体外循环加压灌注重建肢体微循环的力学与化学信号传导机制

doi:10.12307/2022.424

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (9): 1334-1340.doi: 10.12307/2022.424

• 骨与关节生物力学 bone and joint biomechanics • 上一篇下一篇

体外循环加压灌注重建肢体微循环的力学与化学信号传导机制

高磊1，秦新愿1，聂鑫2，王雷3，王江宁1

1首都医科大学附属北京世纪坛医院矫形外科，北京市 100038；2山东第一医科大学第一附属医院骨创科，山东省济南市 250014；3山东大学第二医院急诊科，山东省济南市 250033

收稿日期:2021-05-20 修回日期:2021-05-24 接受日期:2021-06-23 出版日期:2022-03-28 发布日期:2021-12-09
通讯作者: 王江宁，博士，主任医师，首都医科大学附属北京世纪坛医院矫形外科，北京市 100038
作者简介:高磊，男，1985年生，河北省石家庄市人，汉族，首都医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨外科、显微外科、难愈合创面修复、微循环重建方面的研究。
基金资助:
首都临床特色应用研究与成果推广项目(Z171100001017070)，项目负责人：王江宁

Extracorporeal circulation compression perfusion in the reconstruction of limb microcirculation from the mechanism of mechanical and chemical signal transduction

Gao Lei1, Qin Xinyuan1, Nie Xin2, Wang Lei3, Wang Jiangning1

1Department of Orthopedics, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China; 2Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University, Jinan 250014, Shandong Province, China; 3Department of Emergency, Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, Shandong Province, China

Received:2021-05-20 Revised:2021-05-24 Accepted:2021-06-23 Online:2022-03-28 Published:2021-12-09
Contact: Wang Jiangning, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China
About author:Gao Lei, MD, Attending physician, Department of Orthopedics, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China
Supported by:
the Capital Clinical Characteristic Application Research and Achievement Promotion Project, No. Z171100001017070 (to WJN)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
体外循环加压灌注：将自体血引出体外注入循环灌注系统，通过体外循环泵循环加压灌注致病变肢体，病变肢体近端依靠加压止血带阻断血流，病变肢体与体外循环系统形成局部循环回路，通过提高肢体动脉单位时间内的灌注压力(产生肢体平均动脉压200%-300%的最小搏动波形)，使病变肢体远端血流量增加，改善了末梢血液循环。
血管力学与化学信号传导：机械力学刺激作用于血管内皮细胞，使血管内皮细胞发生迁移、形成新的管腔来对血管再生产生调控作用，此过程涉及力学刺激信号与血管舒张因子和收缩因子之间的偶联作用，最终通过这些血管活性物质对血管功能起调节作用。

背景：前期工作应用体外循环加压灌注治疗缺血病变，建立下肢侧支循环的同时，通过增多下肢血流灌注量改善肢体远端微循环，该项技术取得了很好的临床效果。
目的：通过设计糖尿病合并外周动脉疾病动物模型，从力学与化学信号传导机制来阐述体外循环加压灌注技术重建肢体微循环的作用原理。
方法：24只巴马小型猪(均建立糖尿病合并外周动脉疾病模型)，随机分为4组，每组6只，分别为空白对照组、模型组、体外循环灌注治疗组(正常肢体平均动脉压灌注)(常压灌注组)、体外循环加压灌注治疗组(2倍平均动脉压灌注)(加压灌注组)，分别于模型建立成功、灌注30 min，1 h，2 h，5 h，7 h等6个时间点测定4组实验动物的肢体血流量，抽取实验动物动脉血运用ELISA法行细胞因子白细胞介素8、一氧化氮和内皮素1含量测定；实验结束2周后，取右后肢胫前肌组织，于病理科行苏木精-伊红染色，观察毛细血管密度；实验结束后取4组实验动物右后肢胫前肌组织，Western blot法检测组织中血管内皮生长因子A /血管内皮细胞生长因子受体2蛋白相对表达量。
结果与结论：①加压灌注组在灌注7 h后，其皮肤血流值显著高于其他3组，差异有显著性意义(P < 0.05)；血清标本中一氧化氮水平显著高于其他3组，差异有显著性意义(P < 0.05)；血清标本中内皮素1值高于模型组，低于空白对照组、常压灌注组，差异有显著性意义(P < 0.05)；血清标本中白细胞介素8水平高于模型组，低于空白对照组、常压灌注组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②实验结束2周后，加压灌注组胫前肌组织标本病理学检测显示微血管密度计数为(18.33±1.51)条/mm2，显著高于其他3组(P < 0.05)；加压灌注组胫前肌组织中血管内皮生长因子A /血管内皮细胞生长因子受体2蛋白表达量显著升高，与其他3组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；③提示体外循环加压灌注技术通过提高灌注压，增大血液流动过程中血流对血管内皮细胞的剪切力，启动复杂的力学与化学信号转导，促进侧支循环形成，进而有效改善微循环。
缩略语：血管内皮生长因子A：vascular endothelial growth factor A，VEGFA；血管内皮细胞生长因子受体2：vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 糖尿病合并外周动脉疾病, 体外循环加压灌注, 微循环, 剪切力, 毛细血管

