Resumos

CIÊNCIAS AGRÁRIAS

Purificação do flavonóide trans-tilirosídeo do extrato metanólico das folhas de Gochnatia barrosii Cabrera (asteraceae) e avaliação da sua atividade nematicida

Purification of the flavonoid trans-tiliroside from the methanolic extract of Gochnatia barrosii Cabrera (Asteraceae) leaves and evaluation of the nematicidal activity

Helvécio Martins dos Santos Júnior^I; Aline Auxiliadora Tirelli^I; Hudson Wallace Pereira Carvalho^I; Denilson Ferreira Oliveira^II; Ney Robson Taironi do Prado^I; Vicente Paulo Campos^III

^IUniversidade Federal de Lavras/UFLA - Departamento de Química/DQI - Lavras, MG

^IIUniversidade Federal de Lavras/UFLA - Departamento de Química/DQI - Cx. P. 3037 - 37200-000 - Lavras, MG - denilson@dqi.ufla.br ^IIIUniversidade Federal de Lavras/UFLA - Departamento de Fitopatologia/DFP - Lavras, MG

RESUMO

O fracionamento do extrato metanólico das folhas de Gochnatia barrosii Cabrera (Asteraceae) resultou no isolamento do flavonol glicosídico trans-tilirosídeo [kaempferol 3-O- -D-(6''-O-E-p-cumaroil)-glicopiranosídeo], que nunca tinha sido identificado na referida espécie vegetal. Em teste realizado in vitro, observou-se que tal substância a 500 μg/mL, não tem efeito sobre a mortalidade de juvenis do segundo estágio do nematóide Meloidogyne exigua Goeldi.

Termos para indexação: Fitoquímico, flavonóide, nematóide.

ABSTRACT

Fractionation of the methanolic extract from Gochnatia barrosii Cabrera (Asteraceae) leaves resulted in the isolation of the flavonol glycoside trans-tiliroside [kaempferol 3-O- -D-(6''-O-E-p-coumaroyl)-glucopyranoside], which had never been found in such plant species. Such substance at 500 μg/mL caused no in vitro effect on the mortality of second-stage juveniles of the nematode Meloidogyne exigua Goeldi.

Index terms: Phytochemical, flavonoid, nematode.

INTRODUÇÃO

O café é uma das mais importantes culturas no Brasil, que é o responsável por cerca de 25% da produção mundial desta commodity. Muitos esforços têm sido feitos para aumentar a produtividade do setor, que é notadamente sensível aos problemas fitossanitários (Guerreiro Filho, 2006). Dentre eles, destaca-se o fitonematóide Meloidogyne exigua Goeldi, 1887, que é bastante disseminado nos cafezais brasileiros (Campos & Melles, 1987; Campos & Villain, 2005) e pode causar perdas de produtividade que chegam a 45% (Barbosa et al., 2004). Em amostras de solo e de raízes coletadas em cafezais de Minas Gerais foi detectada a presença desse nematóide em 45,4% das análises realizadas (Souza et al., 1999). Mais recentemente, Portz et al. (2006) observaram a presença de M. exigua em 36,5% das amostras coletadas em municípios do oeste do Paraná.

O controle de nematóides em cafeeiros é geralmente realizado com produtos químicos sintéticos que, além de apresentarem problemas de eficiência, acarretam a contaminação do ambiente e do solo com substâncias de elevada toxicidade e a destruição de organismos benéficos ao cafeeiro. Uma das possíveis alternativas para contornar tais problemas consiste no emprego de produtos naturais, que têm sido fontes de compostos para o manejo de pragas e doenças (Jespers & Waard, 1993; Isman, 2000; Oliveira et al., 2007a;Oliveira et al., 2008; Amaral et al., 2009). Dentre tais produtos podem ser citados os de origem vegetal (Roel et al., 2000), nos quais são encontradas diversas classes de substâncias com efeito fitonematicida (Datta & Saxena, 2001; San Martin & Magunacelaya, 2005; Pastor de Abram & Zelada Mariluz, 2006; Oliveira et al., 2007b; Begum et al., 2008; Thoden et al., 2009) e, dentre elas, os flavonóides (Begum et al., 2000; Wuyts et al., 2006; El Allagui et al., 2007; Jones et al., 2007; Adekunle & Aderogba, 2008; Shakil et al., 2008).

