Immunmikroskopischer Nachweis von Majorallergenen in Pollen von Wiesenlieschgras (Phleum pratense L.)

 

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Gräserpollen stellen die wichtigste Quelle von Außenluft-Allergenen dar. Die immunzytochemische Darstellung von Allergenen in Gräserpollen ist immer noch weitgehend unzuverlässig, obwohl einige Einzelarbeiten in diesem Bereich bekannt sind [1] [2] [3] [4]. Der Nachweis von Allergenen in Pollen kann aufgrund der extrem hohen Wasserlöslichkeit der Allergene nur unter strikt wasserfreien Bedingungen gelingen. Daher war unser Ziel, neue Verfahren, vor allem Tieftemperatur-Verfahren, zu entwickeln, die aufgrund einer optimalen Konformationserhaltung des Epitopes die Visualisierung von Allergenen in situ erlauben.

Die Wiesenlieschgraspollen (Allergon, Välinge, Schweden) wurden wasserfrei entweder mit Acrolein-Dampf (Riedel-de-Haën, Seelze) oder mit Mischungen aus Glutaraldehyd (GA; 70 %, EM grade; Polysciences, Warrington, PA., USA) und Paraformaldehyd (PFA; Sigma, St. Louis, Mo., USA) in 2,2-Dimethoxypropan (DMP; Sigma) fixiert. Eine Konzentration von 0,5 % GA + 0,5 % PFA in DMP 24 hr bei Raumtemperatur zeigte die besten Ergebnisse. Zur Lokalisierung der Allergene in Pollen wurden Kryoschnitte, Semidünnschnitte und gefriergebrochene Pollen mit monoklonalen Antikörpern (mAk IG 12 [5] gegen Phl p 1 bzw. mAk Bo 1 [6] gegen Phl p 5) inkubiert. Als sekundäre Antikörper wurden an FITC konjugierte Kaninchen-Anti-Maus-IG (DAKO, Hamburg) oder an Gold gekoppelte Kaninchen-Anti-Maus-IgG/M (Aurion, Wageningen, NL), mit Silberverstärkung verwendet.

Die Methoden zum Allergennachweis umfassten:

indirekte Immunfluoreszenz an Gefrierschnitten für lichtmikroskopische Verfahren, indirekte Immungold-Silber-Markierung an Gefrierschnitten und gefriergebrochenen Pollen für rasterelektronenmikroskopische Verfahren im JSM-6400F und JSM-6300 (JEOL, Tokyo, Japan) mit Sekundärelektronen(SE)- und Rückstreu(RE)-Detektoren, indirekte Immungold-Silber-Markierung an Kunstharz- (Epon, LR-Gold und Lowicryl K4M)Semidünnschnitten für lichtmikroskopische und transmissionselektronenmikroskopische Verfahren.

Für die Rasterelektronenmikroskopie wurden die Pollen nach Entwässerung in aufsteigender Ethanolreihe und Kritisch-Punkt-Trocknung mit einer 10-nm-Goldschicht besputtert. Lichtmikroskopische Untersuchungen am Semidünnschnitt erfolgten sowohl im Durchlicht als auch mit Epipolarisation sowie am Kryoschnitt mit Epifluoreszenz. Die genauen Verfahrensabläufe zeigt Abb. [1].

Im Ergebnis zeigte sich die beste Morphologie nach Fixierung in 0,5 % GA + 0,5 % PFA in DMP-24 hr bei RT. Es wurde keine positive Markierung gefunden bei Fixation mit Acrolein-Dampf und auch nicht bei Fixation mit GA bzw. GA + PFA (in DMP) in Konzentrationen > 0,5 % GA.

Eine detaillierte Analyse der bevorzugten Lokalisationsorte der von uns nachgewiesenen Majorallergene Phl p 1 und Phl p 5 weist auf unterschiedliche Allergenverteilungsmuster hin: Phl p 1 zeigt sich im Bereich der äußeren Anteile der Intine und an der Pollenoberfläche im Porenbereich, während Phl p 5 vorwiegend in der zytoplasmatischen Matrix sowie in Zwischenräumen und Mikrokanälen der Exine erscheint (Abb. [2]).

Auf der Pollenoberfläche war die Phl p 5-Markierung nicht über die ganze Oberfläche gleichmäßig verteilt, sondern zwischen den Inseln des Tectums (spinulose exine) zu finden. Die räumliche Expression von Phl p 5 nach der Immungoldmarkierung weist auf eine „natürliche” Freisetzung der Allergene durch Mikrokanäle der Exine auf die Pollenoberfläche hin.

Bei dieser Studie handelt es sich um

die erste komplexe Studie zum Vergleich verschiedener Fixations-, Einbettungs- und Entwässerungsmethoden und Mikroskopieverfahren zur Darstellung von hochdiffusiblen Allergenen in Gräserpollen die erste Applikation der konventionellen- und Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie zur intrazellulären 3D-Darstellung von Hauptallergenen in Pollen von Phleum pratense L.

Abb. 1Schematische Darstellung der angewendeten Methoden zum Allergennachweis in Pollen.

Abb. 2Immungold-Silber-Markierung von Phl p 5 Majorallergen am Semidünnschnitt. Fixation mit 0,5 % GA + 0,5 % PFA in DMP, LR-Gold-Einbettung bei -25 °C (Bild wurde publiziert: Behrendt et al. Int Arch Allergy Immunol 1997; 113: 69).

Literatur

• 1 Behrendt H, Tomczok J, Sliwa-Tomczok W, Kasche A, Ebner von Eschenbach C, Becker W M, Ring J. Timothy grass (Phleum pratense L.) pollen as allergen carriers and initiators of an allergic response.  Int Arch Allergy Immunol. 1999;  118 414-418
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Dr. rer. nat W Sliwa-Tomczok

KKG Umweltdermatologie und Allergologie GSF/TUM

Biedersteiner Str. 29

80802 München