Resumos

Concentração espermática na fecundação in vitro, com sêmen de touro da raça Guzerá

(Sperm concentration in the in vitro fertilization of Guzera bull semen)

L.S.A. Camargo¹, W.F.Sá¹, A.M.Ferreira¹, J.H.M. Viana², C.Freitas¹

¹Centro Nacional de Pesquisa em Gado de Leite. EMBRAPA

Rua Eugênio do Nascimento, 610. Dom Bosco

36038-330 - Juiz de Fora, MG

²Estudante de Doutorado – EV/UFMG

Recebido para publicação, após modificação, em 28 de agosto de 1999.

Apoio financeiro: FAPEMIG

camargo@cnpgl.embrapa.br

RESUMO

Estudou-se o efeito de diferentes concentrações espermáticas de sêmen de touro da raça Guzerá, durante a fecundação in vitro, sobre a taxa de clivagem embrionária. Ovócitos (n=356) obtidos de folículos de ovários oriundos de matadouro foram maturados in vitro e divididos aleatoriamente em quatro tratamentos visando a fecundação in vitro, de acordo com as concentrações espermáticas: TI (0,5´ 10⁶ espermatozóides/ml), TII (1,0´ 10⁶ espermatozóides/ml), TIII (2,0x10⁶ espermatozóides/ml) e TIV (4,0´ 10⁶ espermatozóides/ml). Utilizou-se sêmen congelado de um único touro da raça Guzerá, preparado pela técnica de swim up, seguida de centrifugação, antes de ser adicionado ao meio de fecundação in vitro. Ao término do período de fecundação, os ovócitos foram cultivados por três dias em TCM 199, com células da tuba uterina, nas mesmas condições da fecundação. Após o swim up, foram recuperados 10,21± 0,98% dos espermatozóides inicialmente colocados e a motilidade aumentou de 67,5± 2,5% para 81,25± 2,4%. A taxa de clivagem foi de 31,0% (n=71), 44,7% (n=85), 55,9% (n=127) e 52,0% (n=73) em TI, TII, TIII e TIV, respectivamente. O TI apresentou taxa de clivagem inferior aos tratamentos TIII e TIV (P<0,05). Os resultados sugerem que as melhores concentrações espermáticas para a fecundação in vitro estão a partir de 1,0´ 10⁶ espermatozóides/ml, sendo a concentração de 0,5´ 10⁶ espermatozóides/ml não recomendada para esse processo.

Palavras-chave: Bovino, Guzerá, concentração espermática, fecundação in vitro

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effect of different sperm concentrations of Guzera bull semen during in vitro fertilization on the cleavage rate. Oocytes (n=356) obtained from a slaughterhouse ovaries, were in vitro matured and randomly divided into four treatments for in vitro fertilization, according to sperm concentrations: TI (0.5´ 10⁶ spermatozoa/ml); TII (1.0´ 10⁶ spermatozoa/ml); TIII (2.0´ 10⁶ spermatozoa/ml) e TIV (4.0´ 10⁶ spermatozoa/ml). Frozen semen from one Guzera bull was used for in vitro fertilization. The live sperms were separated by swim up, washed once by centrifugation, and then placed in in vitro fertilization media. The in vitro fertilization was performed in tubes in media with heparin and incubated in 5% CO₂, at 39ºC for 20h. Thereafter, the oocytes were washed in Talp Hepes medium and cultured during three days in TCM 199 and bovine oviduct epithelial cells, at the same conditions of in vitro fertilization. From the spermatozoa used at the beginning of swim up, 10.21± 0.98% were recovered, and the motility increased from 67.5± 2.5% to 81.25± 2.4%. The cleavage rates were 31,0% (n=71), 44.7% (n=85), 55.9% (n=127), and 52.0% (n=73) for TI, TII, TIII, and TIV, respectively. The cleavage rate in TI was lower than in TIII and TIV (P<0.05). These results suggest that the best spermatic concentration during the in vitro fertilization, with Guzera bull semen, is above 1.0´ 10⁶ spermatozoa/ml. Sperm concentration of 0.5´ 10⁶ spermatozoa/ml was not efficient in this trial.

Keywords: Bovine, Guzera, cleavage rate, in vitro fertilization, sperm concentration

INTRODUÇÃO

A eficiência da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos pode ser melhorada através do conhecimento dos fatores e eventos que afetam a fecundação in vitro (FIV). Apesar da técnica de PIV estar evoluindo com rapidez nos últimos anos, a grande totalidade dos trabalhos sobre FIV em bovinos refere-se a animais de origem européia, com poucos relatos em raças zebuínas.

