Desbalanço redox: NADPH oxidase como um alvo terapêutico no manejo cardiovascular

Rabêlo, Luiza A.; Souza, Valéria Nunes de; Fonseca, Lucas José Sá da; Sampaio, Walkyria O.

doi:10.1590/S0066-782X2010000500018

Resumos

Vários estudos destacam as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ERONs) como importantes contribuintes na patogênese de numerosas doenças cardiovasculares, incluindo hipertensão, aterosclerose e falência cardíaca. Tais espécies são moléculas altamente bioativas e com vida curta derivadas, principalmente, da redução do oxigênio molecular. O complexo enzimático da NADPH oxidase é a maior fonte dessas espécies reativas na vasculatura. Sob condições fisiológicas, a formação e eliminação destas substâncias aparecem balanceadas na parede vascular. Durante o desbalanço redox, entretanto, há um aumento na atividade da NADPH oxidase e predomínio de agentes pró-oxidantes, superando a capacidade de defesa orgânica antioxidante. Além disso, tal hiperatividade enzimática reduz a biodisponibilidade do óxido nítrico, crucial para a vasodilatação e a manutenção da função vascular normal. Apesar de a NADPH oxidase relacionar-se diretamente à disfunção endotelial, foi primeiramente descrita por sua expressão em fagócitos, onde sua atividade determina a eficácia dos mecanismos de defesa orgânica contra patógenos. As sutis diferenças existentes entre as unidades estruturais das NADPH oxidases, a depender do tipo celular que as expressa, podem ter implicações terapêuticas, permitindo a inibição seletiva do desequilíbrio redox induzido pela NADPH oxidase, sem comprometer, entretanto, sua participação nas vias fisiológicas de sinalização celular que garantem a proteção contra microorganismos.

NADPH oxidase; inibidores da NADPH oxidase; espécies de oxigênio reativas; espécie de nitrogênio reativas; oxirredução; doenças cardiovasculares

Varios estudios destacan las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ERON) como importantes contribuyentes en la patogénesis de numerosas enfermedades cardiovasculares, incluyendo hipertensión, aterosclerosis y falla cardíaca. Tales especies son moléculas altamente bioactivas y con vida corta derivadas, principalmente, de la reducción del oxígeno molecular. El complejo enzimático de la NADPH oxidasa es la mayor fuente de esas especies reactivas en la vasculatura. En condiciones fisiológicas, la formación y eliminación de esas sustancias aparecen balanceadas en la pared vascular. Durante el desbalance redox, sin embargo, hay un aumento en la actividad de la NADPH oxidasa y predominio de agentes prooxidantes, superando la capacidad de defensa orgánica antioxidante. Además de ello, tal hiperactividad enzimática reduce la biodisponibilidad del óxido nítrico, crucial para la vasodilatación y el mantenimiento de la función vascular normal. A pesar de que la NADPH oxidasa se relaciona directamente con la disfunción endotelial, fue primeramente descrita por su expresión en fagocitos, en los que su actividad enzimática determina la eficacia de los mecanismos de defensa orgánica contra patógenos. Las diferencias sutiles entre las unidades estructurales de las NADPH oxidasas, dependiendo del tipo celular que las expresa, pueden tener implicaciones terapéuticas, permitiendo la inhibición selectiva del desequilibrio redox inducido por la NADPH oxidasa, sin comprometer, con todo, su participación en las vías fisiológicas de señalización celular que garantizan la protección contra microorganismos.

NADPH oxidasa; inhibidores de la NADPH oxidasa; especies de oxígeno reactivas; especies de nitrógeno reactivas; óxido-reducción; enfermedades cardiovasculares

Several studies refer to reactive oxygen and nitrogen species (RONS) as important agents in the pathogenesis of a number of heart diseases, including high blood pressure, arteriosclerosis and heart failure. Such species are highly bioactive molecules and a short life due chiefly to reduction of molecular oxygen. The enzyme complex of NADPH oxidase is the main source of these reactive species in vascular system. Under physiological conditions, formation and elimination of these substances seem balanced in vascular wall. During redox Unbalance, nonetheless, there is increase in NADPH oxidase activity and predominance of pro-oxidizing agents, surpassing the anti-oxidant capacity of the organism self-defense. Besides this, such enzyme hyperactivity reduces the bioavailability of nitric oxide, capital for vasodilation and maintenance of normal vascular function. In spite of NADPH oxidase being directly connected to the endothelial dysfunction, it was firstly described as for its expression in phagocytes, where its activity determines efficiency of organism defense mechanisms against pathogens. Slight differences between structural units of NADPH oxidases, depending on the type of cell which expresses it, may create therapeutic implications, allowing to selectively inhibiting redox unbalance triggered by NADPH oxidase, without compromising, however, its participation in physiological cellular signaling which make sure protection against micro-organisms.

