Профессиональная нейросенсорная тугоухость относится к заболеваниям, проблема диагностики и профилактики которых является одной из актуальных для стран со значительным сектором тяжелой промышленности. В России среди профессиональных заболеваний, вызванных физическими факторами условий труда, показатели профессиональной нейросенсорной тугоухости от воздействия шума среди работников различных отраслей экономики страны занимают лидирующее место и в период с 2003 по 2016 г. увеличились более чем в 2 раза — с 12,5% до 26,7% [1].
Индуцируемая шумом потеря слуха — это нейросенсорное повреждение, которое развивается при длительном (10—14 лет) воздействии шума с преимущественно высокой частотой — 4—6 kHz и уровнем шума, превышающим предельно допустимый (на территории РФ он составляет 80 дБА, СН 2.2.4/2.1.8.562-96 [2—4]). Это заболевание рассматривают как комплексное, связанное с взаимодействием факторов внешней среды и индивидуальных, в том числе генетической предрасположенности. Анализ данных литературы показал, что ассоциация с риском развития индуцируемой шумом потери слуха, или хронической нейросенсорной тугоухости (ХНТ), была установлена в разных популяциях для разных полиморфизмов в разных генах [5]. Основные полиморфизмы локализованы в генах антиоксидантных систем, калиевого гомеостаза и формирования межклеточных контактов, клеточного стресса, активации и регуляции фактора теплового шока, а также в генах передачи сигналов иммунной системы.
До настоящего времени исследований о распространенности в России полиморфизмов, ассоциированных с предрасположенностью к этому заболеванию, не проводилось.
В настоящей работе представлен анализ результатов, полученных при обследовании работников цеха АО «Красмаш», по выявлению точковых мутаций, предположительно связанных с риском ХНТ. Изучены однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), для которых, по данным литературы, установлена достоверная ассоциация с ХНТ в европейской популяции [5]: rs494024 в гене каталазы (САТ) из группы белков окислительного стресса; rs7598759 в гене нуклеолина (NCL), фосфопротеина — посредника антиапоптозного эффекта белков теплового шока; rs2227956 в гене белка теплового шока (HSPA1L); rs7095441 в гене протокадерина (PCDH15), одного из ключевых белков, вовлеченных в поддержание калиевого гомеостаза и формирование межклеточных контактов; rs7785846 в гене параоксоназы-2 (PON2), для которого установлена ассоциация с риском ХНТ в китайской популяции [5].
Полиморфизмы выявляли с помощью разработанного нами ранее биолюминесцентного способа выявления SNP [6, 7]. Способ был ранее успешно использован при генотипировании полиморфизмов, ассоциированных с нарушениями системы гемостаза, а также полиморфизмов гена MC1R, ассоциированных с угрозой возникновения меланомного рака кожи [8, 9].
Материал и методы
Образцы венозной крови работников цеха АО «Красмаш», работающих в цехе в условиях постоянного шума, превышающего предельно допустимый уровень, были предоставлены ФГБУ «Федеральный Сибирский научно-клинический центр ФМБА России». Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ ФСНКЦ ФМБА. При сборе материала получено информированное согласие от каждого участника.
Исследование слуха осуществляли речевой и тональной пороговой аудиометрией. Тональную пороговую аудиометрию проводили по стандартной методике в диапазоне частот 125—8000 Гц.
Были проанкетированы и аудиологически обследованы 443 работника АО «Красмаш», работающих в цехе в условиях шума не менее 1 года. Работники с хроническими заболеваниями органов слуха, травмой головы, перенесшие менингит и имеющие случаи нарушения слуха в семейном анамнезе, были исключены из исследования. Аллельный состав исследуемых генов был определен в оставшейся группе из 288 работников (исследуемая группа). Экспериментальная выборка включала 122 человека со снижением слуха: 90 — с начальными признаками воздействия шума на органы слуха, 30 — со снижением слуха I степени, 1 — со снижением слуха II степени и 1 — со снижением слуха III степени. Среди них 102 (83,61%) мужчины и 20 (16,39%) женщин. Медиана по возрасту составила 57 (51—61) лет. Медиана по стажу работы в условиях шума — 13,5 (7,8—35) года. Контрольную выборку составили 166 работников без снижения слуха, среди них 104 (62,65%) мужчины и 62 (37,35%) женщины. Медиана по возрасту составила 43 (36—52) года. Медиана по стажу работы в условиях шума — 10 (7—15) лет. При этом экспериментальная и контрольная группы различались по стажу, возрасту и полу (p<0,05). Подавляющее большинство в экспериментальной и контрольной группах составляли русские (96,7 и 96,4% соответственно).
