基础研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2024. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2024-01-28; 32(1): 58-70
在线出版日期: 2024-01-28. doi: 10.11569/wcjd.v32.i1.58
螺杆菌属细菌致病基因系统进化分析
徐乐, 刘兴, 吴琦, 华召来, 杨菲, 张军峰
徐乐, 张军峰, 南京中医药大学医学院 江苏省南京市 210023
徐乐, 在读研究生, 研究方向为消化道癌前病变的发生机制.
刘兴, 杨菲, 南京师范大学生命科学学院 江苏省南京市 210023
吴琦, 中国科学院微生物研究所 北京市 100101
华召来, 扬中市人民医院肿瘤防治研究所 江苏省镇江市 212299
ORCID number: 张军峰 (0000-0001-5132-3975).
基金项目: 国家自然科学基金, No. 82274369; 江苏省中医药科技发展计划项目, No. MS2021003.
作者贡献分布: 张军峰提出研究思路; 徐乐、刘兴和杨菲共同完成数据分析; 吴琦指导数据分析; 徐乐撰写论文稿件; 张军峰和华召来指导论文修改.
通讯作者: 张军峰, 教授, 210023, 江苏省南京市栖霞区仙林大道138号, 南京中医药大学医学院. zhangjunfeng419@njucm.edu.cn
收稿日期: 2023-11-14
修回日期: 2023-12-01
接受日期: 2024-01-11
在线出版日期: 2024-01-28

背景

螺杆菌属(Helicobacter)与多种消化道疾病相关, 除幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)外, 多种非H. pylori螺杆菌属细菌(non-Helicobacter pylori Helicobacters, NHPH)也从多种动物宿主的肝脏、肠道和胆囊中分离出来, 作为潜在的人畜共患病病原体, 其感染和致病机制尚不清楚.

目的

基于H. pylori致病基因探讨螺杆菌属细菌的系统进化关系.

方法

调取12株H. pylori和38株NHPH的基因组, 基于16S rRNA、鞭毛、尿素酶以及毒力因子基因, 利用MAGA 11软件进行序列比对并构建系统进化树.

结果

基于16S rRNA基因的系统进化分析结果显示, 胃内螺杆菌(Gastric Helicobacter, GH)和肝肠螺杆菌(Enterohepatic Helicobacter Species, EHS)聚集为2个大支, GH宿主均为哺乳动物, 而EHS宿主多为禽类和哺乳动物. 基于细菌鞭毛动力相关基因(flaA、flaB、fliP、fliQ、fliR、fliG、fliM、fliN)的系统进化分析支持基于16S rRNA基因所得到的系统发育关系, 基于脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)合成相关基因(lptA, waaC和waaF)的系统进化关系也具有类似的规律. 尿素酶基因存在于12株H. pylori和13株胃内NHPH中, 仅在4株EHS(H. hepaticus、H. muridarum、H. bilis、H. anseris)中存在, 但7个尿素酶基因的系统进化树未见明显一致性规律.

结论

螺杆菌属细菌的系统进化受到胃和肝肠定植部位的显著影响.

关键词: 螺杆菌属; 16S rRNA; 致病基因; 进化分析

核心提要: 基于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)致病基因, 本文分析了12株H. pylori和38株非H. pylori螺杆菌属细菌的系统进化关系, 发现胃和肝肠生态位是系统进化的主要驱动力, 为深入研究非H. pylori螺杆菌属细菌的进化与感染机制提供了系统发生证据.
引文著录: 徐乐, 刘兴, 吴琦, 华召来, 杨菲, 张军峰. 螺杆菌属细菌致病基因系统进化分析. 世界华人消化杂志 2024; 32(1): 58-70
Phylogenetic analysis of pathogenic genes in Helicobacter species
Le Xu, Xing Liu, Qi Wu, Zhao-Lai Hua, Fei Yang, Jun-Feng Zhang
Le Xu, Jun-Feng Zhang, School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
Xing Liu, Fei Yang, School of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
Qi Wu, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
Zhao-Lai Hua, Institute of Tumor Prevention and Control, People's Hospital of Yangzhong City, Zhenjiang 212299, Jiangsu Province, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 82274369; Chinese Medicine Science and Technology Program of Jiangsu Province, No. MS2021003.
Corresponding author: Jun-Feng Zhang, Professor, School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, No. 138 Xianlin Avenue, Qixia District, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China. zhangjunfeng419@njucm.edu.cn
Received: November 14, 2023
Revised: December 1, 2023
Accepted: January 11, 2024
Published online: January 28, 2024

BACKGROUND

Helicobacter bacteria are associated with gastrointestinal diseases, especially Helicobacter pylori (H. pylori). With the isolation of many non-Helicobacter pylori Helicobacters (NHPH) from the liver, intestines, and gallbladder of natural animal reservoirs, NHPH have been potential zoonotic pathogens, but their infection and pathogenic mechanisms are still unclear.

AIM

To explore the phylogenetic relationship of Helicobacter species based on their pathogenic genes.