Abstract: BACKGROUND: Preliminary work applied extracorporeal circulation and pressurized perfusion to treat ischemic lesions. While establishing lower extremity collateral circulation, it also improved the distal microcirculation of the extremities by increasing the blood perfusion volume of the lower extremities. This technique has achieved good clinical results.
OBJECTIVE: To explain the principle of extracorporeal circulation compression perfusion in the reconstruction of limb microcirculation from the mechanism of mechanical and chemical signal transduction by designing an animal model of diabetes with peripheral arterial disease.
METHODS: The models of diabetes mellitus complicated with peripheral arterial disease were established in 24 Bama miniature pigs and were randomly divided into four groups (n=6): blank control group, model group, extracorporeal circulation perfusion group (close to normal limb mean arterial pressure perfusion) (normobaric perfusion group), and extracorporeal circulation compression perfusion group (twice mean arterial pressure perfusion) (compression perfusion group). The limb blood flow of the four groups of experimental animals was measured at six time points: successful establishment of the model, 30 minutes of perfusion, 1 hour of perfusion, 2 hours of perfusion, 5 hours of perfusion, and 7 hours of perfusion. Arterial blood samples of experimental animals were taken to detect the contents of interleukin-8, nitric oxide and endothelin-1 by enzyme-linked immunosorbent assay. Two weeks after the end of the experiment, the tibialis anterior muscle of the right hindlimb was stained with hematoxylin and eosin to observe the capillary density. The tibialis anterior muscle of the right hindlimb was taken from the right hindlimb, and the relative expression of vascular endothelial growth factor A/ vascular endothelial growth factor receptor 2 protein was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The skin blood flow of the compression perfusion group was significantly higher than that of other three groups after 7 hours of perfusion (P < 0.05). The serum nitric oxide level in compression perfusion group was significantly higher than that in the other three groups (P < 0.05). The serum endothelin-1 value in compression perfusion group was significantly higher than that in the model group, lower than that in blank control group and normal pressure perfusion group (P < 0.05). The serum interleukin-8 level in compression perfusion group was higher than that in the model group and lower than that in the blank control group and normal pressure perfusion group, and the difference was statistically significant (P < 0.05). (2) Two weeks after the end of the experiment, pathological examination showed that the microvessel density count of tibialis anterior muscle tissue in compression perfusion group (18.33±1.51)/mm2 was significantly higher than that in the other three groups (P < 0.05). The relative expression of vascular endothelial growth factor A/ vascular endothelial growth factor receptor 2 protein in the tibialis anterior muscle tissue in the compression perfusion group was significantly higher than that in the other three groups (P < 0.05). (3) By increasing the perfusion compression and increasing the shear force of blood flow to vascular endothelial cells, the shear force acted as a mechanical stimulation signal to initiate complex mechanical and chemical signal transduction so as to promote the formation of collateral circulation, thereby effectively improving microcirculation.

Key words: diabetes mellitus complicated with peripheral arterial disease, extracorporeal circulation compression perfusion, microcirculation, shear force, capillaries

中图分类号:

高磊, 秦新愿, 聂鑫, 王雷, 王江宁. 体外循环加压灌注重建肢体微循环的力学与化学信号传导机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1334-1340.