NADPH oxidase; NADPH oxidase inhibitors; reactive oxygen species; reactive nitrogen species; oxidation-reduction; cardiovascular diseases

ARTIGO DE REVISÃO

Desbalanço redox: NADPH oxidase como um alvo terapêutico no manejo cardiovascular

Luiza A. Rabêlo^{I, II}; Valéria Nunes de Souza^I; Lucas José Sá da Fonseca^I; Walkyria O. Sampaio^{II, II}

^IUniversidade Federal de Alagoas, Maceió, AL - Brasil

^IIUniversidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG - Brasil

^IIICentro Universitário de Belo Horizonte - Uni-BH³, Belo Horizonte, MG - Brasil

^{Correspondência} Correspondência: Luiza A. Rabêlo Praça Afrânio Jorge SN Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde Prado - 5701-002 - Maceió, AL - Brasil E-mail: luizaa.rabelo@uol.com.br

RESUMO

Vários estudos destacam as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ERONs) como importantes contribuintes na patogênese de numerosas doenças cardiovasculares, incluindo hipertensão, aterosclerose e falência cardíaca. Tais espécies são moléculas altamente bioativas e com vida curta derivadas, principalmente, da redução do oxigênio molecular. O complexo enzimático da NADPH oxidase é a maior fonte dessas espécies reativas na vasculatura. Sob condições fisiológicas, a formação e eliminação destas substâncias aparecem balanceadas na parede vascular. Durante o desbalanço redox, entretanto, há um aumento na atividade da NADPH oxidase e predomínio de agentes pró-oxidantes, superando a capacidade de defesa orgânica antioxidante. Além disso, tal hiperatividade enzimática reduz a biodisponibilidade do óxido nítrico, crucial para a vasodilatação e a manutenção da função vascular normal. Apesar de a NADPH oxidase relacionar-se diretamente à disfunção endotelial, foi primeiramente descrita por sua expressão em fagócitos, onde sua atividade determina a eficácia dos mecanismos de defesa orgânica contra patógenos. As sutis diferenças existentes entre as unidades estruturais das NADPH oxidases, a depender do tipo celular que as expressa, podem ter implicações terapêuticas, permitindo a inibição seletiva do desequilíbrio redox induzido pela NADPH oxidase, sem comprometer, entretanto, sua participação nas vias fisiológicas de sinalização celular que garantem a proteção contra microorganismos.

Palavras-chave: NADPH oxidase, inibidores da NADPH oxidase, espécies de oxigênio reativas, espécie de nitrogênio reativas, oxirredução, doenças cardiovasculares.

Introdução

Vários estudos demonstram que as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ERONs) contribuem efetivamente para a patogênese de agravos cardiovasculares, como hipertensão, aterosclerose, hipertrofia e falência cardíacas e reestenose, além de lesões decorrentes de isquemia e reperfusão. Múltiplos sistemas enzimáticos produzem ERONs e seus derivados na vasculatura, incluindo ciclooxigenase, lipoxigenase, citocromo P450, xantina oxidase (XO), mieloperoxidase (MPO), óxido nítrico sintase (NOS) e NADPH oxidase - esta última uma das mais importantes fontes destas substâncias, tanto em células endoteliais como musculares lisas^1-22.

Desde as observações de Baehner e cols.²³ há cerca de 40 anos - que permitiram a descoberta da NADPH oxidase²⁴ - vários foram os estudos desenvolvidos para compreender a relação entre o referido complexo enzimático e o desbalanço redox (estresse oxidativo). O aumento da produção de ânion superóxido (O₂^-) e outras ERONs está implicado na aterosclerose, hipertensão arterial, proliferação celular e hipertrofia. Entretanto, o papel da NADPH oxidase em tais processos permanece incerto devido, principalmente, à presença de múltiplas isoformas de Nox (subunidades constituintes da NADPH oxidase) e seus ligantes, bem como à falta de inibidores específicos^25,26. O complexo enzimático atua como doador de elétron para a redução do O₂ a O₂^-, segundo a reação 2O₂ + NAD(P)H → 2O₂^- + NAD(P) + H^{+10,16,22,25,27}.