METHODS

The present study collected the genomic sequences of 50 strains in genus Helicobacter, including 12 strains of H. pylori and 38 strains of NHPH. Based on 16S rRNA gene and several pathogenic genes (flagella, urease, and virulence factors), MAGA software (Version 11.0) was used to align their sequences and construct phylogenetic trees.

RESULTS

The phylogenetic tree of 16S rRNA gene showed that gastric Helicobacter (GH) and enterohepatic Helicobacter species (EHS) were clustered into two large branches, respectively. All of the GH's hosts were mammals, while the hosts of EHS were many wild poultry and mammals. Based on the flagella motility-related genes (flaA, flaB, fliP, fliQ, fliR, fliG, fliM, and fliN), the phylogenetic trees were divided into two major branches (GH and EHS). Similarly, the phylogenetic trees of lipopolysaccharide (LPS) biosynthesis-related genes (lptA, waaC, and waaF) presented two major branches (GH and EHS), too. The urease genes existed in all of the 12 strains of H. pylori, 13 strains of gastric NHPH, and 4 strains of EHS (H. hepaticus, H. muridarum, H. bilis, and H. anseris). However, no significant phylogenetic patterns of GH and EHS were observed in the seven urease genes (ureA, ureB, ureE, ureF, ureG, ureH, and ureI).

CONCLUSION

The phylogenetic relationship of Helicobacter species' pathogenic genes is dominated distinctly by the special colonization areas including gastric and enterohepatic niches.

Key Words: Helicobacter species; 16S rRNA; Pathogenicity genes; Phylogenetic analysis
0 引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)的发现结束了胃内无菌论, 非培养依赖的分子生物学检测技术发现胃内存在大量非H. pylori细菌, 如拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)等[1]. 研究证实, 包括H. pylori在内的螺杆菌属是胃内优势菌属(相对丰度可大于50%), 不仅参与胃黏膜病变的发生发展, 而且深刻影响胃菌群的结构与共生关系[2]. 最新研究发现, 慢性萎缩性胃炎患者感染携毒力因子H. pylori的比例显著高于非萎缩性胃炎, 且胃内菌群多样性降低[3], 在H. pylori阴性患者胃内也能检测到螺杆菌属细菌[4], 提示非H. pylori螺杆菌属细菌(non-Helicobacter pylori Helicobacters, NHPH)可能是胃黏膜病变的新病原体, 其详细机制尚不清楚.

最先发现的NHPH是从雪貂胃内分离出的H. mustelae, 后又从猫、狗胃内分离得到H. felis, 从赤狐胃内分离得H. labacensis、H.mehlei、H. vulpis[5]. 除定植于胃部, 在某些动物的肝脏、肠道和胆囊也能发现螺杆菌属的存在, 如H. hepaticus和H. marmot. 目前已鉴定出的NHPH有47种, 根据寄居部位分为胃内螺杆菌(Gastric Helicobacter, GH)和肝肠螺杆菌(enterohepatic Helicobacter species, EHS), 多呈隐性感染, 参与消化系统疾病的发生发展[6]. 作为螺杆菌属的代表性菌株, H. pylori感染全球约50%的成年人群, 可导致慢性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生甚至胃癌[7], H. pylori感染者罹患胃癌的风险可增加约2-8倍[8]. 动物实验显示, 多种NHPH与消化系统疾病相关, H. hepaticus灌胃BALB/c小鼠可诱导肝脏纤维化和癌前病变[9], H. bilis可诱导小鼠炎症性肠病[10], H. suis与猪胃炎和胃溃疡有关[11]. 这些结果提示, NHPH感染参与胃、肠、肝等消化器官病变.

H. pylori感染致病过程大致分为四个阶段: (1)对胃黏膜酸性环境的适应; (2)利用鞭毛向上皮细胞移动; (3)上皮细胞屏障的穿透与特定受体的附着; (4)毒素的释放及细胞毒性作用[12]. 尿素酶是辅助H. pylori定植的关键因子, 由尿素酶基因簇编码. 在生理pH水平下, 尿素酶阴性的H. pylori突变株丧失胃黏膜定植能力, 而尿素酶阳性的H. pylori可水解尿素, 释放氨升高胃内pH值[13]. H. pylori鞭毛作为动力提供器官, 能保护细菌免受胃部酸性环境的侵袭, 使致病菌能够迁移到黏膜上皮, 鞭毛基因(flaA和flaB)突变则会降低H. pylori的运动和定植能力[12]. 组成细菌鞭毛的几种鞭毛蛋白, 如HpA、FlaA或FlaB, 可能在感染后引起体液免疫并刺激特异性抗体反应[14]. 而在成功定植后, H. pylori会释放毒素和侵袭因子, 主要包括血型抗原结合黏附素(blood group antigen-binding adhesion, BabA)、唾液酸结合黏附素(sialic acid-binding adhesin, SabA)、黏附相关脂蛋白(adherence-associated lipoprotein, AlpA/B)、CagA、空泡细胞毒素相关蛋白(vacuolating cytotoxin, VacA)等, 其中CagA和VacA能够利用IV型分泌系统进入上皮细胞[12], 参与诱导胃黏膜上皮损伤和持续性炎症, 促进胃癌发生[15]. 因此, H. pylori致病机制为揭示NHPH致病性提供了参考依据.