Gao Lei, Qin Xinyuan, Nie Xin, Wang Lei, Wang Jiangning. Extracorporeal circulation compression perfusion in the reconstruction of limb microcirculation from the mechanism of mechanical and chemical signal transduction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(9): 1334-1340.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析共纳入24只巴马小型猪，分为4组，每组6只，全部进入结果分析，实验造模操作过程中无脱失和死亡，继续观察至实验结束均未出现实验动物的脱失与死亡。
2.2 肢体血流量对比加压灌注组随着灌注时间的延长，猪右后肢的皮肤血流值呈上升趋势；加压灌注组在灌注7 h后，其皮肤血流值显著高于空白对照组、模型组及常压灌注组，差异有显著性意义(F=471.1，P < 0.05)，见表1。

2.3 各组血清标本中一氧化氮的测定结果加压灌注组的实验动物血清样本中一氧化氮浓度在0-2 h升高至峰值，2-7 h开始回落，最终浓度高于模型组、空白对照组、常压灌注组，且差异有显著性意义(F=578.4，P < 0.05)，见表2及图3。

2.4 各组血清标本中内皮素1的测定结果加压灌注组实验动物血清样本中内皮素1的质量浓度在1 h内升高至峰值，1-7 h开始回落，最终质量浓度高于模型组，低于空白对照组、常压灌注组，且差异有显著性意义(F=486.8，P < 0.05)，见表3及图4。

2.5 各组血清标本中白细胞介素8的测定结果加压灌注组血清样本中白细胞介素8的质量浓度在6个时间点呈现升高趋势，最终数值高于模型组，低于空白对照组与常压灌注组，且差异有显著性意义(F=433.8，P < 0.05)，见表4及图5。

2.6 组织病理学分析及毛细血管密度检测加压灌注组胫前肌组织标本微血管密度为(18.33±1.51)条/mm2，分别高于空白对照组(9.50±1.05)条/mm2、模型组(4.67±1.03)条/mm2、常压灌注组(11.00±1.41)条/mm2，差异有显著性意义(P < 0.05)。各组右后肢胫前肌组织苏木精-伊红染色结果说明体外循环加压灌注疗法可以改善糖尿病合并外周动脉疾病模型缺血下肢的末梢循环，毛细血管密度增大，可以增大肢体远端肌肉组织的血液供应量，从而能缓解肢体的缺血症状，见图6，7。

2.7 各组VEGFA、VEGFR2蛋白相对表达量对比 Western Blot检测结果显示，加压灌注组的VEGFA、VEGFR2蛋白表达量与其他3组相比显著升高(F=56.6，75.3，P < 0.05)。结果提示，体外循环加压灌注可以增加VEGFA、VEGFR2的蛋白表达水平，见图8。