O₂^-: produção pela NADPH oxidase e sua relação com o NO

Os experimentos pioneiros de Furchgott e Zawadzki²⁸ primeiro demonstraram a existência de um fator relaxante derivado de endotélio que foi subsequentemente identificado como NO²⁹, produzido a partir da L-arginina pela ação do óxido nítrico sintase endotelial (eNOS)^29-32 na presença de cofatores, principalmente a tetrahidrobiopterina (H₄B; Figura 1). O NO difunde-se para as células musculares lisas vasculares e ativa a guanilato ciclase, promovendo a vasodilatação mediada pelo GMP cíclico^29-33. Em condições normais, o NO desempenha papel chave na manutenção da parede vascular num estado quiescente por inibição da inflamação, proliferação celular e trombose, reduzindo o tônus vascular, a ativação de plaquetas e leucócitos, a proliferação de células musculares lisas, a deposição de matriz extracelular e a morte de células endoteliais^34-36. O NO é também um radical livre e, quando produzido juntamente com o O₂^-, reage extremamente rápido para formar uma espécie pró-inflamatória altamente reativa: o ânion peroxinitrito (ONOO^-; vasodilatador menos potente que o NO). Assim, a maior parte da citotoxidade atribuída ao NO é derivada do ONOO^-5,37. Este último é um importante mediador da peroxidação de lipídios, incluindo a oxidação da LDL, evento crucial para a aterogênese⁵.

Fisiologicamente, certa quantidade de O₂^- intracelular é requerida para a sinalização normal desempenhada pelo NO. Todavia, patologicamente, o aumento extracelular da primeira espécie diminui a biodisponibilidade do NO, reduzindo sua difusão para o músculo liso vascular^38,39. Em determinadas circunstâncias, a produção crônica de ERONs (aumento da atividade da NADPH oxidase, por exemplo) excede a capacidade dos antioxidantes celulares enzimáticos (como a glutationa peroxidase-1 - principal enzima antioxidante no citosol e nas mitocôndrias^35,36 - e as formas de superóxido dismutase ligadas à membrana, responsáveis por dismutar o ânion superóxido em H₂O₂) e não enzimáticos, contribuindo para a doença vascular por indução da ativação endotelial sustentada^29,40. Grandes quantidades de O₂^- formadas captam a maior parte ou todo o NO, promovendo a formação de ONOO^-34,41. O O₂^- gerado pode ainda ser transformado em radical hidroxil, que se difunde para o músculo liso vascular e induz a produção de endoperóxidos vasoconstrictores, como a prostaglandina H₂ e prostanoides⁴¹, derivados da peroxidação do ácido aracdônico catalisada por radicais livres, considerados marcadores do aumento sistêmico do desbalanço redox in vivo⁴². O excesso de produção de O₂^-, com consequente diminuição da biodisponibilidade do NO, pode ser promovido ainda por metais de transição, tais como ferro, cobre, mercúrio e chumbo. Alguns destes contaminantes ambientais importantes são capazes de aumentar a produção de radicais livres via ativação do complexo enzimático NADPH oxidase^43,44, sendo este mecanismo uma causa provável para a hipertensão induzida pelas referidas espécies químicas.

Estudos de Wiggers e cols.⁴⁵ demonstraram, em ratos, que a exposição a baixas concentrações de mercúrio induz disfunção endotelial tanto em vasos de condutância como de resistência. Os autores sugerem que esse evento decorre, provavelmente, da redução da biodisponibilidade do NO devido ao aumento na produção vascular de O₂^-. Dessa forma, é possível que o tratamento com o mercúrio afete a expressão proteica ou, mais especificamente, a atividade da NADPH oxidase.

Tal desequilíbrio relaciona-se às ERONs pelo fato de o O₂ ser fundamental à respiração celular, havendo diversos sistemas enzimáticos que utilizam este substrato como um aceptor de elétrons^1,20. A família dessas espécies inclui moléculas altamente bioativas com vida curta derivadas, principalmente, da redução do O₂. Fisiologicamente, a formação e a eliminação das ERONs são balanceadas na parede vascular⁴⁶, cujo papel chave é desempenhando pelo endotélio na manutenção do tônus vascular e na pressão sanguínea pela liberação de substâncias vasoativas, como o NO⁴⁷. O aumento de ERONs devido ao desbalanço redox foi constatado em aorta, carótida, mesentérica e coronárias de ratos e camundongos idosos, sugerindo que este desequilíbrio está associado ao envelhecimento, com o aumento da atividade da NADPH oxidase⁴⁸. Evidências experimentais indicam que o dano oxidativo induzido por espécies reativas decorre do aumento da produção de O₂^- e seu metabolismo e/ou da redução da biodisponibilidade de NO^25,49. Contudo, apesar do excesso de ERONs ser tóxico, concentrações fisiológicas dessas espécies podem funcionar como sinal mediador de diversas respostas, incluindo migração celular e crescimento^20,22,50, já que, sob condições normais e na maioria das artérias, a produção de NO predomina, de modo que este radical retira pequenas quantidades de O₂^- formado^40,51-53, garantindo a manutenção do equilíbrio no estado oxidativo orgânico.