螺杆菌属与人类共存数万年或更久, 为适应不同的环境, 基因组呈现高度异质性和多样性, 在不同人群和地域间存在显著差异. 为了探索螺杆菌属细菌的感染与进化机制, 本研究调取了50株细菌的基因组, 基于16S rRNA基因、鞭毛基因、尿素酶基因、脂多糖合成相关基因, 构建系统进化树, 为更好理解螺杆菌属致病潜能提供依据.

1 材料和方法
1.1 材料

1.1.1 螺杆菌属菌株筛选: Genus(https://lpsn.dsmz.de/genus)网站查找螺杆菌属成员, 根据目前已发表的文献, 确定各螺杆菌的标准株、宿主、寄居部位和致病性, 每种NHPH优先选择标准菌株作为研究对象, 如果无标准株, 则随机选择1个基因组完整的非标准株. H. pylori菌株数量很多, 本研究以毒力因子CagA/VacA基因携带状态为标准, 选择CagA+/VacA+、CagA+/VacA-、CagA-/VacA+、CagA-/VacA-的H. pylori各3株, 作为H. pylori代表菌株.

1.1.2 螺杆菌属菌株基因序列提取: 美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)Assembly(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载螺杆菌属菌株基因组数据, 包括核酸序列信息文件(fasta nucleic acid file, fna)、基因对应蛋白质序列信息文件(fasta Amino Acid file, faa)和基因组注释文件(general feature format, gff). 在Gene数据库中检索螺杆菌完整16S rRNA序列, 以完整序列作为参照序列, 在TBtools(version 1.098745)软件或NCBI的 Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具中进行相似性检索, 调取其他菌株16S rRNA基因序列信息, 根据位点信息和匹配度, 选择匹配度较高的序列进行系统进化分析. 基于H. pylori致病机制, 选择尿素酶、鞭毛、黏附素和毒力因子等常见致病物质基因进行分析, 观察这些基因在螺杆菌属细菌基因组中的分布, 在核酸序列信息fna文件中调取相应基因序列, 以调取到的完整序列进行系统进化分析.

1.2 方法

1.2.1 基因序列比对: 将调取到的16S rRNA和致病物质基因序列导入MAGA软件(https://www.megasoftware.net/)进行序列比对, 核对修正, 去掉首尾两端不规则冗余序列, 筛选标准: (1)菌株名称一致; (2)序列连续性较好, 缺口(gap)≤5; (3)序列长度大于原始序列1/3. 选择符合标准的基因序列, 进行系统进化分析.

1.2.2 系统进化分析: 序列比对完成后采用邻接法(neighbor-joining method, NJ)或最大似然法(maximum likelihood method, ML)在MAGA软件中进行构树, 进化树采用重复抽样分析(Bootstrap Analysis)1000次的方法检验各分支的置信度, 利用Figtree(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)软件对进化树进行优化调整.

2 结果
2.1 螺杆菌属细菌基因组信息

首先, 在NCBI Assembly数据库查询"Helicobacter pylori", 共得3385株H. pylori基因组信息, 根据毒力因子CagA/VacA基因的4种携带状态, 每种状态选择3个菌株, 其中, CagA+/VacA+携带状态H. pylori菌株为FDAARGOS_298、ATCC 43504和NCTC 11637, CagA+/VacA-携带状态H. pylori菌株为83、J99和MT5135, CagA-/VacA+携带状态H. pylori菌株为B659-C2、280-A-EK1和HUP-B14, CagA-/VacA-携带状态H. pylori菌株为HP14039、LIM-008和HPY. 其次, 查阅文献获得38株正式命名的NHPH, 其中4株(H. nemestrinae、H. westmeadii、H. suncus、H. apri)缺失基因组信息. 最后, 本研究纳入50个螺杆菌属菌株作为研究对象, 表1展示了菌株名称、宿主、致病性、基因组编号等信息.