Apesar do grande potencial das espécies vegetais para a produção de substâncias de importância biológica para a nossa sociedade, várias delas ainda não foram submetidas a estudos para avaliar suas possibilidades de utilização no manejo de doenças de importância agronômica. Um exemplo é a espécie Gochnatia barrosii Cabrera, pertencente à família Asteraceae. Trata-se de um subarbusto que cresce em regiões de cerrado do Brasil e que, assim como várias outras espécies do gênero, é popularmente conhecida como cambará (Corrêa, 1984; Carvalho, 1992; Gomes et al., 2004). Com vistas a contribuir para o estudo de tal planta, buscou-se isolar e identificar flavonóides presentes na fração solúvel em metanol do extrato de G. barrosii, para que os mesmos pudessem ser submetidos à avaliação da atividade contra M. exigua.

MATERIAL E MÉTODOS

Procedimentos gerais

Utilizou-se metanol (MeOH) e ácido acético (AcOH) de grau UV-HPLC (Vetec, Brasil), enquanto os demais solventes foram de grau analítico. Empregou-se água (H₂O) ultrapura do tipo I, 18 Ωm (Milli-Q^®; Millipore). As análises em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) foram realizadas em aparelho Varian, com detector de UV-Vis, modelo ProStar 310, bomba ternária modelo ProStar 230, injetor manual; e aparelho Shimadzu CLASS-LC10 com detector de UV-Vis do tipo DAD modelo SPD-10Ai, equipado com três bombas modelo LC10A, injetor automático, modelo LC10 AutoSampler. Em ambos os casos, empregou-se coluna de fase reversa de sílica-C18 Phenomenex Luna^® (5mm, 250 x 4,6 mm). Os fracionamentos em CLAE foram feitos em aparelho Varian, equipado com duas bombas modelo PrepStar SD1, com detector de UV-Vis modelo ProStar 320 a 256 nm, injetor manual e coluna preparativa de fase reversa de sílica-C18 Phenomenex Luna^® (10 μm, 250 x 21,2 mm). As análises por ressonância magnética nuclear (RMN) foram realizadas em espectrômetro Varian Inova 500, operando a 500 MHz para hidrogênio (¹H) e 126 MHz para carbono treze (¹³C). Para tanto, dissolveram-se as amostras em dimetilsulfóxido hexadeuterado (DMSO-d₆), cujo sinal foi empregado como referência.

Material vegetal

Folhas de vários indivíduos de G. barrosii foram coletadas em campos rupestres da serra da Bocaina, localizada no sul do estado de Minas Gerais, em janeiro de 2006, e levadas ao Laboratório de Produtos Naturais, do Departamento de Química (DQI), da Universidade Federal de Lavras (UFLA), no qual teve início o processo de purificação. Uma amostra foi encaminhada ao Departamento de Biologia (DBI) da UFLA para identificação botânica e uma exsicata foi depositada no Herbário ESAL (ESAL 6448).