Existe diferença entre touros e entre raças quanto à fertilidade em protocolos de PIV (Brackett & Keskintepe, 1996; Sumantri et al.,1996). A concentração espermática, em diversos estudos realizados com sêmen de touros europeus varia de 0,5 a 5´ 10⁶ espermatozóides/ml (Long et al., 1994; Parrish et al., 1995), porém, não existem trabalhos sobre o assunto para touros da raça Guzerá.

Quando ovócitos são incubados com um grande número de espermatozóides, eles também são expostos a enzimas hidrolíticas que podem ter efeito deletérico sobre o potencial de desenvolvimento do zigoto (Rehman et al., 1994). A utilização de concentrações inadequadas de espermatozóides aumenta a taxa de polispermia, prejudicando o desenvolvimento embrionário (Long et al., 1994). Assim, torna-se importante utilizar concentrações espermáticas adequadas, de maneira a evitar que o excesso de células espermáticas no meio de fecundação prejudique o desenvolvimento do zigoto, mas que proporcionem alta taxa de clivagem.

Sabendo-se das diferenças entre as raças zebuínas e européias quanto à fisiologia reprodutiva (Randel, 1984; Galina et al., 1995), e da importância da raça Guzerá na pecuária nacional como raça adaptada às condições brasileiras e como fonte de cruzamento com raças européias, torna-se aconselhável estudar aspectos que envolvam a FIV, que visem o uso futuro da PIV como método de multiplicação de genótipos superiores para animais dessa raça.

O objetivo do trabalho foi o de estudar o efeito de diferentes concentrações espermáticas sobre a taxa de clivagem e o efeito do swim up como método de seleção espermática para a FIV com sêmen de touros da raça Guzerá.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados ovócitos aspirados de ovários de fêmeas bovinas mestiças, coletados em matadouro. Os ovários foram transportados em frascos com solução fisiológica (0,9% NaCl) contendo antibiótico (0,1g/litro de sulfato de estreptomicina), à temperatura entre 30 e 34ºC, em um período de até três horas após a coleta.

Folículos com diâmetro superior a 1,5mm foram puncionados e o conteúdo depositado em um cálice cônico contendo meio Talp Helpes (Bavister et al., 1983), previamente aquecido a 37ºC. Após um período de decantação de 10 minutos, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi lavado com meio Talp Helpes e depositado em uma placa de Petri, mantida em placa aquecedora a 38ºC, onde ocorreu a manipulação dos ovócitos. Os ovócitos foram lavados três vezes em meio Talp Helpes e, em seguida, avaliados morfologicamente. Ovócitos contendo células do "cumulus oophorus" compacto, com no mínimo três camadas (complexo ovócito-"cumulus", COC) e citoplasma homogêneo foram classificados e selecionados como viáveis.

Um total de 356 ovócitos (quatro repetições) foram maturados in vitro em placas de Petri contendo 3ml de meio TCM 199 acrescido de 10% de soro de vaca em cio (SVC) e 20m g/ml de FSH, conforme Costa (1994), mantidos por 24 horas em estufa incubadora à temperatura de 39ºC, com 5% de CO₂, 95% de ar atmosférico e 95% de umidade.

Após a maturação in vitro, os ovócitos foram divididos aleatoriamente em quatro tratamentos visando à fecundação in vitro (FIV), de acordo com as concentrações espermáticas: TI (0,5´ 10⁶ espermatozóides/ml), TII (1,0´ 10⁶ espermato-zóides/ml), TIII (2,0´ 10⁶ espermatozóides/ml) e TIV (4,0´ 10⁶ espermatozóides/ml).

O sêmen utilizado foi escolhido entre touros da raça Guzerá, cuja fertilidade foi avaliada por meio de testes de indução da reação acrossômica (RA), sendo selecionado o touro que apresentou melhor taxa de RA e, conseqüentemente, maior fertilidade (Blottner et al., 1990). Procurou-se, assim, evitar a utilização de sêmen de touro com baixa fertilidade que pudesse influenciar indiretamente a taxa de clivagem.