表1 螺杆菌属菌株基本信息.
菌种宿主寄生部位致病性菌株基因组编号
H. pylori[16]人, 猴, 猫, 狗, 猪, 鼠胃慢性胃炎, 消化性溃疡, 胃淋巴瘤, 胃癌FDAARGOS_298GCF_003050665.1
ATCC 43504GCF_004295525.1
NCTC 11637GCF_900478295.1
B659-C2GCF_003639215.1
280-A-EK1GCF_006337465.1
HUP-B14GCF_000259235.1
83GCF_000213135.1
J99GCF_000008785.1
MT5135GCF_017821535.1
HP14039GCF_003636855.2
LIM-008GCF_016748795.1
HPYGCF_013122115.1
H. mustelae[16]雪貂胃慢性胃炎NCTC12198GCF_900476215.1
H. felis[17]猫, 狗胃慢性胃炎, 胃癌ATCC 49179GCF_000200595.1
H. nemestrinae[18]猴胃NRNRNR
H. cinaedi[19]人, 猫, 狗, 仓鼠肠道急性腹泻, 菌血症DSM 5359GCF_017979495.1
H. fennelliae[19]人, 狗肠道肠炎, 菌血症NCTC11613GCF_900451005.1
H. muridarum[20]鼠胃, 肠道胃炎NCTC12714GCF_900450885.1
H. acinonychis[21]豹胃胃炎NCTC12686GCF_900461455.1
H. canis[22]人, 猫, 狗肝脏, 肠道腹泻, 肝炎CCUG 32756TGCF_008693005.1
H. hepaticus[23]鼠肝肠, 肠道肝炎, 肝癌, 炎症性肠病ATCC 51449GCF_000007905.1
H. pametensis[24]鸟, 猫, 猪肠道NRATCC 51478GCF_000518225.1
H. pullorum[25]人, 鸡肝脏, 肠道胃肠炎, 慢性肝炎CCUG 33837GCF_017979475.1
H. bilis[26]猫, 狗, 人肝脏, 肠道慢性肝炎ATCC 51630GCF_000765785.2
H. bizzozeronii[27]猫, 狗, 鼠胃胃炎CCUG 35545GCA_000263275.1
H. trogontum[28]鼠肠道NRATCC 700114GCF_000765905.2
H. cholecystus[29]仓鼠胆囊胰腺炎, 胆管炎, 肝炎ATCC 700242GCF_003364215.1
H. salomonis[30]猫, 狗胃NRCIP 105607GCF_017979425.1
H. rodentium[31]鼠肠道腹泻ATCC 700285GCF_000687535.1
H. westmeadii[32]人肝脏, 肠道NRNRNR
H. suncus[33]麝胃慢性胃炎NRNR
H. typhlonius[34]鼠肠道盲肠炎MIT 98-6810GCF_000765765.2
H. canadensis[35]人, 鹅肝脏, 肠道腹泻NCTC13221GCF_900450815.1
H. ganmani[36]鼠肝脏, 肠道NRMIT 99-5101GCF_003364315.1
H. winghamensis[37]人肠道腹泻, 胃肠炎2015D-0170GCF_014931175.1
H. cetorum[38]海豚, 鲸鱼胃胃溃疡, 胃炎MIT 99-5656GCF_000259275.1
H. marmotae[39]猫, 土拨鼠肝脏, 肠道肝癌MIT 98-6070GCF_003364255.1
H. cynogastricus[40]狗胃NRNRGCF_900197855.1
H. anseris[41]鹅肠道NRMIT 04-9362GCF_003364335.1
H. brantae[41]鹅肠道NRMIT 04-9366GCF_003364205.1
H. equorum[42]马肠道NRMIT 12-6600GCF_003364175.1
H. suis[43]猴,猪胃食管及胃部炎症, 胃溃疡DSM 19735GCF_017979375.1
H. baculiformis[44]猫,狗胃NRNRGCF_900197685.1
H. heilmannii[45]人, 猫, 狗, 猪胃胃炎, 胃溃疡LMG 26292GCF_017979395.1
H. ailurogastricus[46]猫,狗胃胃炎, 胃溃疡NRGCF_900197675.1
H. jaachi[47]猴胃,肝脏,肠道肝炎, 胆囊炎, 肠炎MIT 09-6949GCF_000763135.2
H. apri[48]野猪胃, 肝脏, 肠道NRNRNR
H. mehlei[49]赤狐胃NRL8bGCF_007280785.1
H. labacensis[49]赤狐胃NRL9GCF_003660285.1
H. vulpis[49]赤狐胃NRL2GCF_003660395.1
NR: 无记录.
2.2 螺杆菌属细菌16S rRNA基因系统进化分析

NCBI Gene数据库中, H. pylori和6株NHPH(H. felis、H. cinaedi、H. pullorum、H. bilis、H. bizzozeronii、H. suis)具有完整的16S rRNA序列, 作为参照序列进行序列调取. H. nemestrinae、H. westmeadii、H. suncus、H. apri缺失基因组信息, H. fennelliae和H. salomonis的16S rRNA基因序列长度少于参照序列的1/3, 均不纳入分析, 最后共获得44株螺杆菌属菌株的16S rRNA基因序列信息, 利用NJ法构建系统进化树(图1). 结果显示, 进化树分为两个大支, 第Ⅰ支24株螺杆菌的寄生部位均为胃, 宿主集中在猫、鼠、狗、人等哺乳动物; 除H. mustelae寄生在胃内, 第Ⅱ支19株螺杆菌的寄生部位为肝、肠和胆囊, 宿主不仅包括哺乳动物, 也包括鸡、鹅、鸟等禽类. 在第Ⅰ支的24个菌株中, 12个H. pylori菌株紧密聚集形成单系分支, 与2个NHPH菌株(H. acinonychis、H. cetorum)聚成一簇, 属间亲缘关系较近; 其他10株胃内NHPH构成一个独立的大支系. 第Ⅱ支的20个菌株未发现显著的聚群. 结果提示, 寄生部位(胃和肝肠)是螺杆菌属菌株系统进化中最重要的影响因素.

