TENDÊNCIAS

Identificação de células tronco hematopoiéticas: citometria de fluxo convencional versus contador hematológico automatizado

Identification of the hematopoietic stem cells: conventional flow cytometry versus automated hematological counter

Helena Z. W. Grotto, José F. A. Noronha

Departamento de Patologia Clínica da Faculdade de Ciências Médicas/Unicamp

^{Endereço para correpondência} Endereço para correspondência Prof. Dra. Helena Zerlotti Wolf Grotto Faculdade de Ciência Médicas/Unicamp – Departamento de Patologia Clínica Caixa Postal 6111 – 13084-971 – Campinas-SP Email: grotto@fcm.unicamp.br

A célula tronco hematopoiética (stem cell) é definida como uma célula com grande capacidade de auto-renovação e potencial proliferativo, o que possibilita a sua diferenciação em células progenitoras de todas as linhagens sangüíneas e a reconstituição da população hematopoiética a partir de uma única célula.¹ Constituem de 0,05% a 0,1% da medula óssea humana e das células hematopoiéticas circulantes. O fenótipo da célula tronco hematopoiética inclui a expressão dos antígenos CD34 e CD90 (Thy-1) e ausência do CD38. O antígeno CD34 funciona como uma molécula de adesão e o Thy-1 parece estar envolvido na sinalização da transdução gênica.² Um subgrupo primitivo das stem cells, correspondente aos precursores das células CD34⁺, não expressa ou expressa quantidades muito baixas de CD34. Essas células podem ser selecionadas por possuírem marcador para CD133 e são parte predominante de um pool quiescente de células precursoras hematopoiética e mesenquimal. Essas células CD34^- podem se diferenciar em células CD34⁺, circulam no sangue periférico, voltam à medula (homing), aumentando a população de células progenitoras.³ Sugere-se que a expressão do CD34 varie dependendo do estado de ativação da stem cell.⁴ Outra característica da célula tronco é a presença da gp 170 de membrana (MDR-1), responsável pelo efluxo de agentes quimioterápicos e corantes vitais.⁵

Um aspecto interessante das células tronco da medula é a sua plasticidade, ou seja, a sua capacidade de se converter de um tipo a outro de célula, podendo se diferenciar em células não hematopoiéticas. Em artigo recente, Moore e Quesenberry⁶ discutem diversas questões a respeito da plasticidade das células tronco e usam o termo transdiferenciação como o processo em que uma célula de uma linhagem particular é convertida em célula de outra linhagem, implicando num movimento horizontal de uma linhagem a outra. O assunto é fascinante porque faria da infusão de células tronco uma ferramenta terapêutica promissora, capaz de reconstituir órgãos e reparar tecidos. Vários estudos têm indicado que stem cells da medula óssea têm o potencial de se diferenciar em células maduras do coração, fígado, rim, músculos e cérebro, por exemplo.^7-12 A despeito do entusiasmo que o assunto possa gerar, na revisão sobre o tema os autores enfatizam que há necessidade de outros estudos, onde resultados mais contundentes e precisos possam estabelecer as reais características das células envolvidas e dos processos em que participam.⁶

Mais consistente e já consagrado na prática médica como uma modalidade de tratamento efetivo é o transplante autólogo e alogênico de células progenitoras do sangue periférico (PBSC) em pacientes com doenças hematológicas, imunodeficiência, doenças genéticas e alguns tumores como o câncer de mama.^13-16 O procedimento consiste, através de quimioterapia e/ou radioterapia, na eliminação dos sistemas hematológico e imune do paciente e a reinfusão de células progenitoras coletadas do sangue periférico após estímulo com fator de crescimento. Tem como principal vantagem sobre o transplante autólogo de medula óssea promover uma rápida e durável reconstituição hematopoiética, além de reduzir o número de transfusões, episódios febris, uso de antibióticos e dias de internação.^17,18 Como a quantidade de células tronco hematopoiéticas na circulação é pequena, o transplante é precedido pelo processo de mobilização, que combina o uso de quimioterápicos com fatores de crescimento celulares. Desse modo, um número substancialmente maior de células pode ser obtido. Tem sido preconizado que o número total de células colhidas idealmente deve ser de, pelo menos, 5 x 10⁶ células/kg de peso para que haja uma boa recuperação medular pós-infusão.¹⁹ No entanto, alguns estudos mostram sucesso na "pega" do enxerto com um número menor de células mobilizadas,^{20, 21} enquanto pacientes que recebem menos de 1 a 2 x 10⁶ células/kg têm maior chance de apresentar um retardamento ou falha no transplante.²² São apontados vários fatores relacionados ao produto ou número de aféreses necessárias no processo de mobilização, como: tempo de diagnóstico, tipo e duração de quimioterapia prévia,²³ número de células CD 34⁺ no sangue periférico antes do procedimento,²⁴ dia de recuperação dos leucócitos após a administração de quimioterapia e fator de crescimento.²⁵ Mais recentemente, num estudo retrospectivo com 104 pacientes (62,5% deles com diagnóstico de câncer de mama e 25% com doenças hematológicas), mobilizados com quimioterapia e G-CSF recombinante, foi observado que o melhor fator preditivo para o número total de células CD34⁺ coletadas foi a concentração de células CD34⁺ no sangue periférico no dia da aférese (r² = 0,78, p< 0,001), seguido pelo número de células CD34⁺ no sangue periférico no dia anterior à aférese (r² = 0,55, p< 0,001).²⁶