ДНК из лейкоцитов, полученных с 500 мкл цельной крови, выделяли набором diaGene («Диа-М», Россия) согласно рекомендациям производителя.
В качестве контрольного положительного образца как необходимого элемента тест-системы созданы образцы ДНК — плазмиды со вставками исследуемых полиморфных участков с нормальной и альтернативной последовательностями по исследуемым точковым заменам. Нуклеотидные последовательности контрольных образцов ДНК были подтверждены секвенированием по Сэнгеру в ЦКП «Геномика» СО РАН (Россия). Генотип клинических образцов определяли по значению дискриминационного фактора Д относительно контрольных образцов.
Биолюминесцентный анализ полиморфизмов в образцах ДНК проводили, как описано ранее в [7—9]. Использованные в анализе репортерные биолюминесцентные белки — высокоочищенные мутантные варианты Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина с разными характеристиками биолюминесценции, а также их конъюгаты получали ранее описанными методами [10]. В работе использовали комплект праймеров для получения соответствующих исследуемых полиморфных фрагментов ДНК, а также для PEXT-реакций. Праймеры, использованные в работе, синтезированы фирмой «Биосан» (Россия).
Статистическая обработка результатов
Данные обрабатывали с использованием программного пакета Microsoft Excel для Windows 8.1, статистического программного обеспечения Statistica 12 («Statsoft», Россия) и Comprehensive Meta-Analysis («Biostat Inc», США). Статистическая обработка данных в исследовании случай—контроль проводилась с помощью программы Ген Эксперт (https://gen-exp.ru/calculator_or.php). U-тест Манна-Уитни использовали для сравнения количественных данных. Критерий χ2 Пирсона использовали для сравнения частот вариантов генов среди экспериментальной и контрольной групп, а также для сравнения характеристик в группе случаев среди носителей минорных аллелей и без них.
При расчетах учитывался уровень значимости p<0,05. Ассоциация между вариантами исследуемых генов и тугоухостью оценивалась по отношению шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ), значения p<0,05 считались значимыми.
Результаты и обсуждение
В период с 2016 по 2017 г. были проанкетированы и аудиологически обследованы работники AO «Красмаш», работающие в условиях постоянного шума, превышающего предельно допустимый уровень. В исследовании участвовали 288 работников (исследуемая группа), из них 122 со снижением слуха разной степени (экспериментальная группа) и 166 без снижения слуха (контрольная группа).
Анализ результатов генотипирования аллельных вариантов rs494024 (САТ), rs7598759 (NCL), rs2227956 (HSPA1L), rs7095441 (PCDH15) и rs7785846 (PON2) показал, что частоты встречаемости в исследуемой группе не отличаются и сопоставимы с таковыми для европейской популяции. Данные о частоте исследуемых минорных аллелей в европейской популяции взяты из представленных в базе NCBI результатов проекта HapMap. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp).
При анализе распределения генотипов исследуемых полиморфизмов между экспериментальной и контрольной группами не было выявлено статистически значимых различий. Также не выявлено статистически значимых ассоциаций риска ХНТ с носительством одновременно двух исследуемых полиморфизмов и более; с носительством исследуемых полиморфизмов и клиническими характеристиками (степень потери слуха, тиннитус).
Следует отметить, что выборки несколько различались по стажу работы сотрудников в условиях повышенного шума: 13,5 (7,8—35) года для экспериментальной и 10 (7—15) лет для контрольной группы. Считается, что профессиональная тугоухость развивается у работающих в шуме от 10 до 19 лет [4]. Следуя этому критерию и ужесточив его условия, из исследуемой группы выделили группу работников со стажем от 5 до 16 лет включительно. В ней оказалось 170 человек, из них 53 с нарушениями (группа случаев) и 117 без нарушений слуха (группа контроля), с достоверно не отличающейся медианой по стажу — 10 (7—12) и 10 (8—13) лет соответственно. В то же время достоверное различие между группами по возрасту сохранилось: Me=54 года (47—59) для первой и 42 (34—49,5) года для второй группы. В группу случаев вошли 10 женщин и 43 мужчины, а в группу контроля 47 женщин и 70 мужчин. Было обнаружено, что носители генотипа CT по полиморфизму rs 494024 в гене каталазы в группе случаев встречаются в 2 раза чаще, а генотип СС — достоверно реже (см. таблицу), что указывает на возможную связь данного полиморфизма с риском ХНТ.