图1
图1 螺杆菌属基于16S rRNA序列利用邻接法构建的系统进化树. 红色区域: 胃内螺杆菌; 蓝色区域: 肝肠螺杆菌.
2.3 螺杆菌属细菌致病物质基因系统进化分析

2.3.1 螺杆菌属细菌致病物质基因分布情况: 以H. pylori为例, 致病物质主要包括侵袭因子和毒素, 本研究检索了35个致病基因在螺杆菌属菌株中的分布状态(表2). 其中, 尿素酶基因存在于12株H. pylori和20株NHPH, 鞭毛基因存在全部的44个菌株, 脂多糖合成相关基因分布于12株H. pylori和30株NHPH; 然而, AlpA/B、BabA、SabA、OipA、HopE等黏附因子以及毒力因子CagA仅存在于H. pylori, VacA还存在于H. bizzozeronii, 黏膜接触诱导因子(induced by contact with epithelium, iceA)存在于H. pylori菌株和H. bilis. 结果提示, NHPH具有一定的致病性, 但大多数缺少完整的毒力因子基因, 致病性较弱.

表2 螺杆菌属致病物质基因在螺杆菌属细菌基因组中的分布.
菌种菌株侵袭因子
毒素
UreaseFlagellinAlpA/BBabASabAOipAHopELPSCagAVacAIceA
H. pyloriFDAARGOS_298+++++++++++
ATCC 43504+++++++++++
NCTC 11637+++++++++++
B659-C2+++---++-++
280-A-EK1++++--++-+-
HUP-B14++++-+++-+-
83++-----++-+
J99+++++++++-+
MT5135++----+++-+
HP14039+++-+-++---
LIM-008++----++---
HPY+++-++++--+
H. acinonychisNCTC12686++-----+---
H. cetorumMIT 99-5656++-----+---
H. suisDSM 19735++-----+---
H. labacensisL9++-----+---
H. bizzozeroniiCCUG 35545++-------+-
H. cynogastricusNR++-----+---
H. felisATCC 49179++-----+---
H. heilmanniiLMG 26292++-----+---
H. baculiformisNR++-----+---
H. vulpisL2++-----+---
H. ailurogastricusNR++-----+---
H. mehleiL8b++-----+---
H. canadensisNCTC13221-+-----+---
H. equorumMIT 12-6600-+-----+---
H. pullorumCCUG 33837-+---------
H. winghamensis2015D-0170-+-----+---
H. rodentiumATCC 700285-+-----+---
H. ganmaniMIT 99-5101-+-----+---
H. cholecystusATCC 700242-+-----+---
H. brantaeMIT 04-9366-+-----+---
H. pametensisATCC 51478-+-----+---
H. mustelaeNCTC12198-+-----+---
H. anserisMIT 04-9362++-----+---
H. jaachiMIT 09-6949++-----+---
H. marmotaeMIT 98-6070++-----+---
H. cinaediDSM 5359++-----+---
H. bilisATCC 51630-+-----+--+
H. canisCCUG 32756++-----+---
H. trogontumATCC 700114-+-----+---
H. hepaticusATCC 51449++-----+---
H. muridarumNCTC12714++-----+---
H. typhloniusMIT 98-6810++-----+---
对于基因在基因组中的分布状态, +: 存在该基因序列, -: 不存在该基因序列.

2.3.2 螺杆菌属细菌鞭毛基因系统进化分析: 细菌鞭毛作为动力器官, 可分为丝状体、钩状体和基体三部分. 其中, 丝状体由flaA和flaB基因编码的鞭毛结构蛋白多聚体FlaA、FlaB组成[13]; FlgE是鞭毛钩状体的主要蛋白, FlgE突变则菌株失去动力[50]; 基体又称为细菌鞭毛马达, 为鞭毛提供动力, 由外膜环(L ring)、周质环(P ring)、内膜环(MS ring)、胞质环(C ring)、联动杆(rod)及分泌装置(export apparatus)组成[51]. 选择完整的基因序列进行系统进化分析, NJ法或ML法构建系统进化树(图2).

图2
图2 螺杆菌属细菌鞭毛相关基因系统进化分析. 红色区域: 胃内螺杆菌; 蓝色区域: 肝肠螺杆菌.

首先, 鞭毛丝状体基因分析显示, 基于28个菌株的flaA基因系统进化树分为2个大支, 第Ⅰ支主要由12株H. pylori和8株胃内NHPH(H. acinonychis、H. cetorum、H. labacensis、H. vulpis、H. baculiformis、H. cynogastricus、H. felis、H. ailurogastricus)构成, 而肝肠螺杆菌H. cholecystus位于此支基部; 第Ⅱ支包含的7个菌株(H. hepaticus、H. typhlonius、H. cinaedi、H. jaachi、H. marmotae、H. equorum、H. winghamensis)寄生部位均为肝肠, 未发现显著聚群. 类似的, 基于33个菌株的flaB基因系统进化树也包括2个大支, 第Ⅰ支包括12株H. pylori和10株胃内NHPH(H. acinonychis、H. cetorum、H. bizzozeronii、H. mehlei、H. ailurogastricus、H. cynogastricus、H. felis、H. labacensis、H. baculiformis、H. vulpis); 第Ⅱ支主要由12株肝肠螺杆菌(H. jaachi、H. cinaedi、H. typhlonius、H. hepaticus、H. marmotae、H. canis、H. winghamensis、H. anseris、H. brantae、H. pametensis、H. bilis、H. trogontum)和胃内螺杆菌H. mustelae组成, 提示H. mustelae可能在胃和肝肠均可寄生.

