — наиболее часто отмечаемая сопутствующая патология, встречаемость подобных заболеваний несколько отличается у исследователей, но нередко составляет более 50% [2, 8, 11, 12, 14]. Кроме того, тромботические осложнения, особенно тромбозы сосудов микроциркуляторного русла малого круга кровообращения, тромбоэмболия легочной артерии и ее ветвей, играют значительную роль в развитии летальных исходов при COVID-19 даже с учетом назначения антикоагулянтной терапии большинству пациентов [2, 3, 6, 8, 11, 12, 15]. При этом иные локализации тромбозов наблюдаются значительно реже, хотя и встречаются при тяжелом течении заболевания с генерализацией процесса [6, 8, 11, 12, 15].
Цель исследования — провести оценку морфологических изменений и статистический анализ половозрастной структуры смертности при COVID-19 на основе исследования материалов патолого-анатомических вскрытий в Волгоградской области за 2020 г.
Материал и методы
Исследование проведено по данным анализа «Информационной системы работы Волгоградского областного патолого-анатомического бюро» (https://www.statmedcorp.ru) (далее — система), а также материалов патолого-анатомических вскрытий патолого-анатомических отделений ГБУЗ «Волгоградское областное патолого-анатомическое бюро». Поиск в системе осуществлялся во «взрослом разделе» по клиническому и патолого-анатомическим диагнозам с использованием кода U07.1 (COVID-19, вирус идентифицирован) за период с 01.01.20 по 31.12.20.
Выборка для исследования включала 11381 протокол патолого-анатомического вскрытия. Код МКБ-10 U07.1 зафиксирован в 1119 случаях, среди которых в выборке по аналогичному коду клинического диагноза выявлено 334 случая. Выгрузка данных была дополнена ручным поиском по протоколам вскрытий в системе — наличие/отсутствие тромбов по данным микроскопического исследования аутопсийного материала, а также заключительного патолого-анатомического диагноза. Последний аспект обусловлен особенностью формирования выгрузки по результатам поиска по коду диагноза — предоставление в столбце с указанным диагнозом в большом количестве случаев только основного заболевания.
При проведении посмертного патолого-анатомического исследования фиксацию материала, изготовление парафиновых блоков и микропрепаратов с окраской гематоксилином и эозином проводили по общепринятым методикам. Исследование микропрепаратов осуществляли на световом микроскопе Axio Lab. A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) с фотофиксацией цифровой фото/видеокамерой AxioCam 105 color (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия).
Выгрузки по результатам поиска обрабатывали и анализировали с помощью языка программирования R (R Core Team, 2021) и специализированной программы RStudio (RStudio Team, 2021), включая статистическую обработку — описательную статистику, в том числе абсолютные и относительные значения, минимальные и максимальные значения, медиану, моду, среднее, 1-й и 3-й квартили, межквартильный размах (IQR, англ. interquartile range), а также критерий хи-квадрат, дисперсионный анализ, логистическую регрессию.
Результаты и обсуждения
Среди 1119 умерших с подтвержденным диагнозом COVID-19 за календарный 2020 г. (далее — общая выборка COVID-19) обнаружено 334 пациента с прижизненным подтверждением диагноза клинико-лабораторными данными — с положительными результатами полимеразной цепной реакции (ПЦР) на РНК SARS-CoV-2, а также с данными компьютерной томографии (далее — выборка по клиническому диагнозу COVID-19). Половозрастные характеристики указанных выборок приведены в таблице, их распределение — на рис. 1.
Половозрастные характеристики выборок
| Характеристика | Показатель | Выборка по клиническому диагнозу COVID-19 | Общая выборка COVID-19 |
| Возраст, лет | Минимальный | 34 | 22 |
| 1-й квартиль | 62 | 57 | |
| Медиана | 71 | 65 | |
| Среднее | 70,5 | 65,4 | |
| 3-й квартиль | 81 | 74 | |
| Максимальный | 96 | 96 | |
| Пол | Женский | 47,13% | 47,15% |
| Мужской | 52,87% | 52,85% |
Рис. 1. Распределение умерших по возрасту с учетом пола в разных выборках.
а — распределение умерших в выборке по клиническому диагнозу COVID-19; б — распределение умерших в общей выборке COVID-19.
Fig. 1. The age distribution of deaths, taking into account gender in different samples.
В общей выборке COVID-19, которая составляет 9,8% от всех случаев смерти взрослых, по данным патолого-анатомических вскрытий, преобладали мужчины, средний возраст которых составил 64,9 года (IQR 57—73), средний возраст женщин — 66 лет (IQR 58—75).