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引言

糖尿病合并外周动脉疾病是一种下肢缺血性疾病[1-3]，该类疾病主要是由于动脉狭窄或闭塞而引起，由于其严重的疼痛(静息痛)、麻木等临床症状影响患者生活质量，形成的缺血性足部溃疡可能造成截肢或死亡等严重后果，该病在糖尿病患者群体中的发病率逐年呈上升趋势，近年来备受关注[4-5]。
糖尿病合并外周动脉疾病的治疗，在未形成坏疽溃疡等创面的前提下，主要以改善临床症状为主[6-7]，内科用药主要针对扩张血管、改善肢体远端微循环、抗凝处理(抗血小板聚集可防止血栓形成)、溶栓(降解纤维蛋白酶原)这几个治疗原则，但是近期治疗效果欠佳，不能短时间内达到临床症状改善的目的[7]；然而随着外科技术手段的进步，外科治疗虽然可采取腔内治疗(例如近些年开展的腔内支架植入，带药物涂层的球囊，腔内旋切减容技术)、旁路重建手术(取大隐静脉血管搭桥)等方法改善临床症状，但下肢病变血管长期通畅是难以保证的，最主要的原因是此类患者具有糖尿病、冠状动脉粥样硬化、高脂血症、高血压等基础疾病[8]。文献报道，通过体外循环泵对肢体进行加压灌注，产生肢体平均动脉压200%-300%的最小搏动波形，并且在24-36 h的疗程中重复进行，最长不超过74 h，可获得避免大截肢或者减轻静息痛、促进溃疡愈合和使跛行距离得到明显改善的临床结果[9-12]。国内最早于2004年提出体外循环灌注离断肢体概念，并开始进行相关的动物实验研究，2011年应用体外循环灌注系统对离体断肢(创伤导致的肢体离断)进行灌注保存，并应用该方法开展断肢再植保肢病例的临床研究；2014年将该方法应用于挤压伤综合征的治疗，同时对中药脉络宁局部肢体灌注展开相关研究；2015年开始应用体外循环加压灌注技术开展外周动脉疾病的治疗[13-14]。在国际上，隔离肢体灌注首先由KREMENTZ等于1956年描述，用于肢体复发黑色素瘤外科治疗；THOMPSON等描述了一种简化的隔离肢体灌注方法，1994年被命名为隔离肢体输液用于治疗下肢多发性黑色素瘤；20世纪90年代末至21世纪初MCDERMOTT等进行了关于局部化疗药物灌注在肢体恶性肿瘤中的应用；2008-2013年LANE等进行了高压体外肢体灌注，即一种处理严重下肢缺血新技术的实验研究及临床应用[9-10]；2016年TAEGER等在临床上首次通过使用肝素化晶体溶液进行持续的体外皮瓣灌注，可以成功降低缺血相关皮瓣坏死的风
险[15-16]。
目前作者所在团队应用体外循环加压灌注治疗缺血病变，建立下肢侧支循环的同时，通过增多下肢血流灌注量改善肢体远端微循环，该项技术取得了很好的临床效果[7，9]，作者认为体外循环加压灌注技术的主要作用原理为：对血管进行加压灌注，可升高血管内皮细胞的剪切力，同时可以舒张平滑肌，使血管得到扩张[7，9]。但是从血流动力学角度考虑，此技术对于微循环重建的机制，以及灌注过程中力学刺激信号的传导过程缺乏相关的理论基础。此次研究建立糖尿病合并外周动脉疾病模型，设计不同的灌注压力，观察血管内皮细胞在不同剪切力作用下一氧化氮、内皮素1及白细胞介素8的表达变化，同时观察肌肉组织中血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)的蛋白表达水平，揭示体外循环加压灌注技术通过剪切力介导的血管调控机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，不同时间点组内比较用一般线性模型重复测量分析，多组间比较采用单因素方差分析和LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2018年9月至2019年10月在首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康雄性成年巴马小型猪24只，体质量24-26 kg，购于北京通和生泰比较医学研究所，动物许可证号：SCXK(京)2018-0003。实验过程中应用《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准相关条例对动物的处置，该实验经首都医科大学附属北京世纪坛医院伦理委员会批准。
1.3.2 主要试剂、仪器猪内皮素1 ELISA试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司)；猪一氧化氮ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)；猪白细胞介素8 ELISA试剂盒(上海研卉生物科技有限公司)；兔多抗GAPDH(杭州贤至生物)；兔多抗VEGFA(70 kD)、兔多抗VEGFR2(150 kD)(美国Abcam公司)；HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；
SDS-PAGE 配胶试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；PMSF、RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；ECL底物液(Thermo)；X射线片胶片(柯达)；显影定影试剂盒(天津市汉中摄影材料厂)；链脲佐菌素、四氧嘧啶(美国Sigma)。微量高速离心机(湖南湘仪公司)；垂直电泳槽(北京六一仪器厂)；倒置显微镜(德国leica公司)；数字化DSA(德国西门子)；分光光度计(美国Molecular)；快速血糖仪(德国罗氏)；电泳仪、电转仪、凝胶成像仪(美国BioRad)。
1.4 方法
1.4.1 糖尿病合并周围动脉疾病模型[17-20] 将实验动物称质量，然后给予氯胺酮(10 mg/kg)肌肉注射进行麻醉，从耳缘静脉推注链脲佐菌素+四氧嘧啶溶液(60 mg/kg链脲佐菌素+
30 mg/kg四氧嘧啶)连续3 d，从第2天测空腹血糖，连续测定12 d，空腹血糖值稳定> 17 mmol/L为糖尿病造模成功。糖尿病模型建立成功后3周，构建下肢缺血模型，造模前禁食水12 h，氯胺酮注射液4 mg/kg联合速眠新0.05 mL/kg肌肉注射进行基础麻醉，麻醉满意后取丙泊酚注射液与氯化钠注射液1∶1稀释后以30滴/min经耳缘静脉持续静滴维持麻醉。取右后肢建立缺血模型，备皮消毒铺巾，于股动脉搏动位置，切开皮肤长约5 cm，用血管钳分离周围组织，显露股三角，直视下找到股动脉，参考文献方法建立下肢缺血模型[14]。

