1. 引言

过去200多年来，全球范围内进行了大规模野外调查、标本采集，根据形态特征进行植物分类，推测其系统发生关系，进行生物地理学研究 [1] - [9]。出版了植物志和专著 [10] [11]。近年来，中国科学院设立中国–非洲联合研究中心，目的在于协助非洲国家出版和再版植物志 [12]。植物志全面记录植物特征，为植物资源的保护和利用提供科学依据。

由于植物的种间和属间存在或多或少的形态相似性，用于植物分类的有价值的形态性状数量有限 [3] [13] [14] [15]，这些给植物物种鉴定带来很大挑战。以中国科学院植物研究所植物标本馆为例，该馆馆藏植物标本295万份，其中，约有60万份标本没有鉴定，原因大多是由于标本缺乏识别特征或者没有相关植物类群的专家来鉴定。这些存疑标本多放置在类群的科尾。Goodwin et al. (2015) [3] 评价了21个国家40个标本馆的4500份非洲姜科Zingiberaceae椒蔻属Aframomum植物标本，发现至少58%的标本名称鉴定错误，龙脑香科Dipterocarpaceae龙脑香属Dipterocarpus植物以及旋花科Convolvulaceae番薯属Ipomoea植物的标本也存在类似的情况 [3]。热带植物的标本平均有50%以上名称鉴定错误 [3]。植物多样性资源的鉴定和可持续利用已成为世界性重大需求 [16]。

近20年来，分子性状辅助植物鉴定已经成为热点研究方向之一。叶绿体基因组序列作为一种信息量大、有价值的数据来源用于植物鉴定和系统发生研究已被广泛接受，因其具有相当保守的基因组结构、基因含量和基因顺序 [17] - [23]。随着生命之树全球研究计划的进展，推荐使用的4个通用DNA条形码(rbcL, matK, trnH-psbA及ITS)，其中3个(rbcL, matK, trnH-psbA)来自叶绿体基因组 [2] [24] [25]。由于DNA片段提供的信息量少，只能区分有限数量的植物种类，有学者提出，利用叶绿体全基因组序列作为一个超级DNA条形码用于植物的物种鉴定 [2] [20] [21]。然而，叶绿体基因组序列的全长大约15万个核苷酸，操作工作量巨大。为了提供一种更加简便、准确的植物分类鉴定方法，本研究首次利用叶绿体基因组的大单拷贝区的单核苷酸多态位点，研制分子分类检索表，为紫薇属和马尾藻属植物资源的保护与利用提供技术支持。

2. 材料与方法

测序了代表千屈菜科(Lythraceae)紫薇属(Lagerstroemia) 16种 [2] [20] [26] [27] [28] 的31个体的叶绿体全基因组序列(表1)，利用MAFFT v7.055b软件 [29] (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software)比对。截取其中大单拷贝区的序列，利用Mega 7.0软件 [30] 分析变异位点。从中选择单核苷酸多态位点，利用Suo et al. (2012, 2015, 2016) [15] [31] [32] 描述的方法，研制紫薇属物种的分子分类检索表。检索表中使用的单核苷酸多态位点作为分子数据，利用Mega 7.0软件 [30] 生成16种紫薇的系统发生关系树状图。利用马尾藻科(Sargassaceae)马尾藻属(Sargassum)的9个种和变种的叶绿体基因组序列，验证了本方法鉴定藻类的适用性。

3. 结果

紫薇属16个种的叶绿体全基因组序列比对矩阵的长度为153826 bp。103个单核苷酸多态位点来自LSC区的第128个至第73199个碱基的区域内，作为分子性状，研制分子分类检索表(图1)。成功鉴定了紫薇属的物种。利用检索表内使用的103个单核苷酸多态位点，生成16个物种的系统发生关系树状图(图2)。16个物种分为4个大的支系，I，II，III和IV。使用3~15个单核苷酸多态位点可以鉴定出每个分支，利用3~14个单核苷酸多态位点可以鉴定出每个物种(图1)。同一个支系内的物种具有近缘关系(图2)。分支IV揭示，安徽紫薇Lagerstroemia anhuiensis和光紫薇L. glabra具有非常近缘的关系，它们共有5个独特的单核苷酸多态位点，即cpDNA_LSC_G₄₁₇₂G₄₁₇₃G₈₃₁₀A₈₄₄₈C₇₂₅₅₀。

4. 讨论

紫薇属植物的叶绿体基因组中，大单拷贝区的长度是反向重复区长度的约3.2倍，是小单拷贝区长度的近5倍。大单拷贝区的变异位点数目，是小单拷贝区的约2.4倍，为反向重复区的近7倍 [20] [26] [27] [28]。大单拷贝区的这103个单核苷酸多态位点，已经足够区分16种紫薇属植物 [27] [28] [33] [34] [35]。紫薇属其余物种的叶绿体基因组测序需要全球合作。

有学者认为gap的有无、poly结构的长度变异，如(A)n，(C)n，(G)n，(T)n，以及简单重复序列的长度变异，可以作为分子性状使用。这3类“分子性状”也确实能够用来区分物种。然而，当几个gap同时集中存在于临近位置时，即使手动调整，gap之间的短序列有时也很难匹配到唯一的位置。当poly结构长度或简单重复序列的长度很长的时候，容易出现测序误差。在本研究中回避使用gap、poly结构以及简单重复序列区域的生物信息。这3类“分子特征”不便于编写分子分类检索表。图2是LSC区的单核苷酸多态位点揭示的系统发生关系。

泛素–蛋白酶体系统的相关基因区域是开发植物分子鉴定工具的另一种选择，精度也较高 [17] [31] [32]。然而，获得长度较长的泛素–蛋白酶体系统的相关基因序列，有待实验技术的突破。相对而言，叶绿体基因组序列的性价比较高，目前更容易获得。

叶绿体DNA也用于藻类物种的分类和系统发生关系研究 [36] [37] [38] [39]。马尾藻科马尾藻属植物是“海底森林”的重要构成物种。我们利用马尾藻属9种/变种的14条叶绿体基因组序列(表2)，获得长度为74409 bp的LSC区的比对序列，第5336个碱基至第10027个碱基区段的序列的长度为4692 bp (占LSC全长的6.3%)，其中，检测到有分类价值的单核苷酸多态位点221个，成功鉴定了马尾藻属的9个种/变种，见图3和图4。结果表明，我们的植物分类鉴定新方法不仅适用于高等植物，也适用于藻类。

全球植物的种类数量巨大。基因转移和丢失造成的遗传变异，可能导致靶标DNA区域的序列难以获得，进而导致DNA条形码研究和系统发生关系研究有时不能进行比较分析 [2]，但是，叶绿体基因组(大单拷贝区)在植物界始终存在。因此，基于大单拷贝区的序列，应该能够实现全球所有植物的比较分析。叶绿体基因组可以为植物分类鉴定提供丰富的生物信息。我们的新方法具有确定性好、分辨率高、操作简单、最大限度地减少了多样性管理数据的储存量。对于植物的鉴定、植物数字化管理平台升级以及植物多样性保护，具有重要价值 [3] [9]。

致 谢

在样品采集和讨论过程中获得侯伯鑫、张寿洲、余俊杰、徐超、陈进、施济普、宁祖林、徐炳强、张会金、何开红、王少青等多位老师的热情指导和帮助。

基金项目

中国国家自然科学基金项目(No. 31770744)和国家林木种质资源共享服务平台项目(2005DKA21003)。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献