При статистической обработке данных с помощью критерия хи-квадрат, а также дисперсионного анализа установлено, что отсутствуют достоверные различия возрастных характеристик между мужчинами и женщинами как внутри, так и между указанными выборками (p>0,05). Возраст умерших с клиническим диагнозом COVID-19, прижизненно подтвержденным результатами ПЦР, на момент смерти был в среднем выше, чем в общей выборке COVID-19 (p<0,05).
При анализе протоколов патолого-анатомических вскрытий выявлено наличие тромбов в сосудах микроциркуляторного русла легких, зафиксированное в окончательном патолого-анатомическом диагнозе в рубрике «основное заболевание»/«осложнения основного заболевания».
Полученный результат, согласно дисперсионному анализу, статистически значимо отличается от случайного распределения, а по данным логистической регрессии вероятность наличия тромбов указанной локализации в 3,17 раза (ДИ 2,3-4,4; p<0,05) выше, чем их отсутствия. Однако это значение не является отношением рисков исследуемой выборки с COVID-19 относительно умерших без нее.
При макроскопическом исследовании легкие у большинства пациентов были несколько увеличены в размерах, массой более 600 г каждое, плотной консистенции, с резко сниженной воздушностью и багрово-красным цветом поверхности. Висцеральная плевра обычно не вовлекалась в процесс, оставаясь гладкой и блестящей, реже описано ее потускнение и/или цианотичность. На разрезе паренхима легких чаще была темно-красного цвета с выраженным полнокровием, иногда пестрая с добавлением к описанной картине бурых и серых очагов.
При микроскопическом исследовании в легких обнаруживались обширные участки ателектазов, альвеолярный и интерстициальный отек, смешанная инфильтрация с преобладанием в большинстве случаев макрофагов и лимфоцитов, реже — нейтрофильных лейкоцитов. Во многих случаях в просветах альвеол выявлялись гиалиновые мембраны, которые чаще являлись признаком ОРДС при смерти пациента через 1—2 нед от начала заболевания, характеризующим острое альвеолярное повреждение и повышенную проницаемость капилляров альвеол при новой коронавирусной инфекции. При этом указанная картина может развиваться и в более ранние сроки болезни при быстром ее прогрессировании. Так, у умершего Б. в возрасте 89 лет с заключительным патолого-анатомическим диагнозом: «основное заболевание: коронавирусная инфекция, COVID-19, подтвержденная вирусологическим исследованием аутопсийного материала; конкурирующее заболевание: ишемическая болезнь сердца: мелкоочаговый кардиосклероз (с нарушениями ритма: пароксизмальная форма фибрилляции предсердий)». Смерть пациента наступила на 3-и сутки от даты госпитализации с характерными патогистологическими изменениями в ткани легких (рис. 2).
Рис. 2. Микропрепарат легкого умершего Б., 89 лет, с подтвержденной COVID-19.
Наличие гиалиновых мембран, фибрина, эритроцитов в просветах альвеол, ателектазы. Утолщение и слабовыраженная лимфоцитарная инфильтрация межальвеолярных перегородок. Явления полнокровия в сосудах микроциркуляторного русла, периваскулярные и внутриальвеолярные кровоизлияния диапедезного характера. Окраска гематоксилином и эозином, ×100.
Fig. 2. Lung microspecimen from an 89-year-old dead male patient with verified COVID-19.
В сосудах микроциркуляторного русла малого круга кровообращения полнокровие сочеталось с лейко- и эритростазами, наличием тромбов, а также формированием периваскулярных лимфоидных муфт — периваскулярных лимфогистиоцитарных инфильтратов. Кроме того, для умерших с COVID-19-ассоциированными пневмонией и ОРДС были характерны мультифокальные периваскулярные и внутриальвеолярные кровоизлияния диапедезного характера со скоплениями сидерофагов, повреждение эндотелия сосудов микроциркуляторного русла в виде набухания клеток и слущивания. Похожие изменения эндотелия могут сопутствовать процессам посмертного аутолиза, однако наличие тромбоза является одним из признаков прижизненного повреждения эндотелия.