A inibição não seletiva da NADPH oxidase compromete a sinalização celular fisiológica

A NADPH oxidase melhor caracterizada é a fagocítica, presente em macrófagos e neutrófilos, sendo um complexo proteico multimérico com componentes na membrana celular e no citoplasma. O componente associado à membrana é o citocromo b558-oxidase, formado por uma subunidade maior, a gp91phox (o termo "phox" deriva de "phagocytic oxidase")⁷, e uma menor, p22phox. Além dessas, a enzima compreende três subunidades citoplasmáticas (p47phox, p67phox e p40phox) e uma pequena proteína G regulatória (Rac2). A ativação da NADPH oxidase inicia-se pela fosforilação (em serina) da subunidade citoplasmática p47phox, desencadeando sua migração para a membrana, onde, juntamente com a Rac, associa-se ao citocromo b558, iniciando a atividade catalítica da enzima^{1,5,17,37,53-58} (Figura 2).

A NADPH oxidase expressa nas células vasculares difere daquela encontrada em fagócitos, tanto pela estrutura bioquímica quanto pelas funções⁵. Foi inicialmente encontrada em neutrófilos, reconhecidamente essenciais na defesa contra microorganismos eliminados pela combinação de diversos mecanismos que incluem a geração d^-O₂^- produzido pelas subunidades endoteliais p40phox, p47phox e gp91phox da NADPH oxidase⁵⁴. Curiosamente, os grupamentos catalíticos gp91phox, p22phox, p47phox e p67phox também foram encontrados em fibroblastos da adventícia^7,13,22,55.

A identificação de subunidades homólogas à gp91phox resultou na formação da família Nox (de "Nonphagocytic NADPH Oxidase"), constituída atualmente por sete membros (Nox1, Nox2 [formalmente conhecida como gp91phox], Nox3,Nox4, Nox5, Duox1 e Duox2 [Dual oxidase])^10,56,57. Os principais componentes do complexo enzimático NADPH oxidase, Nox1 e Nox4, são altamente expressos nas células vasculares e aumentados durante o processo de remodelamento vascular, como na hipertensão e aterosclerose⁷. Essas sutis diferenças na expressão estrutural oferecem a oportunidade de desenvolvimento de inibidores específicos da NADPH oxidase vascular que não comprometam a sinalização fisiológica e as funções fagocíticas mediadas por ERONs⁵.

Várias características das NADPH oxidases são notáveis. Primeiro, a enzima vascular produz O₂^- em baixos níveis por longos períodos de tempo, a maior parte intracelularmente, onde desempenha papel na sinalização celular^{1,5,14,16,46,50,59} (Figura 3). Segundo, a gp91phox é, geralmente, substituída por Nox1 ou Nox4 homólogas, particularmente no músculo liso. Terceiro, enquanto a Nox homóloga e a subunidade p22phox ligada à membrana são essenciais para manter uma unidade estável que suporte a transferência eletrônica para a geração de O₂^-, permanece ainda obscuro o papel dos componentes citosólicos na NADPH oxidase, cujo último aspecto exibe implicações na ativação e especificidade dos inibidores da referida enzima^1,5,14,16,46. Além disso, a expressão das subunidades parece variar ainda em células musculares lisas de diferentes vasos. Células musculares lisas derivadas de artéria de resistência humana (HVSMC) parecem expressar uma subunidade gp91phox semelhante à neutrofílica⁶⁰. O homólogo da gp91phox, Nox1, é expresso em células musculares lisas de rato (RVSMC) e camundongo⁶¹ e células musculares lisas de aorta humana (ASMC), não aparecendo em artérias de resistência de humanos⁶⁰. A Nox1 possui 56% de homologia com a gp91phox humana e, em conjunto com a p22phox, é o provável componente funcional do citrocromo b558 em ASMCs e RVSMC⁶². Nox4, outro homólogo da gp91phox, é expresso em RVSMC, ASMC e HVSMC. Células endoteliais expressam principalmente as subunidades Nox2 e Nox4. A expressão de Nox1 é menos proeminente no endotélio e pode ser aumentada durante o processo de adesão leucocitária e estresse de cisalhamento. Nox2 e Nox4 parecem ser as subunidades funcionais mais importantes em células endoteliais, contribuindo de maneira semelhante na produção de espécies reativas⁶³.