其次, 鞭毛钩状体基因分析显示, 基于38个菌株的flgE基因系统树分为2个大支, 5株肝肠螺杆菌(H. winghamensis、H. canadensis、H. pullorum、H. rodentium、H. ganmani)聚为1支, 12株H. pylori、12株胃内NHPH(H. acinonychis、H. cetorum、H. heilmannii、H. ailurogastricus、H. suis、H. bizzozeronii、H. mehlei、H. cynogastricus、H. felis、H. baculiformis、H. labacensis、H. vulpis)和其他9株肝肠螺杆菌(H. bilis、H. trogontum、H. muridarum、H. equorum、H. marmotae、H. jaachi、H. cinaedi、H. hepaticus、H. typhlonius)聚为另一大支, 提示鞭毛钩状体基因的系统进化与寄生部位关系不确定.

最后, 鞭毛马达的组装受到精确的控制, 先合成装配MS环和C环, 其次合成装配分泌装置, 再合成装置联动杆, 最后合成装配P环和L环[51], 本研究分析了鞭毛马达13个基因的系统进化关系. MS环由蛋白FliF组装, 基于34个菌株的fliF基因系统进化树包括2个大支, 6支肝肠螺杆菌(H. bilis、H. trogontum、H. typhlonius、H. hepaticus、H. jaachi、H. cinaedi)单独聚为一个大支, 12株H. pylori、11株胃内NHPH和5株肝肠螺杆菌杂聚为另一大支. C环是鞭毛马达的旋转复合体, 控制旋转方向, 由蛋白质FliG, FliM和FliN组成, 基于这3个基因的系统进化树显著受到寄生部位的影响, 譬如, 基于35个菌株的fliG基因系统进化树分为2个大支, 第Ⅰ支包括12株H. pylori和11株胃内NHPH(H. acinonychis、H. cetorum、H. suis、H. bizzozeronii、H. mehlei、H. ailurogastricus、H. cynogastricus、H. felis、H. baculiformis、H. labacensis、H. vulpis); 第Ⅱ支中, 除胃内螺杆菌H. mustelae外, 其他11株均为肝肠螺杆菌(H. bilis、H. trogontum、H. winghamensis、H. ganmani、H. pullorum、H. equorum、H. jaachi、H. cinaedi、H. marmotae、H. typhlonius、H. hepaticus). 类似的, 分泌装置由蛋白质FliP、FliQ和FliR构成, 基于这3个基因的系统进化树显著受到寄生部位的影响, H. pylori菌株和胃内NHPH聚为一个大支, 肝肠螺杆菌聚为另一大支. 联动杆由蛋白质FliE, FlgB, FlgC, FlgF和FlgG组装, 其中flgF基因在NCBI gene数据库无完整序列作为参照序列, 不进行系统进化分析. 基于flgC基因构建的系统进化树显著受到寄生部位的影响, 而fliE、flgB、flgG基因进化关系较为杂乱. 同时, 外膜L环和周质P环相关基因flgH和flgI的系统进化也未发现明显规律. 结果提示, 鞭毛动力和方向控制相关基因的系统进化受到寄生部位的显著影响.

2.3.3 螺杆菌属细菌脂多糖合成相关基因系统进化分析: 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革兰阴性菌的细胞壁成分, 又称内毒素, 由类脂A、核心多糖和O-抗原组成[52]. LPS合成过程中, 涉及数十种基因, 本研究在NCBI gene数据库查阅到完整序列的基因有3个, 包括脂多糖庚糖基转移酶Ⅰ(lipopolysaccharide heptosyltransferase Ⅰ, Hep Ⅰ)、脂多糖庚糖基转移酶Ⅱ(lipopolysaccharide heptosyltransferase Ⅱ, Hep Ⅱ)和脂多糖转运蛋白A(lipopolysaccharide transport periplasmic protein A, LptA). Hep Ⅰ由waaC基因编码, Hep Ⅱ则由waaF基因编码, 庚糖转移酶参与核心多糖的形成, 负责将庚糖添加到核心多糖[52]. 脂多糖转运蛋白A 由lptA基因编码, 负责将胞内装配完整的LPS运输到外膜, 从而发挥抗原特性[53]. 基于26个菌株的lptA基因系统进化分析显示, 12株H. pylori与6株胃内NHPH(H. cetorum、H. suis、H. bizzozeronii、H. mehlei、H. cynogastricus、H. felis)以及4株肝肠螺杆菌(H. marmotae、H. cinaedi、H. jaachi、H. hepaticus)共同构成第Ⅰ大支, 4株肝肠螺杆菌(H. pullorum、H. winghamensis、H. bilis、H. trogontum)聚为第Ⅱ大支; 基于waaC和waaF基因构建的系统进化树中, 肝肠螺杆菌均单独聚为一支(图3). 结果提示, LPS合成相关基因的系统进化关系同样受到寄生部位(胃、肝肠)的影响.