При проведении патогистологического исследования аутопсийного материала в 77,54% случаев обнаружено наличие тромбов преимущественно в сосудах микроциркуляторного русла легких, реже — почках, сердце, печени и других органах. Во многих случаях тромбы обнаруживались лишь в единичных крупных сосудах, преимущественно в венах. При сроке заболевания более 2—3 нед отмечались явления организации, фиброзирования и пневмосклероза. Так, пациент С., 61 год, госпитализирован на 8-е сутки от начала клинических проявлений COVID-19 (повышение температуры тела до 38оС). Лечение включало антибиотики (левофлоксацин, азитромицин), антикоагулянты (ксарелто, гепарин), адаптогенные средства (трекрезан) и др. Смерть наступила на 21-е сутки, заключительный патолого-анатомический диагноз: «основное заболевание: коронавирусная инфекция, COVID-19, подтвержденная вирусологическим исследованием аутопсийного материала; сочетанное заболевание: сахарный диабет 2-го типа с диабетической нефропатией, постоянным перитонеальным диализом с 2016 г.». Патогистологические изменения в ткани легких соответствовали пролиферативной стадии альвеолярного поражения (рис. 3).
Рис. 3. Микропрепарат легкого умершего С., 61 год, с подтвержденной COVID-19.
В мелкой вене отмечается наличие смешанного тромба, в периваскулярных отделах и участках фиброза — лимфогистиоцитарная инфильтрация, множественные периваскулярные и внутриальвеолярные кровоизлияния диапедезного характера. Окраска гематоксилином и эозином, ×100.
Fig. 3. Lung microspecimen from a 61-year-old dead male patient with verified COVID-19.
Необходимо отметить, что при изучении микропрепаратов легких умерших, находившихся в инфекционных стационарах с клинической картиной COVID-19 и диагнозом «внебольничная пневмония» с отрицательными результатами ПЦР, касающимися выявления РНК SARS-CoV-2 в мазках из носовой полости и ротоглотки, а также на аутопсийном материале, были обнаружены морфологические изменения, схожие с описанными ранее у пациентов с подтвержденным наличием коронавируса. Они включали признаки острого альвеолярного повреждения, множественные периваскулярные и внутриальвеолярные кровоизлияния диапедезного характера, наличие смешанных тромбов в сосудах венозного типа, утолщение межальвеолярных перегородок, явления фиброза в случае смерти при сроке более 3 нед от начала заболевания, лимфоцитарную и лимфогистиоцитарную, преимущественно периваскулярную инфильтрацию. Так, у умершей М. в возрасте 82 лет с заключительным клиническим диагнозом: «коронавирусная инфекция, COVID-19, не подтвержденная прижизненным вирусологическим исследованием», смерть наступила на 15-е сутки от даты госпитализации. При макро- и микроскопическом исследовании аутопсийного материала наблюдалась характерная для COVID-19 картина (рис. 4).
Рис. 4. Микропрепарат легкого умершей М., 82 лет, коронавирусная инфекция COVID-19, вирус не идентифицирован.
Морфологические изменения включают наличие в мелкой вене смешанного тромба, лимфоцитарную инфильтрацию в стенке сосуда и утолщенных фиброзированных межальвеолярных перегородках, множественные периваскулярные и внутриальвеолярные кровоизлияния диапедезного характера. Окраска гематоксилином и эозином, ×100.
Fig. 4. Lung microspecimen from an 82-year-old dead female patient; coronavirus infection COVID-19; the virus has not been identified.
Учитывая эти факты, можно предположить наличие существенных индивидуальных различий во времени персистирования SARS-CoV-2 в клетках человеческого организма в зависимости от врожденных и приобретенных особенностей защитных систем, активированных при COVID-19, а также возможность элиминации вируса и фрагментов его РНК при продолжающемся синдроме системного воспалительного ответа (ССВО).
При микроскопическом исследовании миокарда умерших с заключительным патолого-анатомическим диагнозом COVID-19 были обнаружены разной степени выраженности дистрофические изменения кардиомиоцитов, их фрагментация, фокальные некрозы, в случаях с сопутствующей патологией — гипертрофия кардиомиоцитов. В строме наиболее часто отмечался умеренно, либо резко выраженный интерстициальный отек, резкое полнокровие сосудов с лейко-, эритростазами, а также интерстициальный и/или периваскулярный склероз.
При гистологическом исследовании ткани печени были отмечены как неспецифические изменения, сопровождающие критические поражения других жизненно важных органов и танатогенез в целом, так и характерные для конкретной коморбидной патологии. Наиболее часто встречались очаговая мелко-, средне-, крупнокапельная жировая и зернистая дистрофии, очаговый внутриклеточный холестаз, мелкоочаговые или даже обширные некрозы, в том числе центролобулярные, перипортальный фиброз, лейкоплазмоцитарная инфильтрация, полнокровие центральных вен и синусоидов разной степени выраженности, диапедез эритроцитов в пространстве Диссе. В случаях с сопутствующей патологией в виде цирроза печени или хронического гепатита было также отмечено наличие телец Маллори, жировой и гидропической дистрофии, грубого нарушения гистологической структуры за счет нодулярной перестройки паренхимы с дискомплексацией печеночных балок.