Распределение частот генотипов изученных полиморфных вариантов среди работников со стажем от 5 до 16 лет: случай (53 человека) и контроль (117); n (%) — число носителей генотипа и их доля в группе
| SNP (ген) | Генотип | Случай n (%) | Контроль n (%) | ОШ (95%ДИ) | p |
| rs494024 (CAT) | CC | 11 (20,8) | 51 (43,6) | 0,34 (0,16—0,72) | 0,02 |
| CT | 31 (58,5) | 49 (41,9) | 1,96 (1,01—3,78) | ||
| TT | 11 (20,8) | 17 (14,5) | 1,54 (0,67—3,57) | ||
| rs7598759 (NCL) | CC | 12 (22,6) | 33 (28,2) | 0,75 (0,35—1,59) | 0,11 |
| CT | 36 (67,9) | 61 (52,1) | 1,94 (0,98—3,84) | ||
| TT | 6 (9,4) | 23 (19,7) | 0,43 (0,15—1,19) | ||
| rs7095441 (PCDH15) | CC | 19 (35,8) | 41 (35) | 1,04 (0,53—2,04) | 0,99 |
| CT | 27 (50,9) | 60 (51,3) | 0,99 (0,52—1,89) | ||
| TT | 7 (13,2) | 16 (13,7) | 0,96 (0,37—2,49) | ||
| rs2227956 (HSPA1L) | AA | 37 (69,8) | 83 (70,9) | 0,95 (0,47—1,93) | 0,93 |
| AG | 12 (22,6) | 27 (23,1) | 0,98 (0,45—2,12) | ||
| GG | 4 (7,5) | 7 (6) | 1.28 (0,36—4,59) | ||
| rs7785846 (PON2) | CC | 28 (52,8) | 56 (47,9) | 1,22 (0,64—2,34) | 0,32 |
| CT | 16 (30,2) | 48 (41) | 0,62 (0,31—1,24) | ||
| TT | 9 (17) | 13 (11,1) | 1,64 (0,65—4,11) |
Связь между наличием минорного аллеля T и проявлением эффекта потери слуха оценивали по доминантной модели наследования, объединив всех гетерозигот и гомозигот. Оказалось, что лица, имеющие данный аллель в гомозиготном и гетерозиготном состоянии почти в 3 раза чаще встречались в группе случаев (ОШ: 2,95; 95% ДИ: 1,38—6,29; p=0,004). Таким образом, можно предположить, что аллель T полиморфизма rs494024 в гене каталазы является предрасполагающим к развитию ХНТ. Известно, что окислительный стресс, возникающий в результате увеличения уровня активных форм кислорода (АФК) под воздействием шума, является преобладающим фактором, вызывающим потерю волосковых клеток кортиева органа улитки [11]. АФК повреждают митохондрии, вызывая высвобождение проапоптотических факторов, запускающих апоптоз. Если антиоксидантные системы неэффективно нейтрализуют АФК, происходит повреждение клеток. Каталаза является одним из наиболее активных ферментов антиоксидантной системы, и вариации в гене, кодирующем этот белок, могут приводить к изменению его каталитической активности. Взаимосвязь между вариациями CAT и развитием ХНТ была также показана недавно в исследовании Konings и соавт. [12].
Обнаружено также, что носители минорных аллелей одновременно в генах каталазы и нуклеолина в 2 раза чаще встречаются в группе случаев, чем в контрольной (ОШ: 2,19; 95% ДИ: 0,338—0,784, p=0,019).
Таким образом, ассоциации между наличием SNP rs7598759, rs2227956, rs7095441 и rs7785846 и развитием ХНТ нами не обнаружены. В подвыборке, включающей работников со стажем от 5 до 16 лет в условиях повышенного шума для SNP rs494024, а также его сочетания с rs7598759, обнаружена ассоциация с ХНТ. Поскольку эта подвыборка была сравнительно небольшой (170 человек), для изучения обнаруженных ассоциаций целесообразно проведение дополнительных исследований.
Авторы выражают благодарность сотрудникам центра оториноларингологии ФГБУЗ «Федеральный Сибирский научно-клинический центр» ФМБА России за предоставленные для исследования клинические образцы, а также результаты аудиологического обследования участников эксперимента.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, Правительства Красноярского края, Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности в рамках научного проекта №16-44-242097
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.