1.4.2 实验分组将24只巴马小型猪依据随机抽样的原则分为4组，每组6只，分别为空白对照组、模型组、常压灌注组(接近正常肢体平均动脉压灌注，动脉压检测产生等于平均动脉压的最小搏动波形)及加压灌注组(2倍平均动脉压灌注，动脉压检测产生平均动脉压200%的最小搏动波形)。
(1)空白对照组：实验开始前6 h禁食水，不做任何处理。
(2)模型组：建立糖尿病合并外周动脉疾病模型，实验开始前6 h禁食水，不做任何处理。
(3)常压灌注组：①体外循环插管操作：实验开始前给予实验用猪禁食水6 h，氯胺酮注射液4 mg/kg联合速眠新0.05 mL/kg肌肉注射进行基础麻醉，麻醉满意后行气管插管，取丙泊酚注射液与氯化钠注射液1∶1稀释后以30滴/min速度经耳缘静脉持续静滴维持麻醉，将实验猪以仰卧位固定于手术台，常规刷手，以碘伏消毒实验用猪右侧腹股沟区3遍，铺无菌单，穿手术衣戴手套，于建模动物肢体腹股沟处下端1.5 cm处沿着原造模时手术切口再次行一长约5 cm切口，分离皮下组织，钝性分离肌肉，注意止血，解剖可看见粗大、搏动的股动脉以及伴行的股静脉，分离出股动脉及股静脉，向肢体远端方向行股动静脉穿刺，回抽见鲜红色的动脉血及暗黑色的静脉血回流表示插管成功，以3-0缝线固定，缝合手术切口，仅留置股动静脉插管接头于体外，插管操作完毕，见图1。②连接体外循环灌注系统：取对侧肢体股动脉血100 mL提前预充体外循环灌注系统，之后将体外循环灌注系统动静脉管路分别与猪股动静脉接头连接，并于切口近端1 cm处安装简易止血带阻断右侧后肢切口近侧的侧支循环，启动体外循环灌注系统，可见静脉管路内黑色静脉血引出，选择置换液进行体外循环灌注，设置灌注流量为200 mL/min，设置温度为10 ℃，膜肺装置氧体积分数为10%[13]，见图2。持续灌注7 h，灌注完毕后拔除股动静脉插管，穿刺点压迫止血，恢复自身血供，确认无活动性出血后逐层缝合置管瘘口，无菌敷料覆盖包扎，送回动物房观察。

(4)加压灌注组：除灌注流量设置为400 mL/min外，其余操作同常压灌注组。
1.5 主要观察指标
1.5.1 血流量测定应用激光多普勒线性扫描仪LDLS(Moor instrument，UK)，仪器探头位于猪病变右后肢中央表面正上方。分别于模型建立成功(灌注0 min)、灌注30 min，1 h，2 h，5 h，7 h测量肢体血流量。
1.5.2 ELISA法测定血清白细胞介素8、一氧化氮和内皮素1表达水平分别于模型建立成功、灌注30 min，1 h，2 h，5 h，7 h测量抽取肢体动脉血，运用ELISA法行细胞因子白细胞介素8、一氧化氮和内皮素1表达水平检测。
1.5.3 毛细血管密度组织病理学观察实验结束2周后，取右后肢胫前肌组织，于病理科行苏木精-伊红染色，观察毛细血管密度。毛细血管计数方法：放大100倍显微镜下计量每个视野内毛细血管数目(有完整管腔)，共计3个视野，取其平均数[14]。
1.5.4 Western blot法检测胫前肌组织中血管内皮生长因子VEGFA/VEGFR2蛋白相对表达量实验结束2周后，取4组实验动物右后肢胫前肌组织，行胫前肌标本Western Blot检测，将保存于-80 ℃液氮中的胫前肌组织标本取出后解冻，将少量的剪碎的组织块置于2 mL EP管中，加入用清洗干净的钢珠，每管加300 μL单去污剂裂解液裂(含PMSF)，置于自动匀浆机中匀浆，将EP管置于冰上30 min充分裂解，裂解 30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 mL离心管中，然后在4 ℃下12 000 r/min离心5 min，取上清分装于0.5 mL离心管中并置于-20 ℃保存。
BCA试剂盒(上海碧云天公司)测定骨骼肌组织标本的总蛋白部分进行蛋白定量。经蛋白变性、电泳分离、电转移得PVDF膜，脱脂奶粉封闭，加入适度的兔多抗VEGFA(70 kD)，兔多抗VEGFR2(150 kD)，4 ℃孵育过夜，再加入HRP标记羊抗兔二抗，以兔多抗GAPDH为内参，ECL法显色，曝光，BandScan软件分析灰度值，将目标蛋白与内参灰度值比值作为目标蛋白表达量。
1.6 统计学分析数据分析采用SPSS 24.0统计软件进行，数据以x±s表示，不同时间点组内比较用一般线性模型重复测量分析；多组间比较采用单因素方差分析和LSD检验，检验水准 α=0.05。