Preparo e fracionamento do extrato vegetal

As folhas foram secas a 40° C em estufa com ventilação e renovação de ar. Em seguida, o material vegetal (286 g) foi triturado em moinho e submetido a extração exaustiva com MeOH a frio (8 x 1000 mL). O extrato obtido foi seco sob pressão reduzida em evaporador rotatório e liofilizado, resultando em resíduo verde escuro (10,4 g). Esse foi sucessivamente lavado com hexano (Hex; 6 x 100 mL), acetato de etila (AcOEt; 6 x 100 mL) e MeOH (6 x 100 mL). Após remoção dos solventes sob pressão reduzida, obtiveram-se três frações: solúvel em Hex (2,3 g), em AcOEt (0,3 g) e em MeOH (6,7 g). Parte da fração solúvel em MeOH (5,0 g) foi fracionada por cromatografia em coluna de 4 x10 cm de resina Amberlite XAD-16 (Sigma), empregando-se H₂O (400 mL), H₂O/MeOH (80:20, 400 mL; 60:40, 400 mL; 40:60, 400 mL; 20:80, 400 mL), MeOH (400 mL) e AcOEt (400 mL) como fases móveis. As sete frações obtidas foram analisadas em CLAE (gradiente de H₂O/MeOH 95:5 a 0:100 em 40 minutos; 100% de MeOH de 40 a 55 minutos; fluxo de 1mL/min) e RMN ¹H. As frações semelhantes eluídas com H₂O/MeOH (40:60 e 20:80) e MeOH foram combinadas e concentradas, resultando na obtenção de um resíduo sólido (2,2 g), do qual se retirou aproximadamente metade (1,1 g) para ser eluída com H₂O/MeOH (50:50, 50 mL; 5:95, 50 mL) através de cartucho com 1,0 cm de diâmetro interno e 10 g de sílica-C18. Após análises das frações obtidas em CLAE (gradiente de H₂O/MeOH 95:5 a 0:100 em 40 minutos; 100% de MeOH de 40 a 55 minutos; fluxo de 1mL/min) e RMN ¹H, removeram-se os solventes em evaporador rotatório e liofilizadora e se submeteu aquela eluída com H₂O/MeOH (5:95; 120 mg) a fracionamento em CLAE por eluição isocrática com AcOH/H₂O/MeOH (0,5:54,5:45,0) a 16 mL/min. Obtiveram-se cinco frações, que foram analisadas em CLAE [eluição isocrática com AcOH/H₂O/MeOH (0,5:54,5:45,0) e fluxo de 1 mL/min]. Após a remoção dos solventes, uma alíquota de 1,0 mg da fração 2 (trans-tilirosídeo; tempo de retenção: 34,3 - 39,2 min; 20 mg) foi solubilizada em 2 mL de MeOH para ser inserida em espectrômetro de massas (EM) Agilent 1100 LC/MS Trap, através de uma interface do tipo electrospray ionization (ESI). Obtiveram-se espectros no modo positivo e negativo. Outra parte (10 mg) da fração 2 foi analisada por RMN de ¹H, ¹³C, distortionless enhancement by polarization transfer (DEPT 90° e 135°), gradient heteronuclear multiple quantum coherence (¹H-¹³C gHMQC; ¹J_C-H: correlações heteronucleares ¹H x ¹³C a curta distância), gradient heteronuclear multiple bond coherence (¹H-¹³C gHMBC; ^2,3J_C-H: correlações heteronucleares ¹H x ¹³C a longa distância) e gradient correlated spectroscopy (¹H-¹H gCOSY: correlações homonucleares ¹H x ¹H).

Teste in vitro de mortalidade

Seguindo a técnica de Hussey & Barker (1973), modificada por Boneti & Ferraz (1981), extraíram-se ovos das raízes de cafeeiros (Coffea arabica L.) infectados com M. exigua, para serem purificados pela técnica de Coolen & Herde (1972). A seguir, montaram-se câmaras de eclosão com os referidos ovos, o que permitiu obter juvenis de segundo estágio (J₂) com menos de dois dias após a eclosão, para serem empregados nos testes realizados conforme descrito por Amaral et al. (2003), com algumas modificações. Em cada cavidade de uma placa de polipropileno (PP) com 96 cavidades de 300 μL, foram colocados 20 μL de uma suspensão aquosa contendo entre 20 e 30 J₂ e 100 μL da amostra a ser avaliada. O trans-tilirosídeo (fração 2) foi solubilizado em solução aquosa de Tween 80 a 1% (g/mL) de forma a se obter uma concentração final de 500 μg/mL na cavidade da placa. O experimento foi conduzido em câmara climatizada do tipo B.O.D. (28±0,3° C, sem a presença de luz). Após 48 h, uma gota de solução aquosa de hidróxido de sódio a 1,0 M foi adicionada ao conteúdo de cada cavidade e contaram-se os nematóides. Aqueles retos e imóveis foram considerados mortos, enquanto os retorcidos ou móveis foram considerados vivos. Empregaram-se quatro repetições por tratamento, tendo Tween 80 a 1% (g/mL) e aldicarbe a 50 μg/mL (Temik^® 150, Rhône-Poulenc AgroBrasil Ltda) como controle negativo e positivo, respectivamente.