Патоморфология почек наиболее часто была представлена картиной резко выраженных дистрофических изменений эпителия канальцев вплоть до некроза. В клубочках в ряде случаев отмечены выраженное полнокровие, эритростазы и диапедезные кровоизлияния, в интерстиции — очаговый склероз, лимфоцитарная инфильтрация и отек.
При микроскопическом исследовании в головном мозге чаще отмечались перицеллюлярный и периваскулярный отек, полнокровие, реже — диапедезные кровоизлияния.
В других внутренних органах были описаны изменения преимущественно в эпителиальных клетках, подобные гидропической дистрофии, и нарушения со стороны сосудов микроциркуляторного русла в виде полнокровия и диапедезных периваскулярных кровоизлияний.
Высокая частота встречаемости тромбозов и эмболий в сосудах микро- и макроциркуляторного русла, прежде всего в легких, свидетельствует о значительном повреждении эндотелия за счет сочетания целого ряда патогенетических механизмов, лежащих в основе коагулопатии и действующих последовательно и параллельно. SARS-CoV-2 может оказывать прямое цитотоксическое воздействие на эндотелиоциты, опосредованно вызывать избыточную продукция провоспалительных цитокинов («цитокиновый шторм», ССВО), активировать систему комплемента, запускать процесс нетоза (англ. NETosis, Neutrophil Extracellular Traps; нейтрофильные внеклеточные ловушки), способствовать образованию аутоантител (волчаночного антикоагулянта).
SARS-CoV-2 повреждает эндотелий, проникая в клетки с участием ряда рецепторов и корецепторов (ACE2, TMPRSS2, CD147) [2—8, 10, 11, 14, 16—25]. По мере протекания инфекционного процесса количество ACE2 снижается, обеспечивая накопление ангиотензина-2, также способного приводить к дисфункции эндотелия [14, 25].
Провоспалительные цитокины (IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-α, IL-1β и др.) и острофазные белки (СРБ, ферритин и др.) способствуют дополнительному привлечению лейкоцитов и их активации, усугубляют дисфункцию эндотелия [3—8, 13—15, 17, 24—27]. Кроме того, некоторые из цитокинов (IL-1β и IL-18) могут приводить к пироптозу эндотелиоцитов [6, 15, 22, 24]. Указанные изменения дополнительно сдвигают равновесие в пользу гиперкоагуляции, а также активируют систему комплемента, тесно связанную с воспалением и тромбообразованием [2, 13, 15, 17, 20, 25]. Следует отметить, что существующие представления о «цитокиновом шторме», ССВО, сепсисе при COVID-19 требуют углубленного анализа и изучения, так как уровень IL-6, основного цитокина, ответственного за развитие такого состояния, при тяжелом течении болезни на порядок ниже, чем при ОРДС, вызванном другими возбудителями или неинфекционными причинами [14, 25, 28].
Сравнительно недавно открытый механизм нетоза, при котором активированные нейтрофилы «выбрасывают» хроматиновые ловушки, является еще одним звеном, объединяющим воспаление и коагуляцию [2, 3, 6, 13, 15, 16, 21, 25]. Такой процесс наблюдается при ревматических болезнях, многие из которых характеризуются образованием аутоантител. Среди исследований, посвященных COVID-19, имеются подтверждающие участие нетоза в воспалении, а также наличие волчаночного антикоагулянта, потенциально обладающего и провоспалительным, и прокоагулянтным действием [3, 8, 11, 13, 15, 16, 20].
Важную роль в поражении эндотелия играют гипоксия, оксидативный стресс и возможная в определенных клинических ситуациях реперфузия [3, 4, 14, 15, 20, 21, 29]. Острая гипоксия особенно значима в случаях коморбидной патологии при COVID-19, обеспечивая прокоагулянтное состояние и нарушая работу фибринолитической системы. В зависимости от анализируемой выборки полученные данные по наличию АГ, СД, ожирения и ишемической болезни сердца (ИБС) несколько отличались. АГ встречалась от 4 до 6%, СД — от 16,5 до 21,6%, ожирение — от 3,6 до 5,7%, ИБС — от 8,9 до 19,5%. Сравнительно низкую частоту обнаружения АГ и ИБС можно объяснить частым отнесением этих диагнозов в категорию сопутствующих или конкурирующих заболеваний, которые по техническим причинам редко попадали в выгрузку. По схожим данным в Санкт-Петербурге гипертоническая болезнь в сочетании с атеросклерозом встречалась более чем в 85% случаев, а СД — более чем в 35% [12]. Несколько реже авторы отметили наличие ожирения. По Москве результаты отличались: АГ встречалась у 59%, ХИБС— у 27,9%, СД — у 21,9%, а ожирение — у 19,3% умерших с COVID-19 [8]. Эти различия могут быть обусловлены не только указанной ранее методологией исследования, но и региональными особенностями, а также разными периодами сбора данных и размерами выборок.