Há também evidências de que a NADPH oxidase é encontrada no núcleo celular, envolvendo-se na expressão gênica. Vários grupos identificaram subunidades de NADPH oxidase em membranas internas. Entretanto, as consequências da ativação da NADPH oxidase em regiões perinucleares ainda não são claras²⁰.

Ativação enzimática: papel central das subunidades p47phox e gp91phox

O evento inicial mais relevante para a ativação da NADPH oxidase envolve a fosforilação da p47phox e a consequente interação com a gp91phox^1,16. A ligação entre domínios homólogos de duas estruturas Src autoinibem a ligação com a p22phox. Tal interação autoinibitória é perdida na fosforilação, permitindo a ligação entre as subunidades p47phox e p22phox¹, ocorrendo a ativação da NADPH oxidase. Corroborando, a deleção gênica da subunidade gp91phox confere proteção contra acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos, por evitar disfunção da barreira hematoencefálica⁶⁴.

As NADPH oxidases são ativadas e reguladas por diversos fatores, como forças mecânicas, hormônios e citocinas, dentre os quais se destacam a trombina, o Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta (PDGF), o Fator de Necrose Tumoral a (TNF-a), a lactosilceramida, a Interleucina-1 e a LDL oxidada (Figura 1). Esta última aumenta a produção de ERONs e a expressão de Nox4 no endotélio humano^1,5. Macrófagos cultivados acumulam grandes quantidades de colesterol quando expostos à LDL modificada (receptores para LDL são abundantes nestas células, indicando que tais estruturas estariam envolvidas na formação de células espumosas ateroscleróticas)^58,65.

Em células musculares lisas vasculares, a angiotensina II (Ang II) é um potente estimulador da atividade da NADPH oxidase. Este peptídeo angiotensinérgico é conhecido fator na patogênese da maioria das desordens cardiovasculares, podendo induzir a formação de O₂^-, em parte, pelas NADPH oxidases vasculares⁵. A ativação mediada pela Ang II foi demonstrada inicialmente por Griendling e cols.⁶⁶, destacando a importância das concentrações de Ang II no aumento da atividade da NADPH oxidase nas células musculares lisas vasculares^1,15,16. Apesar da sinalização pela qual a Ang II estimula a NADPH oxidase não ter sido elucidada por completo, as vias da PLD, da PKC, da PLA2, PI3K e tiol-oxiredutases parecem estar envolvidas^67-69. No músculo liso vascular, a tirosina quinase Src regula a atividade da NADPH oxidase estimulada pela Ang II, induzindo a fosforilação e translocação da subunidade p47phox¹⁵. Além disso, a Src é essencial para os efeitos da Ang II na síntese das subunidades da NADPH, estimulando o aumento na expressão da gp91phox, p22phox, p47phox e p67phox⁶⁰. Somando-se a isso, a fosforilação da Src antecede a ativação das cascatas ERK1/2 e JNK no músculo liso vascular, levando à migração, crescimento celular, apoptose e deposição de colágeno⁷⁰, ativando complexos de adesão focal, com importante participação na resposta inflamatória vascular⁷¹. Essas vias proliferativas e inflamatórias retroalimentam positivamente a ativação da NADPH oxidase na vasculatura. No músculo liso vascular, a transativação do receptor EGF parece estar envolvida, levando à ativação da PI3 quinase e da proteína RacG pequena minutos após a ativação do receptor AT1 de angiotensina^{5,11,14,16,20,46,72,73}. A Ang II atua aumentando a expressão das subunidades da NADPH oxidase em horas ou dias^{5,11,14,15,46}. Em modelos animais propostos por Rajagopalan e cols.¹¹, a produção de O₂^- vascular, a atividade da NADPH oxidase e os níveis de expressão de p22phox, gp91phox, p67phox e Nox1 estavam aumentados (para a NADPH oxidase, houve aumento de 100%).