图3
图3 螺杆菌属细菌脂多糖合成相关基因系统进化分析.

2.3.4 螺杆菌属细菌尿素酶基因系统进化分析: H. pylori尿素酶基因簇由结构基因ureA、ureB和5个辅助基因(ureE、ureF、ureG、ureH、ureI)构成[54]. 系统进化分析显示, 仅1株EHS(H. hepaticus)同时具有完整的ureA、ureB、ureG基因序列, 另外3株EHS(H. muridarum、H. bilis、H. anseris)只具有完整的ureA基因序列. GH具有较为完整的尿素酶基因簇, 系统进化树未见明确的规律(图4). 结果提示, 在螺杆菌属系统进化中, 尿素酶基因对GH是必需的, 对EHS是非必需的.

图4
图4 螺杆菌属细菌尿素酶基因进化分析.
3 讨论

螺杆菌属细菌高度多样且深度分化, 广泛定植于多种宿主体内, 根据寄生部位分为GH和EHS. 越来越多的证据显示, 作为新兴的人类病原体和潜在的人畜共患病病原体, 螺杆菌属与人类急性胃肠炎、炎症性肠病、慢性肝胆疾病的发生发展相关, 因此, 阐明螺杆菌属细菌的宿主及传播途径是控制此类细菌感染的关键[6]. Mannion等[55]对100多个GH和EHS菌株的基因组进行了系统进化分析, 发现GH和EHS基因组之间生理和毒力相关基因具有显著异质性, EHS表现为非糖酵解依赖特性, 更多依赖氨基酸/有机酸进行能量代谢; GH缺乏蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成途径, 依赖于环境摄取途径; 代谢功能预测结果表明, GH和EHS的进化主要是为了适应营养丰富的胃和营养缺乏的肝肠; 毒力因子基因图谱分析发现, GH和EHS可能利用不同的致病机制感染宿主并诱导炎症和组织损伤. Haque等[56]分析了13种螺杆菌属细菌的脂肪酸谱, 结果发现, GH的脂肪酸以19-碳环丙烷脂肪酸和十四烷酸为主, EHS的脂肪酸则以十六烷酸和十八烯酸为主. 这些结果提示, 胃与肝肠不同营养环境驱动的新陈代谢差异是螺杆菌属细菌系统进化的关键驱动力.

本研究收集了12株H. pylori和38株NHPH的宿主、寄生部位、致病性和基因组, 基于16S rRNA基因的系统进化分析显示, 螺杆菌属细菌的进化树主要根据寄生部位分为两大支, 第Ⅰ支是在哺乳动物胃内寄生的GH, 第Ⅱ支是在哺乳动物和禽类肝肠寄生的EHS. 值得注意的是, 从雪貂胃黏膜中分离出的H. mustelae和EHS亲缘关系更密切, H. mustelae主要定植于雪貂胃部, 但在粪便中也能检测到, 提示H. mustelae具有胃、肠、肝跨器官感染的潜力. 本研究还发现, 鞭毛动力和方向控制相关基因的系统进化也受到胃和肝肠寄生部位的显著影响. Bansil等[57]利用体外实验观察螺杆菌属细菌的运动性, 发现细菌在胃黏液层中的游动速度随着鞭毛数量的增加而增加, 具有双极鞭毛的H. suis的游动机制比单极的H. pylori更复杂; 在没有尿素的情况下, H. pylori在pH<4的猪胃黏蛋白(porcine gastric mucin, PGM)凝胶中无法游动, 鞭毛束空转; 添加尿素后, 尿素水解产生NH3, 升高黏蛋白凝胶的pH值, 促进细菌游动, 提示尿素是H. pylori在酸性胃黏液中游动的关键因素. 本研究发现, 尿素酶基因存在于多数GH中, 仅在4株EHS中表达, 提示尿素酶基因对GH是必需的, 对EHS是非必需的. 动物实验发现, 尿素酶基因敲除的EHS(H. hepaticus 3B1)对盲肠定植水平没有影响, 但诱导肝炎发生的能力下降, 提示尿素酶基因能够增强EHS的致病性[58]. 脂多糖也是革兰阴性螺杆菌的重要致病物质, 糖基转移酶基因是细菌脂多糖合成过程中的关键基因, InterProScan分析显示, GH和EHS拥有不同的糖基转移酶基因, 表明螺杆菌属脂多糖的结构和合成存在显著差异[55]. 本研究发现, 基于糖基转移酶基因(waaC和waaF)构建的系统进化树, EHS均单独聚为一支. 综合以上结果, 决定螺杆菌属细菌系统进化的遗传基础更偏向于生态位(即胃和肝肠), 而不是宿主物种.