O sêmen foi descongelado e preparado pela técnica de swim up, seguida de uma centrifugação (10min a 200G), antes de ser adicionado ao meio de fecundação in vitro. Antes do swim up e após a centrifugação, foram realizadas contagem dos espermatozóides e avaliação da motilidade espermática para verificar o efeito desse tratamento sobre essas características do sêmen.

A fecundação foi realizada em tubos (3ml) contendo entre 0,5 e 1,0ml de meio "Fert Talp", adicionado de heparina (50 mg/ml), em estufa incubadora com 5% de CO₂ a 39ºC durante 20 horas. Ao término do período de fecundação, os ovócitos foram lavados em meio Talp Helpes e co-cultivados por três dias em TCM 199, com células da tuba uterina, nas mesmas condições da fecundação. A taxa de clivagem (número de zigotos com duas ou mais células) foi observada 48 e 72 horas após início da fecundação in vitro.

Os resultados são apresentados em forma de média e erro-padrão (EP). A concentração e motilidade espermáticas antes e após o swim up foram avaliadas por análise de variância, e as diferenças entre médias comparadas pelo teste t. A análise estatística utilizada para avaliar a taxa de clivagem foi o teste exato de Fisher (Gomes, 1987).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após o swim up, recuperaram-se 10,21± 0,98% dos espermatozóides colocados inicialmente. O efeito do swim up sobre a motilidade e recuperação espermática é apresentada na Tab. 1.

A taxa de recuperação espermática encontrada neste experimento com sêmen de touro da raça Guzerá, após o swim up, é semelhante ao citado por Parrish et al. (1995), que encontraram taxa de 9%, quando utilizaram sêmen de touros de raças européias. Isto sugere que o swim up possui capacidade para recuperação dos espermatozóides do sêmen de touros Guzerá semelhante à recuperação para raças européias. Quando comparado com outras técnicas, o swim up recupera número menor de espermatozóides, entretanto, resulta em maiores taxas de penetração espermática em ovócitos e de clivagem dos zigotos após a FIV, possivelmente devido à maior capacidade desse método em recuperar espermatozóides com maior potencial de fecundação (Parrish et al., 1995).

Houve aumento na taxa de motilidade espermática quando se utilizou o swim up para a seleção de espermatozóides de touros Guzerá (Tab. 1). Esses resultados são semelhantes aos de Parrish et al. (1984) que encontraram aumento da taxa de motilidade em diversas amostras de sêmen bovino, entre 75 a 80% após swim up. Reyes et al. (1996) também observaram aumento na motilidade espermática, subindo de 70% para 90% na motilidade de sêmen bovino. Entretanto, Coelho et al. (1995) não encontraram melhora em sêmen avaliado após swim up, sendo que 7 dos 10 touros testados apresentaram motilidade reduzida. Essa diferença de resultado talvez possa ser explicada pelo fato desses autores terem utilizado touros de quatro raças diferentes. Como o efeito da raça não foi avaliado, pode haver variações na taxa de motilidade após swim up entre as raças testadas.

A centrifugação do sêmen após o swim up é outro fator que pode interferir na motilidade espermática, podendo reduzi-la em 20% (Shamsuddin et al., 1993). Segundo Coelho et al. (1995), a motilidade espermática pode ter sido comprometida pelo número de centrifugações (duas) realizadas. Apesar de ter-se utilizado apenas uma centrifugação do sêmen, não foi observada redução da motilidade quando comparada com a do pós-descongelamento do sêmen, fato este mencionado por Parrish et al. (1984), Cantarino et al. (1993) e Reyes et al. (1996). Existem também variações individuais entre touros quanto ao comportamento do sêmen frente ao swim up. Cantarino et al. (1993) observaram diferenças na motilidade entre três touros de uma mesma raça (72, 69 e 52% após swim up). Apesar da variação individual encontrada, os autores observaram aumento da motilidade em todos os animais testados.

Devido à baixa taxa de motilidade espermática que se verifica após o descongelamento de sêmen bovino (Parrish et al., 1995), e por ser um requisito essencial para a interação in vitro de espermatozóide/ovócito (Wolf et al., 1984), faz-se necessária a utilização de um método de seleção de espermatozóides que resulte em maior motilidade para a FIV. Observa-se, pelos resultados obtidos neste experimento, que o swim up pode ser utilizado para esse fim em sêmen de touros da raça Guzerá.

As taxas de clivagem observadas após a FIV, com quatro concentrações espermáticas diferentes, encontram-se na Tab. 2.