Quando da ativação pela Ang II, o H₂O₂, gerado a partir do O₂^- produzido pela NADPH oxidase, é essencial para a hipertrofia das células musculares lisas vasculares⁵⁴, atuando ainda como um vasoconstrictor (Figura 4). Entretanto, em certos leitos vasculares, tanto em humanos como em camundongos, o H₂O₂ endógeno, em baixas concentrações, atua como um fator relaxante dependente de endotélio, promovendo hiperpolarização e vasodilatação periféricas, coronariana e em artérias cerebrais^74,75. Em cultura de células musculares lisas, a Ang II induz hipertrofia, mediada pelo H₂O₂ por meio da ativação da expressão de proto-oncogenes, MAP quinases e Akt/PKB⁵⁴. Em camundongos com deficiência no gene que expressa a gp91phox, a Ang II falha na indução da hipertrofia cardíaca¹⁷. Além disso, evidências experimentais indicam que o NO é um fator quimioatraente para a angiogênese e a inibição de sua produção bloqueia a neoformação vascular⁴⁹. Adicionalmente, a Ang II também promove mecanismos envolvidos na resposta inflamatória, podendo estimular simultaneamente a produção de NO e O₂^- pelas células endoteliais, situação favorável à formação de ONOO^-1,13,46,76. Curiosamente, a ativação da NADPH oxidase pela Ang II é atenuada pela Ang-(1-7)¹², um componente biologicamente ativo do sistema renina-angiotensina^17,25,77. A Ang-(1-7) parece inibir a fosforilação da Src induzida pela Ang II¹², promovendo vasodilatação dependente de endotélio por indução da liberação de NO³⁶. Quanto aos mecanismos de ativação humoral, a aldosterona regula as MAP quinases e a geração de O₂^- pela NADPH oxidase através de mecanismos c-Src dependentes⁷². Algumas ações terapêuticas de drogas hipotensoras (bloqueadores de receptor de angiotensina e inibidores da enzima conversora de angiotensina) são atribuídas à inibição da NADPH oxidase, com consequente redução na produção de ERONs²⁵. Entretanto, ainda não se sabe se estratégias terapêuticas que tenham como alvo tais espécies podem trazer benefícios diretos no manejo de pacientes hipertensos¹⁸.

Doenças cardiovasculares e neurodegenerativas relacionam-se com a atividade aumentada da NADPH oxidase

Estudos clínicos demonstraram que as ERONs desempenham importante papel na hipertensão. A produção dessas espécies sofre aumento em pacientes com hipertensão essencial, hipertensão renovascular, hipertensão maligna e pré-eclâmpsia²⁵. Além disso, a produção aumentada de O₂^- pela NADPH oxidase em vasos relaciona-se a fatores de risco para a aterosclerose (Fig. 1) e prejuízo da função endotelial em pacientes com doença coronariana⁵. A produção de O₂^- aparece aumentada em vasos ateroscleróticos^2,4,42, contribuindo para o início de eventos pró-inflamatórios, com regulação da transcrição gênica de moléculas de adesão de células vasculares e proteínas quimioatraentes para monócitos⁷⁸. Pacientes com aterosclerose apresentam tanto disfunção endotelial como desbalanço redox. Entretanto, o mecanismo preciso de associação entre esses dois eventos em humanos ainda é desconhecido⁴².

A disfunção endotelial relaciona-se com o aumento da atividade da NADPH oxidase (pelo aumento da expressão de suas subunidades catalíticas^14,53,79), já que lesões ateroscleróticas em coronárias humanas mostram intensa expressão de gp91phox na região vulnerável da placa. Além disso, a Nox4 está aumentada durante a fase de formação do ateroma, cujo aparecimento se dá em forma reduzida em lesões avançadas. Veias safenas magnas e artérias mamárias internas de pacientes com diabete melito apresentam aumento da atividade da NADPH oxidase e da eNOS desacoplada (neste estado, a enzima atua como produtora de O₂^- em vez de NO) quando comparadas com grupo controle, evidenciando a relação existente entre a NADPH oxidase e as lesões ateroscleróticas¹⁴.

A suplementação vitamínica pode reduzir o desbalanço redox vascular e melhorar o estado oxidativo total. Como exemplo, alguns modelos animais nos quais as propriedades antioxidantes das vitaminas C e E associam-se ao decréscimo na ativação da NADPH oxidase^42,80 e o aumento da atividade da SOD (o maior sistema de defesa celular contra o O₂^- na vasculatura⁴⁶). Postula-se que a vitamina E, hidrofóbica, poderia inibir a formação do complexo enzimático das subunidades da NADPH oxidase⁴⁹. Apesar dessas observações, testes clínicos com vitaminas antioxidantes não demonstraram benefícios terapêuticos quanto à mortalidade em eventos cardiovasculares^25,46. Além disso, dependendo, principalmente, da posologia, tais substâncias podem apresentar propriedades pró-oxidantes, com interações orgânicas deletérias. Como os dados de grandes estudos clínicos prospectivos falharam em demonstrar os efeitos benéficos dos antioxidantes²⁵, o que se recomenda é a manutenção de uma dieta balanceada sem suplementação vitamínica, visto que os danos potenciais de tal suplementação ainda não estão bem definidos.