讨论

3.1 体外循环加压灌注技术重建肢体微循环的结果分析加压灌注组在灌注7 h后，其皮肤血流值显著高于其他3组，且差异有显著性意义(P < 0.05)；血清标本中一氧化氮值显著高于其他3组，且差异有显著性意义(P < 0.05)；血清标本中内皮素1和白细胞介素8值高于模型组，低于空白对照组、常压灌注组水平，且差异有显著性意义(P < 0.05)。实验结束2周后，加压灌注组胫前肌组织标本病理学检测显示微血管密度计数为(18.33±1.51)条/mm2高于其他3组，且差异有显著性意义(P < 0.05)；加压灌注组胫前肌组织中血管内皮生长因子VEGFA/VEGFR2蛋白表达量显著升高，与其他3组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。提示体外循环加压灌注技术通过提高灌注压，增大血液流动过程中的血流对血管内皮细胞的剪切力，剪切力作为力学刺激信号启动复杂的力学与化学信号转导，最终在灌注过程中促进侧支循环形成，进而改善微循环。
3.2 体外循环加压灌注技术中灌注压力与血管内皮细胞剪切力及平血管滑肌张力的关系体外循环加压灌注技术包括采集动脉血并以高于肢体平均动脉压的压力回流。在此过程中，诱导的血管内皮细胞表面的高动力性剪切应力会在理论上刺激侧支血管的生长和重塑。一项动物实验中关于压力和流量数据表明，压力和流量在旁侧通路上有直接的关系[9]。可以定义流量，使压力变化用连续流动代替正常的脉动流动也可产生有益的影响。毛细管脆性与脉压有关。由于流动是连续的，这可以减轻高流入压力。尤其重要的是舒张流量的改善，这可能在脑血管疾病中有应用价值，其中出血性梗死转化是一个重要的考虑因素，可以在不增加峰值压力的情况下增加舒张流量[10，21-22]。但是在此次研究中发现，体外循环加压灌注过程中泵速的变化允许控制流入压力，较高的流速表明较高的灌注压力，较高的灌注压力可使血管侧支平滑肌张力增大。此次研究中缺血肢体血流量的增加显示需要较高的灌注压，提示压力升高导致血管平滑肌扩张，导致外周阻力下降，灌注压力降低后，平滑肌张力恢复。
3.3 血流流体剪切力与血管内皮细胞及平滑肌细胞的关系血管平滑肌细胞及血管内皮细胞构成了血管壁，而血管壁的生理特性由内皮细胞与平滑肌细胞的相互影响来实现的。血管内皮细胞覆盖于血管内表面，当进行体外循环加压灌注时，高灌注压力下产生的血流高剪切力将直接作用于血管内皮细胞。一项关于DNA微阵列的分析中发现，内皮细胞中3%的基因表达受剪切力影响[23-24]。
当血流动力转化的剪切力对血管内皮细胞产生刺激后，启动一系列信号级联反应，发生力学刺激信号与细胞内化学信号转化，同时分泌多种细胞因子影响血管平滑肌细胞的生理功能，在这一过程中有许多信号分子参与调控，包括一氧化氮这样的小分子，也包括内皮素1这样的大分子，最新研究发现microRNA也参与介导力学刺激转化细胞内化学信号[25-27]。
3.4 一氧化氮、白细胞介素8、内皮素1参与调控血管平滑肌细胞的生理功能白细胞介素8在炎症发生发展过程中及动脉粥样硬化的进展中发挥重要作用，研究发现，血流动力学中流体剪切力影响白细胞介素8的基因表达。高剪切力可以降低血管收缩因子、炎性递质的表达，因此较大的剪切力将抑制白细胞介素8表达[28]。研究表明，剪切力能够激活内皮型一氧化氮合酶，上调一氧化氮表达，一氧化氮可以激活鸟苷酸环化酶，此酶的增加可以促使细胞产生更多环磷鸟苷，而环磷鸟苷能够激活细胞内的蛋白激酶，通过调控离子通道起到舒张平滑肌细胞与调控细胞凋亡的作用[29]。内皮素1具有收缩血管的活性，血管内膜通透性增加可引起内膜结构或者形态改变，此过程会使细胞间通道打开；血管平滑肌细胞作为内皮素1作用的主要靶细胞，同样可以通过调节细胞内外的架构来调节由平滑肌调控的血管张力，而且血管内皮细胞的损伤是由内皮素1调控血管通透性实现的[30]。