Um aspecto importante no processo de mobilização é precisar o momento em que a aférese deve ser iniciada e, assim, evitar coletas improdutivas. Têm sido sugeridos alguns fatores preditivos para o início da coleta, como contagem de leucócitos circulantes,²⁷ a concentração de células CD34⁺ no dia da aférese,²⁸ a contagem absoluta de monócitos²⁹ e de plaquetas.³⁰

A determinação do número de células CD34⁺ na circulação tem sido considerada o melhor parâmetro para indicar o momento de se iniciar o procedimento de coleta de PBSC e o número de aféreses necessárias para que se atinja o número de células desejado a ser infundido. Normalmente, a identificação e quantificação de células CD34⁺ é feita através de citometria de fluxo, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CD34⁺.³¹ A citometria de fluxo, entretanto, é um método relativamente demorado e caro. Um método simples e rápido de identificar as PBSCs é proposto pelos contadores hematológicos de última geração, utilizados rotineiramente na realização dos hemogramas. A tecnologia envolvida consiste da utilização de um reagente capaz de separar as células maduras das imaturas, valendo-se da diferença constitucional da membrana das células de acordo com seu grau de maturidade. Leucócitos imaturos têm menos colesterol, mais fosfatidilcolina e menos esfingomielina na composição lipídica da membrana do que células maduras.³² Através de um reagente lisante ocorre o rompimento imediato da membrana dos eritrócitos e dos leucócitos maduros, enquanto a membrana dos leucócitos imaturos é também lesada, formando pequenos poros por onde surfactantes presentes no mesmo reagente penetram nas células e fixam o citoplasma antes que tenha sido dissolvido. Assim, essas células são fixadas com sua membrana e citoplasma retidos. Posteriormente, essas células são detectadas por radiofreqüência (RF), que fornece informações sobre o conteúdo celular, como tamanho do núcleo, densidade e presença de grânulos, e sinal de corrente direta (DC), que reflete o tamanho e volume das células. Essa células são quantificadas e identificadas como HPCs (hematopoietic progenitor cells).³³

Os primeiros trabalhos de avaliação das HPCs datam de 1995 e mostraram uma significativa correlação (r= 0,90, p<0,01) entre a porcentagem de células CD34⁺ identificadas pelo citômetro usual e as HPCs detectadas por equipamento hematológico em amostras de PBSC.³⁴ A quantificação de células CD34⁺ e HPC durante a mobilização de PBSC mostra boa correlação desses parâmetros no que diz respeito à sinalização para iniciar a aférese.³⁵ Pollard et al³⁶ conduziram um trabalho semelhante e estudaram a possibilidade da quantificação de HPC ser indicativa do momento de iniciar-se a aférese, em substituição à contagem de células CD34⁺ feita por citometria de fluxo. Através de seus resultados puderam concluir que a contagem de HPC inclui outras células além daquelas CD34⁺, provavelmente células mais maduras ou outra população progenitora. Observaram, ainda, que a quantificação de HPC obtida pelo equipamento hematológico como preditora do produto da aférese (número de células progenitoras coletada) poderia servir como teste de triagem: contagens de HPC inferiores a 10 x 10⁶/l deveriam ser confirmadas pela contagem de células CD34⁺, enquanto, se superiores a este valor, seriam favoráveis ao início da aférese. Uma segunda fonte de células precursoras seria o sangue de cordão umbilical. Contagens de HPC em sangue de cordão foram comparadas às contagens de células CD34⁺ e número de unidades formadoras de colônia (CFUs). De acordo com os valores de cut off estabelecidos para se iniciar a aférese, a porcentagem de falsos negativos do método automatizado para detecção das HPC foi de 70,4%, o que demonstra a limitação do método usando sangue de cordão.³⁷ Em estudo recente, foi relatada a determinação das HPCs em pacientes com linfoma e mieloma múltiplo. A correlação entre as contagens de HPC e células CD34⁺ foi boa, mesmo quando as contagens de HPC estavam baixas, o que sugere que a determinação de HPC pode ser usada como indicativa do momento que a aférese deve ser iniciada.³⁸

A nossa experiência com a utilização dos contadores hematológicos na determinação das HPC em sangue periférico de pacientes mobilizados é parcial, mas tem mostrado resultados interessantes. Acompanhamos até o momento 18 pacientes atendidos no Hemocentro/Unicamp e observamos o comportamento dessas células durante o processo: ausência durante o período mieloablativo pós- quimioterapia e aparecimento em quantidades crescentes durante a recuperação medular. Em dois pacientes que apresentaram falha no regime de mobilização, as HPC estiveram ausentes durante todo o seguimento. A ausência de HPC no material de hemograma poderia ser, então, um contra-indicativo da contagem de células CD34 pela citometria convencional, e, obviamente, do início da aférese.

A pergunta que se faz é a seguinte: é possível substituir a contagem de células CD 34⁺ pelo citômetro convencional pela contagem das HPCs realizada pelos contadores hematológicos automatizados? A nosso ver, neste momento, essa substituição seria precipitada. De acordo com os dados da literatura, podemos observar que os estudos realizados usando a determinação de células progenitoras pelos equipamentos de automação, embora não conclusivos, são promissores. Novos estudos devem ser conduzidos no sentido de se avaliar com precisão que tipo de célula está sendo realmente detectada, a sensibilidade e especificidade do método nos regimes de mobilização de PBSC e em outros procedimentos onde a determinação dessa célula seja importante. A possibilidade de utilizar esse método, simples e rápido, como auxiliar no monitoramento dos processos de mobilização de PBSC merece ser investigada.

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Recebido: 15/08/2003

Aceito: 25/08/2003

Avaliação: O tema abordado foi sugerido e avaliado pelo editor.

Conflito de interesse: não declarado

Datas de Publicação