Na hipertensão, o produto da ativação da NADPH oxidase, o O₂^-, promove a oxidação da H₄B, ocasionando um aumento no desacoplamento da eNOS, elevando-se os níveis desta espécie de oxigênio, reduzindo-se a biodisponilidade do NO¹⁴. Assim, acredita-se que a H₄B possa estar deficiente em condições associadas à função endotelial alterada, como hipercolesterolemia, diabete, hipertensão e tabagismo. Stroes e cols.⁸¹ mostraram que o tratamento com H₄B aumenta a vasodilatação em humanos com hipercolesterolemia, ao passo que a remoção desta biopterina implica o desacoplamento da eNOS⁴⁰. Reforçando esses achados, a superexpressão da eNOS previne o remodelamento da vasculatura pulmonar induzido por hipóxia crônica⁵², ocasionando mudanças estruturais e alterações nos processos celulares que resultam em aumento da relação camada média: lúmen vascular^82,83.

Outro fator implicado no aumento do desbalanço redox é a endotoxemia. Durante seu curso, a liberação de lipopolissacárides promove aumento da expressão e da atividade de xantina oxidase e da NADPH oxidase⁴⁶. O aumento de ERONs dependentes de NADPH oxidase em endossomos é importante para a resposta imune pró-inflamatória²⁰. Neutrófilos ativados produzem O₂^-, radical hidroxil (OH) e ácido hipocloroso (HOCl), além de peptídeos microbicidas e proteases⁸⁴ responsáveis pela resposta imune eficaz. A ativação neutrofílica na fagocitose de pneumococos induz a produção de ERONs pela NADPH oxidase. Além disso, o bloqueio da ativação da NADPH oxidase durante meningite bacteriana aguda em animais experimentais acarreta defesa deficiente contra Streptococcus pneumoniae⁸⁵.

Quanto à produção do NO, estudos clínicos e experimentais demonstram que a administração da L-arginina restabelece a síntese deste radical e a função vascular em várias doenças cardiovasculares, sugerindo que o prejuízo na disponibilidade do aminoácido precursor está presente nestes agravos. Os níveis reduzidos de L-arginina também promovem o desacoplamento da eNOS, resultando em aumento das ERONs³⁴.

Drogas doadoras de NO (nitrodilatadores) têm sido usadas no tratamento de doença coronariana, hipertensão e falência cardíaca, tendo ações antiinflamatórias na parede vascular como supressoras da oxidação de lipoproteínas, inibidoras da migração e proliferação de células musculares lisas vasculares e inibidoras da agregação plaquetária. Atuam ainda como supressoras da expressão de moléculas de adesão e quimiocinas após a estimulação com fatores pró-inflamatórios. Tais aspectos previnem a infiltração de células inflamatórias na parede vascular, onde também há oposição às ações pró-inflamatórias das ERONs. Além disso, descobriu-se recentemente que o NO parece exercer efeito anti-inflamatório na parede arterial por supressão de enzimas geradoras de ERONs, particularmente a NADPH oxidase⁵.

As proteínas Nox relacionam-se ainda com outras numerosas desordens orgânicas, incluindo câncer, reabsorção óssea e Doença de Alzheimer, por serem expressas em diversos tecidos^1,80,86. Evidências demonstram o papel da Nox2 em processos neurodegenerativos, como Doença de Parkinson, acidente vascular encefálico, trauma cerebral e meningite, devido, principalmente, à neurotoxicidade das ERONs^57,87. Dessa forma, os inibidores da Nox apresentam potencial clínico notável, particularmente se não inibirem a atividade dos fagócitos¹.

Inibidores da NADPH oxidase: potencial alvo terapêutico

Inibidores farmacológicos da NADPH oxidase que bloqueiam diretamente a atividade desta enzima têm sido descritos compreendendo estruturas peptídicas e não peptídicas. O DIP-difenileneiodônio^5,10 e 4'-hidroxi-3-metoxiacetofenona (a apocinina, isolada da planta medicinal Picrorhiza kurroa)⁸⁸ têm sido largamente utilizados para bloquear a atividade da NADPH oxidase in vitro⁵. Atualmente, sabe-se que o DPI-difenileneiodônio não é seletivo e age como um oxidante inespecífico⁶. Já a apocinina, por sua vez, tem múltiplas ações biológicas além dos efeitos antioxidantes⁵, sendo caracterizada como um inibidor da NADPH oxidase desde a década de 80⁶. Estudos de Godbole e cols.⁸⁹ demonstraram que a apocinina restabelece a produção de nitrito e a vasodilatação em artérias femorais comuns de suínos⁸⁹. Como o DIP não representa um inibidor específico da NADPH oxidase, a apocinina tornou-se muitíssimo popular⁶, com 692 registros de publicações no banco de dados PubMed até 15 de janeiro de 2009, dos quais 571 são específicos para a chave "apocynin NADPH oxidase inhibition", demonstrando a forte correlação entre os termos.