胃和近端小肠比远端肠环境的酸性更强, 是食物杀菌与消化吸收的主要部位[59]. 正常状态下, 约85%的碳水化合物、66%-95%的蛋白质和所有脂肪在进入大肠前被吸收[60]. 由于胃和小肠拥有营养丰富的环境, 有研究认为GH可以直接利用环境营养物质, 参与生物合成途径的基因则部分丢失, 形成较小的基因组; EHS的生存环境营养较为匮乏, 需要更大的基因组和更多样化的生物合成途径完成复杂的新陈代谢[55]. 结果提示, H. pylori致病基因在EHS基因组中丢失, 可能是适应肝肠环境新陈代谢的结果. 因此, 毒力较弱的EHS感染致病可能需要依赖其他肠道微生物的协同作用. Whary等[61]发现罗伊氏乳杆菌PTA-6475(L. reuteri PTA-6475)是一种潜在的益生菌, 在体外具有抗炎作用, 然而, 与H. hepaticus共同感染B6.129P2-IL-10tm1Cgn(IL-10-/-)小鼠, 能够显著促进结肠炎的发生. Yang等[62]利用IL-10基因敲除的C67BL/6J小鼠作为感染对象, 发现2种环境(MHH和MIT)饲养的C57BL/6J IL-10-/-小鼠, 对H. hepaticus诱导的盲肠结肠炎具有高度可重复的差异, 提示螺旋杆菌属细菌的易感性差异与肠道菌群相关. 此外, GH仅定植于胃黏膜, 而EHS不仅在肠道中定植, 也能在肝脏和胆囊中定植, 提示EHS可能经历了更为复杂的环境进化压力.

随着越来越多的螺杆菌属细菌被发现, 其感染传播已引起广泛关注. 中国是H. pylori高感染和胃癌的高发区, 总体感染率约为55.8%, 家庭总体感染率为71.2%, 明显高于个体感染率, 感染者是主要的传播源[63]. NHPH宿主多为哺乳动物和禽类, 具有潜在的人畜共患性, 人类与动物的密切接触是螺杆菌属致病的风险因素[6]. 譬如, H. heilmanii最初发现于人类胃黏膜活检, 也广泛分布于猪、猫、狗等宿主, 临床曾发现1例传染源为宠物狗的慢性胃炎H. heilmanii感染患者. H. pullorum最先发现于肉鸡的盲肠及肝脏, 与肉鸡肝炎和肠炎相关, 也能从肠炎患者粪便和菌血症患者血液中分离培养, 提示H. pullorum是一种人畜共患病病原体, 肉鸡是传染源, 传播途径可能与粪便污染、饲养环境暴露、食用未煮熟的鸡肉等相关[64]. 这些结果提示, 螺杆菌属细菌存在跨宿主传播感染的潜力, 但对人类致病性依然不完全清楚.

4 结论

综上, 除某些致病基因(如Ⅳ型分泌系统)在NHPH菌株基因组中分布碎片化而无法进行系统进化分析外, 本研究基于H. pylori致病物质基因对螺杆菌属菌株进行了系统进化分析, 发现胃和肝肠生态位是GH和EHS系统进化的主要驱动力, 为研究NHPH与H. pylori协同进化与感染机制提供了系统发生证据.

文章亮点
实验背景

螺杆菌属与多种消化道疾病相关, 除了幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)外, 现已从多种自然动物宿主体内分离出了38种非H. pylori螺杆菌属细菌(non-Helicobacter pylori Helicobacters, NHPH), 但对NHPH的致病性研究尚不充分.

实验动机

全面分析NHPH细菌的系统进化关系, 为深入研究NHPH的进化与感染机制提供系统发生证据.

实验目标

探讨螺杆菌属细菌的系统进化关系.

实验方法

本研究调取了12株H. pylori和38株NHPH的基因组, 基于16S rRNA、鞭毛、尿素酶以及毒力因子基因, 利用MAGA 11软件进行序列比对并构建系统进化树.

实验结果

基于16S rRNA基因、细菌鞭毛动力相关基因(flaA、flaB、fliP、fliQ、fliR、fliG、fliM、fliN)、脂多糖合成相关基因(lptA, waaC和waaF)的系统进化关系显示, 胃内螺杆菌(Gastric Helicobacter, GH)和肝肠螺杆菌(Enterohepatic Helicobacter Species, EHS)分别聚集为2个大支. GH具有较为完整的尿素酶基因簇, EHS中少见尿素酶基因.

实验结论

寄生部位(胃和肝肠)是螺杆菌属菌株系统进化的主要驱动力.

展望前景

近年来非培养依赖的高通量测序技术证实螺旋杆菌属是胃优势菌群,本研究发现尿素酶基因对GH是必需的, 对EHS是非必需的, 因此, 临床应用不依赖尿素酶活性的分子生物学诊断技术, 有助于深入研究螺杆菌属细菌(特别是NHPH)参与消化系统疾病的致病机制.

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 江苏省

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科学编辑:张砚梁 制作编辑:张砚梁

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