Влияние SARS-CoV-2 на фибринолитическую систему выявляется с помощью измерения лабораторных показателей, среди которых наиболее значимо изменяется уровень D-димера. Согласно ретроспективным данным, у умерших он был в несколько раз выше, чем у выживших с COVID-19, причем показатели АЧТВ и ПТВ находились в пределах нормы [2, 3, 5—7, 11, 14, 15, 17, 21, 25, 26]. Антикоагулянтная терапия, по результатам нашего исследования, была назначена практически всем пациентам. Несмотря на это, отмечены случаи, когда клинико-лабораторные данные соответствовали критериям ДВС-синдрома, в целом не характерного для COVID-19. Так, в общей выборке COVID-19 (1119 случаев) только в 1 был указан ДВС-синдром, что составляет 0,09%; еще в 1 случае была указана коагулопатия с формированием микрососудистых тромбов. При этом, согласно данным по Москве, ДВС-синдром является отнюдь не редким, встречаясь в 34,7% аутопсий [8].
Часть из описанных механизмов обеспечивает преимущественно локальное влияние на эндотелий и клинически проявляется образованием тромбов в сосудах малого круга кровообращения, особенно микроциркуляторного русла легких. Другие механизмы могут потенциально способствовать генерализации процесса с развитием полиорганной недостаточности. При этом летальный исход чаще наблюдается в случаях с преимущественным поражением дыхательной системы, наличием острого альвеолярного повреждения без значительного вовлечения других органов и систем.
Заключение
Таким образом, обнаруженное в нашем исследовании наличие тромбов и тромбоэмболов преимущественно в сосудах микроциркуляторного русла и мелких венах легких, реже — в других органах у 77,54% умерших на фоне применяемой в стационарах антикоагулянтной терапии, а также результаты дисперсионного анализа и логистической регрессии, статистически значимо отличающиеся от случайного распределения, подтверждают мнение о склонности пациентов с тяжелым течением COVID-19 к манифестации нарушений в системе гемостаза. Стоит отметить, что такая особенность подтверждается при прямом сравнении пациентов с SARS-CoV-2 ассоциированного с ОРДС и больных со сходной клинической ситуацией, вызванной вирусом гриппа, у которых в 9 раз меньше микротромбов в капиллярах альвеол [19]. Кроме того, обнаруженные в исследовании периваскулярные и внутриальвеолярные диапедезные кровоизлияния в большинстве летальных случаев с COVID-19 имеют сложный, в том числе гипоксический генез, что свидетельствует о значительном повреждении эндотелия кровеносных сосудов, эндотелиальной дисфункции и выраженном нарушении сосудистой проницаемости.
Считается, что антикоагулянтная терапия достоверно снижает летальность у пациентов с тяжелым течением COVID-19 [6, 13—15, 20, 21, 26] и в большинстве методических рекомендаций по профилактике и лечению тромботических осложнений при COVID-19 указывается на необходимость применения при лечении средних и тяжелых форм прямых парентеральных антикоагулянтов — нефракционированного или низкомолекулярных гепаринов, которые наряду с влиянием на систему гемостаза обладают противовоспалительным действием [2, 5, 7, 13—15, 20, 21, 27, 29, 30]. Однако даже у больных, получавших антикоагулянты, тромботические осложнения все равно не являются редкостью. В связи с этим крайне актуальным остается вопрос о строгом и постоянном мониторинге состояния систем коагуляции у больных с COVID-19.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — А.В. Смирнов, Н.А. Дорофеев
Сбор и обработка материала — А.В. Смирнов, Н.А. Дорофеев, В.А. Толокольников, Т.А. Белик, М.М. Макарова
Статистическая обработка — А.В. Смирнов, Н.А. Дорофеев
Написание текста — А.В. Смирнов, Н.А. Дорофеев
Редактирование — В.В. Ермилов, О.А. Чернецкий, А.Э. Поплавский, В.С. Боташева, Р.П. Самусев, Л.И. Адександрова, Т.А. Белик, М.М. Макарова, Д.Ю. Гуров
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.