Análise estatística

Os dados dos testes foram convertidos em porcentagem e submetidos à análise de variância (ANAVA), por meio do software Sistema para Análise de Variância - SISVAR (Ferreira, 2000). As médias foram comparadas segundo o teste de Scott & Knott (1974), a 5% de significância.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O rendimento da produção de extrato foi de 3,6% em relação à massa seca das folhas de G. barrosii, o que está coerente com os rendimentos observados para outras espécies vegetais (Castilho & Kaplan, 2008). Ao se submeter o referido extrato à lavagem com solventes, obtiveram-se três frações distintas, dentre as quais optou-se pela utilização daquela solúvel em MeOH, na qual deveria estar a maioria dos flavonóides, segundo dados descritos para outras espécies vegetais (Gobbo-Neto & Lopes, 2008). Ao ser eluída através de coluna de Amberlite XAD, a fração solúvel em MeOH deu origem a sete frações, cujos cromatogramas obtidos em CLAE permitiram agrupar as frações eluídas em H₂O/MeOH (40:60, 20:80) e MeOH, por similaridade. Já as análises em RMN ¹H permitiram obter o perfil químico das frações eluídas em XAD, indicando a presença de açúcares nas três primeiras frações pela presença de sinais entre δ_H 5,1-2,4, característicos de hidrogênios de açúcares. As quatro últimas frações apresentavam sinais entre δ_H 8,2-6,0 e _H 5,6-3,0 sugerindo a presença de sistemas aromáticos conectados a açúcares (Markham & Geiger, 1994). Optou-se por dar continuidade ao trabalho com as três frações agrupadas [H₂O/MeOH (40:60, 20:80) e MeOH], pela presença de flavonóides sugerida nas análises em RMN ¹H. O fracionamento seguinte, em cartucho de sílica-C18, deu origem a duas novas frações, dentre as quais apenas aquela eluída H₂O/MeOH (5:95) apresentava flavonóides segundo análises por RMN ¹H. Logo, tal fração foi submetida a novo fracionamento em CLAE, o que resultou na obtenção da fração 2 pura, que se tratava de um pó amarelo amorfo. O espectro de RMN ¹H exibia sinais na região de hidrogênios aromáticos com padrão de substituição característico do flavonol kaempferol : δ_H 6,35 (1H; d, J=2,0 Hz; H-8), δ_H 6,12 (1H; d, J=2,0 Hz; H-6), δ_H 7,97 (2H; d, J=8,9 Hz; H-2' e H-6') e δ_H 6,84 (2H; d, J=8,9 Hz; H-3' e H-5') (Tabela 1) (Budzianowski & Skrzypczak, 1995).

O conjunto de sinais entre δ_H 3,16 e δ_H 5,43 foi atribuído aos hidrogênios ligados a átomos de carbono de açúcares, sendo aquele em δ_H 5,43 (H-1''), característico de hidrogênio anomérico. O sinal em δ_H 5,43 (1H; d, J=7,5 Hz; H-1''), com uma constante de acoplamento (7,5 Hz) característica de acoplamento trans-diaxial, juntamente com dados da literatura (Budzianowski & Skrzypczak, 1995), permitiram identificar o resíduo de açúcar como sendo a glicose na forma β-D-glicopiranosídica. Foi possível ainda evidenciar a presença de um resíduo do ácido p-cumárico através dos sinais característicos da dupla ligação em configuração trans, δ_H 7,33 (1H; d, J=16,0 Hz; H-7''') e δ_H 6,09 (1H; d, J=16,0 Hz; H-8'''), que ficou nítida pela elevada constante de acoplamento (Lencina et al., 2001). A presença do referido resíduo também foi percebida pelas absorções em δ_H 7,35 (2H; d, J=8,5 Hz; H-2''' e H-6''') e δ_H 6,77 (2H; d, J=8,5 Hz; H-3''' e H-5'''), que são características de hidrogênios do anel, em posição orto (Lencina et al., 2001). A ligação do ácido p-cumárico à glicose, formando uma função éster no carbono C-6'', foi confirmada através das correlações a três ligações (³J_C-H) observadas no mapa de contorno gHMBC entre o carbono C-9''' ( δ_c 166,2) e os hidrogênios H-6''A ( δ_H 4,27) e H-6''B ( δ_H 4,02), além das absorções do açúcar, especialmente do carbono C-5'' ( δ_c 74,1) e C-6'' ( δ_c 62,9), que se encontram, respectivamente, 3,1 ppm em campo mais alto e 1,9 ppm em campo mais baixo em relação ao kaempferol 3-O- β-D-glicopiranosídeo (Agrawall, 1989; Lencina et al., 2001). Já a correlação ³J_C-H entre o carbono C-3 ( δ_c 132,9) e o hidrogênio anomérico em δ_H 5,43 (H-1'') observada no gHMBC permitiu confirmar a ligação da unidade glicosídica ao carbono C-3 do kaempferol. Nos espectros de RMN ¹³C e DEPT (90° e 135°), observou-se a presença de vinte e seis sinais, sendo treze atribuídos à unidade flavonoídica, sete à unidade p-cumaroil e seis à unidade glicosídica (Tabela 1). Assim como no caso dos espectros de RMN de ¹H, havia a indicação da presença de um flavonol 5,7,4'-triidroxilado (kaempferol), com um açúcar ligado ao carbono C-3 (Lencina et al., 2001). Desse modo, análises detalhadas dos mapas de contorno dos experimentos gHMQC, gHMBC e gCOSY permitiram um refinamento da proposta inicial, o que resultou na atribuição da estrutura do flavonol glicosídico kaempferol 3-O-β-D-(6''-O-E-p-cumaroil)-glicopiranosídeo, também conhecido como trans-tilirosídeo (Figura 1), à substância isolada, em total conformidade com os dados obtidos por Budzianowski & Skrzypczak (1995) (Tabela 1).