Os leucócitos são capazes de mediar o efeito inibitório da apocinina. Sugere-se que a mieloperoxidase (MPO), seletivamente expressa em leucócitos, é necessária para a ocorrência do efeito inibitório desta substância. Em células HEK293, desprovidas de MPO, a formação de dímeros de apocinina não ocorre mesmo após superexpressão das isoformas Nox⁶. Quando MPO humana é adicionada, os dímeros são identificados nas células com superexpressão de isoformas Nox ou nas células coincubadas com H₂O₂. Na ausência de H₂O₂ ou Nox, a produção dimérica pelas células HEK293 é inibida. Em leucócitos estimulados, os dímeros são prontamente detectáveis, ao passo que em células vasculares estimuladas não ocorre tal produção, mesmo na presença de MPO. Dessa forma, os autores sugerem que a apocinina atuaria como antioxidante e não como inibidor da NADPH oxidase em células não fagocíticas^6,88, sendo a ação inibitória para a NADPH oxidase restrita a leucócitos que expressam MPO⁶ (Fig. 3). Entretanto, outras peroxidases que não a MPO podem influenciar a atividade da apocinina, sendo possível que células vasculares possuam enzimas peroxidativas capazes de ativar este inibidor. Tal fato é reforçado por achados em células endoteliais, nas quais dímeros de apocinina foram identificados, com a apocinina inibindo de forma concentração dependente a atividade da NADPH oxidase, a formação de ERONs e a proliferação celular ⁸⁸.

Pagano e cols.⁹⁰ desenvolveram o peptídeo quimérico gp91ds-Tat, composto de nove aminoácidos da capa proteica do HIV e nove aminoácidos da gp91phox^1,10. Essa substância reage com a p47phox e interfere na ligação desta subunidade com a gp91phox. A porção "Tat" permite ao gp91ds-Tat penetrar na célula, sendo um efetivo inibidor de oxidases que contêm gp91phox. Contudo, apesar de peptídeos como o referido serem úteis em intervenções experimentais, os processos de biotransformação dificultam sua administração por via oral, limitando seu potencial na terapêutica clínica¹.

Inibidores peptídicos da NADPH oxidase são também descritos, como o antibiótico PR-39, secretado endogenamente por células intestinais e neutrófilos de humanos e suínos. Além de atuarem em células imunitárias, inibem a atividade da NADPH oxidase não fagocítica. Inicialmente, o PR-39 era visto como inibidor específico da NADPH oxidase. No entanto, estudos recentes mostraram que o antibiótico apresenta vários efeitos, em parte porque se liga a domínios SH3 de outras proteínas e em parte porque interage com lipídios de membrana⁵.

Conclusão

Identifica-se que a NADPH oxidase emergiu como uma das principais estruturas envolvidas no desbalanço redox vascular. Como o NO também é capaz de suprimir a atividade da NADPH oxidase, acredita-se que este evento apresente implicações diretas não apenas no desenvolvimento da doença vascular, mas também na recuperação aguda da lesão de isquemia e reperfusão, na qual o desbalanço dependente de NADPH tem grande contribuição^1,5.

O desenvolvimento de inibidores específicos de oxidases, baseado nas unidades Nox, pode fornecer ferramentas para elucidar os papéis destas enzimas experimentalmente. Também pode ser útil no tratamento de diversas doenças¹, principalmente no que se refere à inibição enzimática seletiva com o intuito de reduzir o dano vascular decorrente da produção excessiva de ERONs sem, entretanto, comprometer o mecanismo de sinalização celular dependente das referidas espécies.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq, à FAPEAL e ao PPSUS-2006/Ministério da Saúde-FAPEAL pelo apoio financeiro concedido.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi parcialmente financiado pelo CNPq, PROCAD-NF/CAPES e FAPEAL.

Vinculação Acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Artigo recebido em 28/02/09; revisado recebido em 22/05/09; aceito em 08/06/09.

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Correspondência:

Luiza A. Rabêlo

Praça Afrânio Jorge SN

Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde

Prado - 5701-002 - Maceió, AL - Brasil

E-mail:

luizaa.rabelo@uol.com.br

Datas de Publicação

Publicação nesta coleção
22 Set 2010
Data do Fascículo
Maio 2010

Histórico

Recebido
28 Fev 2009
Revisado
22 Maio 2009
Aceito
08 Jun 2009

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

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