3.5 体外循环加压灌注技术改善微循环的生理学机制此次研究中体外循环加压灌注技术是通过高于正常动脉压2倍的压力灌注病变肢体，较高的灌注压可使血管中血流量得到增加，流体动力学来讲，血液在血管中流动时会对血管壁产生压力，此压力经过力学分解，可分解为与血管壁平行的摩擦力和与血管壁垂直的压力[31-32]。平行血管壁的摩擦力便是流体力学中的剪切力，高灌注压将转变为血液流动的剪切力，剪切力对于血管内皮细胞及平滑肌细胞存在相关性，剪切力作为力学刺激信号启动复杂的力学与化学信号转导过程，较高的剪切力将力学信号传递至血管内皮细胞，通过激活内皮型一氧化氮合酶形成具有扩张血管作用的一氧化氮，最终通过调控离子通道来舒张平滑肌细胞；高剪切力可以下调内皮细胞分泌内皮素1，减少血管收缩的同时降低平滑肌细胞增殖[33]。另外体外循环加压灌注过程中形成的血管高切应力通过诱导血管内皮细胞发生迁移，从而来调控血管的新生，VEGF在血管再生的微观调控中起着非常重要的作用，在VEGF信号通路研究中发现，VEGF/VEGFR2信号通路是血管内皮生长因子信号通路中的主要通路，VEGFR2下游通路蛋白例如Paxillin可作用于内皮细胞迁移，介导内皮细胞的病理生理过程，对血管再生有着重要意义，后续可开展相关研究[34]。
此次研究从血流动力学角度揭示了机械力学刺激作用于血管内皮细胞，使血管内皮细胞发生迁移、形成新的管腔来对血管再生产生调控作用，此过程涉及力学刺激信号与血管舒张因子和收缩因子之间的偶联作用，最终通过这些血管活性物质对血管功能起到调节作用，为体外循环加压灌注技术对于微循环重建的机制提供了理论基础。另外该技术对缺血病变的肢体进行灌注，存在再灌注损伤，目前普遍认为缺血再灌注后氧自由基的大量生成在缺血-再灌注损伤中起到关键作用，作者团队曾应用中药脉络宁注射液作为灌注液加入灌注系统，来清除氧自由基、增加组织超氧化物歧酶活性、减轻骨骼肌组织缺血再灌注损伤，保护内皮细胞，后续将进一步开展相关研究[13]。随着研究深入，作者发现剪切力刺激将力学信号转变为化学信号，除了信号分子一氧化氮以及细胞因子等大分子物质，microRNA也参与介导了这一过程。因此后续研究将依此方向展开，同时需要对携带不同microRNA发挥传递信号的外泌体系统进行研究[35]。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

体外循环加压灌注重建肢体微循环的力学与化学信号传导机制

Extracorporeal circulation compression perfusion in the reconstruction of limb microcirculation from the mechanism of mechanical and chemical signal transduction

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