Observa-se que a menor concentração avaliada (0,5´10⁶ espermatozóides/ml) apresentou taxa de clivagem inferior (P<0,05), quando comparada com as outras concentrações. Entretanto, a partir da concentração de 1,0´10⁶ espermatozóides/ml as taxas de clivagem foram semelhantes (P>0,05). Da mesma maneira, Watanabe et al. (1996) não observaram diferença quando utilizaram 2,0 ou 4,0´10⁶ espermatozóides/ml na FIV com sêmen de touros da raça Nelore. Isso mostra que a taxa de clivagem em ovócitos fertilizados com sêmen de touro da raça Guzerá depende da concentração espermática durante a FIV até um determinado limite, de maneira semelhante ao encontrado em outros experimentos com sêmen bovino (Saeki et al., 1995). Esses autores encontraram melhor taxa de fecundação com a concentração de 1,0´10⁶ espermatozóides/ml, quando comparadas com concentrações menores e maiores. Heeres et al. (1996) observaram melhor taxa de clivagem e produção de embriões utilizando concentração de 0,5´10⁶ espermatozóides/ml em relação a concentrações menores. Entretanto, os resultados de Kurtu et al. (1996) mostraram não haver diferença entre as concentrações espermáticas acima de 0,5´10⁶ espermatozóides/ml, ao utilizarem um único touro. Essas diferenças observadas entre experimentos podem ser devidas à variação de fertilidade entre os touros utilizados. Segundo Bracket & Keskintepe (1996), ajustes na concentração espermática para cada touro utilizado durante a FIV podem melhorar a produção de embriões, reduzindo a variabilidade dos resultados. Ainda, de acordo com esses pesquisadores, touros de alta fertilidade podem ter espermatozóides com maior capacidade de fecundar in vitro, mesmo em baixas concentrações espermáticas.

O efeito da raça pode estar presente quando se estudam os vários aspectos da FIV. Sumantri et al. (1996) observaram diferenças na FIV quando utilizaram touros de raças diferentes. Segundo Chenoweth (1993) e Galina et al. (1995), touros zebus possuem características reprodutivas diferentes de touros europeus, com tendência a apresentarem menor fertilidade em campo. Entretanto, não foram encontrados estudos que comprovassem essa menor fertilidade na FIV. A presença de espermatozóides acessórios durante a fertilização in vivo pode produzir efeitos estimulatórios no desenvolvimento do zigoto (Nadir et al., 1993). Esse efeito poderia ser mais acentuado em sêmen de touros zebu, necessitando maior número de espermatozóides acessórios, refletindo na exigência de maior concentração espermática durante a FIV.

O aumento da concentração espermática acima de um ideal pode também afetar indiretamente a taxa de clivagem e a produção de embriões. O efeito da exposição de ovócitos e zigotos a metabólitos e produtos degenerativos liberados por espermatozóides mortos pode ser mais acentuado quando se utilizam concentrações espermáticas elevadas durante a FIV (Saeki et al., 1995), uma vez que possibilitará maior liberação de agentes tóxicos aos zigotos.

A utilização de alta concentração espermática durante a FIV acima de um determinado limite pode também provocar aumento de fecundações anormais, principalmente polispermia, sem alterar as fecundações monospermáticas (First & Parrish, 1987; Long et al., 1994). A polispermia tem sido a principal origem de poliploidias em embriões bovinos fecundados in vitro (Lechniak, 1996). É necessário, portanto, o ajuste da concentração espermática visando uma taxa de fecundação e clivagem alta, porém sem aumentar a incidência de polispermia. Apesar deste experimento não ter aferido a taxa de polispermia nas concentrações estudadas, seria prudente utilizar na FIV com sêmen de touros Guzerá a menor concentração que produziu resultados de clivagem semelhantes às das concentrações maiores (1,0´10⁶ espermatozói-des/ml) a fim de se produzir menor taxa de polispermia com boa taxa de clivagem.

CONCLUSÃO

A utilização do swim up como método de separar e selecionar espermatozóides em sêmen de touro da raça Guzerá é um procedimento viável. Melhores taxas de clivagem após a fecundação in vitro foram obtidas com concentrações espermáticas a partir de 1,0´10⁶ espermatozói-des/ml. Provavelmente o ajuste na concentração espermática pode suprimir possíveis deficiências do sêmen de touros zebus durante a fecundação in vitro.

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