A estrutura proposta através de experimentos de RMN (C₃₀H₂₆O₁₃, 594 u), foi confirmada por ESI-EM, que forneceu valores idênticos aos anteriormente relatados para essa substância: m/z 593 u [M - H]^- e m/z 617 u [M + Na]⁺ nos modos negativo e positivo, respectivamente (Lencina et al., 2001; Gobbo-Neto & Lopes, 2008).

Os flavonóides em geral apresentam considerável potencial para emprego no controle de pragas agrícolas. Para exemplificar é possível mencionar o trabalho de Onyilagha et al. (2004), que avaliaram o efeito de trinta e sete flavonóides na preferência alimentar e desenvolvimento larval de Mamestra configurata Walker (Lepidoptera: Noctuidae), observando atividade para diversos deles. Outro exemplo é o trabalho de Gallo et al. (2006), que avaliaram a bioatividade de extratos e compostos isolados de Vitex polygama Cham. (Verbenaceae) e Siphoneugena densiflora O. Berg (Myrtaceae), contra Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae), sendo que, dentre os compostos isolados, os flavonóides foram os que apresentaram melhor atividade inseticida. Shakil et al. (2008) relataram o isolamento e, identificação de dois novos flavonóides prenilados de Phyllanthus niruri L. (Phyllanthaceae), a popular quebra-pedra, com atividade nematicida contra Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood e Rotylenchulus reniformis (Linford & Oliveira), sendo que um dos compostos, 2-(4-hidroxifenil)-8-(3-metilbut-2-enil)-croman-4-ona, apresentou atividade contra R. reniformis semelhante ao nematicida carbofuran (CL₅₀ 3,3 e 3,1 g/mL, respectivamente). Beninger & Abou-Zaid (1997) verificaram que uma fração rica no trans-tilirosídeo obtida do extrato etanólico de Pinus banksiana Lamb. (Pinaceae) diminuiu o crescimento e aumentou a mortalidade de lagartas de segundo instar de Lymantria dispar L. (Lepidoptera: Lymantriidae), inseto causador de severas desfolhas de florestas localizadas no leste dos Estados Unidos e Canadá. Entretanto, no presente trabalho, o trans-tilirosídeo não se mostrou ativo no teste de mortalidade contra J₂ de M. exigua.

CONCLUSÕES

Das folhas de Gochnatia barrosii, espécie vegetal sobre a qual não há pesquisas quanto a sua composição química, isolou-se o flavonol glicosídico trans-tilirosídeo. No teste de mortalidade de J₂ do fitonematóide Meloidogyne exigua, nenhum efeito foi observado para tal substância.

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo suporte financeiro e concessão de bolsas.

(Recebido em 19 de setembro de 2008 e aprovado em 13 de julho de 2009)

Datas de Publicação

Histórico